专利名称：利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法秀I 隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,缩写为C. elegans)为线虫动物门泄管纲动物，作为一种典型模式生物在科研领域被广泛应用。秀丽隐杆线虫通体透明，易于观察形态和行为；生命周期短，培养方便且廉价，易于保存和便于试验操作，秀丽隐杆线虫的实验研究已形成一系列国际标准化与规范化操作。在食物不足如重要营养因子匮乏等不适宜环境条件时，秀丽隐杆线虫会停止正常的生长发育，进入休眠阶段(dauer stage)。进入休眠状态的幼虫与正常发育的秀丽隐杆线虫在行为、形态和生理上存在显著差异，表现为活动行为显著减缓或者静止，停止进食，体型改变为瘦长，体色增黑，表皮(cuticle)增厚，生殖细胞停止分裂等。这种低代谢、保能量的状态，使其能够在恶劣环境条件下的存活时间远远高于秀丽隐杆线虫的正常生命周期寿命(约20天)。地沟油，泛指在社会生活中普遍存在的各类劣质油，如回收的食用油、反复使用的炸油，以及通过过滤、加热、沉淀、分离等方法对城市下水道里的垃圾加工而成的“食用油”。 “地沟油”是一种质量极差、极不卫生的非食用油。一旦食用“地沟油”，它会破坏人们的白血球和消化道黏膜，引起食物中毒，甚至致癌的严重后果。地沟油回流到餐桌的现象在中国普遍存在并在近年被广泛关注，而鉴定地沟油成为难题。目前国内尚未有检测地沟油的统一标准。单凭人的感官，地沟油的色、香、味与普通食用油几乎没有分别。即便是能探明底细的仪器也常常难以辨别真假。见诸报道的地沟油检测方法都存在一定盲区，准确率也有待提高，尚不足以对地沟油进行充分有效的鉴定。常规的通过胆固醇检测鉴定地沟油的方法存在操作复杂，仪器依赖度大，造成鉴定成本高。
本发明目的是为了解决现有地沟油鉴定方法存在灵敏度低、精确度差、操作复杂、 成本高的问题，而提供一种利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法。利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法，具体是按以下步骤完成一、制备培养基采用NaCl、琼脂粉、蛋白胨、O. 8mol/L I. 2mol/L的CaCl2水溶液、O.8mol/L I. 2mol/L的MgSO4水溶液、磷酸盐缓冲液和蒸馏水混合均匀得到培养液，密封后置于高压蒸汽灭菌锅中，并在120°C下灭菌处理15min 25min,然后降温至50°C 60°C，并在无菌环境下加入待检测食用油，再转移至培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥8h 12h，即得到培养基；二、培养向步骤一制备的培养基中均匀涂入浓度为 I X IO9个/mL 2 X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液，然后37°C培养8h 12h，再将接入秀丽隐杆线虫幼虫进行培养46h，在培养24h时秀丽隐杆线虫幼虫发育为秀丽隐杆线虫成虫并产卵；继续培养12h时产卵发育成第二代秀丽隐杆线虫幼虫；再继续培养10h，若第二代秀丽隐杆线虫幼虫进入休眠状态，则待检测食用油不是地沟油；若第二代秀丽隐杆线虫幼虫不进入休眠状态，与正常培养基生长的秀丽隐杆线虫子代无明显差别，则待检测食用油是地沟油；步骤一中所述的培养液中NaCl的浓度为2X 10_3g/mL 3 X 10_3g/mL，琼脂粉的浓度为 15X lCT3g/mL 20X lCT3g/mL,蛋白胨的浓度为 2X lCT3g/mL 3X lCT3g/mL, CaCl2 的浓度为 O. 8 XlO-VmL I X l(T6g/mL，MgSO4 的浓度为 O. 8X l(T6g/mL I X l(T6g/mL ;步骤一中所述的培养液中加入的磷酸盐缓冲液占培养液总体积的20%。 25%。;步骤一中所述加入的待检测食用油与培养液的体积比为(I 10) 1000;步骤二中所述浓度为I X IO9个 /mL 2X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液的涂入量为2mL/cm2 3mL/cm2 ;步骤二中所述的秀丽隐杆线虫幼虫的接种量为5只/cm2 10只/cm2。本发明优点本发明检测方法与传统的利用分析仪器鉴定地沟油的方法相比，弥补了常规胆固醇检测方法5mg/g检出限较高的不足，对特异成分痕量低的高精炼地沟油可以有效鉴定；利用秀丽隐杆线虫休眠状态指标，可以直观高效的甄别食用油的质量优劣； 此外，本发明检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于培训和掌握。一本实施方式是一种利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法，具体是按以下步骤完成一、制备培养基采用NaCl、琼脂粉、蛋白胨、O. 8mol/L I. 2mol/L的CaCl2水溶液、O. 8mol/L I. 2mol/L的MgSO4水溶液、磷酸盐缓冲液和蒸馏水混合均匀得到培养液， 密封后置于高压蒸汽灭菌锅中，并在120°C下灭菌处理15min 25min,然后降温至50°C 60°C，并在无菌环境下加入待检测食用油，再转移至培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥8h 12h，即得到培养基；二、培养向步骤一制备的培养基中均匀涂入浓度为 1109个/1^ 2109个/1^大肠杆菌0卩50菌液，然后37°C培养8h 12h，再将接入秀丽隐杆线虫幼虫进行培养46h，在培养24h时秀丽隐杆线虫幼虫发育为秀丽隐杆线虫成虫并产卵；继续培养12h时产卵发育成第二代秀I 隐杆线虫幼虫；再继续培养IOh,若第二代秀丽隐杆线虫幼虫进入休眠状态，则待检测食用油不是地沟油；若第二代秀丽隐杆线虫幼虫不进入休眠状态，与正常培养基生长的秀丽隐杆线虫子代无明显差别，则待检测食用油是地沟油。本实施方式步骤一中所述的培养液中NaCl的浓度为2X 10_3g/mL 3X 10_3g/mL， 琼脂粉的浓度为15X 10_3g/mL 20X 10_3g/mL，蛋白胨的浓度为2X 10_3g/mL 3X 10_3g/ mL, CaCl2 的浓度为 O. 8X 10 6g/mL IX 10 6g/mL, MgSO4 的浓度为 O. 8X 10 6g/mL I X l(T6g/mL ;本实施方式步骤一中所述的培养液中加入的磷酸盐缓冲液占培养液总体积的 20%。 25%。；步骤一中所述加入的待检测食用油与培养液的体积比为(I 10) 1000。本实施方式步骤二中所述浓度为I X IO9个/mL 2X IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液的涂入量为2mL/cm2 3mL/cm2 ;本实施方式步骤二中所述的秀丽隐杆线虫幼虫的接种量为5只/ cm2 10只/ cm2。地沟油中含有胆固醇及其胆固醇衍生物，而植物油中没用这类具有动物油属性的成分；即使地沟油经过数级精炼，胆固醇及其胆固醇衍生物也会痕量存在。胆固醇是秀丽隐杆线虫繁殖与发育的必需营养，是秀丽隐杆线虫培养基中不可或缺的成分。在不添加胆固醇的培养基中生长的秀丽隐杆线虫，其繁衍的第二代幼虫发育停滞进入休眠状态。而在培养基中添加极微量的胆固醇便，秀丽隐杆线虫繁殖的后代可正常生长发育。本实施方式检测方法与传统的利用分析仪器鉴定地沟油的方法相比，弥补了常规胆固醇检测方法5mg/g检出限较高的不足，对特异成分痕量低的高精炼地沟油可以有效鉴定；利用秀丽隐杆线虫休眠状态指标，可以直观高效的甄别食用油的质量优劣；此外，本实施方式检测方法对实验条件要求低，不需要特殊的高精分析仪器和检测设备，实验操作方便，成本低廉，易于培训和掌握。二 本实施方式与
一不同点的是步骤一中所述的磷酸盐缓冲液是由KH2P04、KOH和蒸馏水配置而成，磷酸盐缓冲液中KH2PO4的浓度为
I.36 X 10 VmL, KOH的浓度为O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸盐缓冲液的pH值为6. O。其它与
一相同。采用下述试验验证本发明效果试验一一、制备培养基采用NaCl、琼脂粉、蛋白胨、lmol/L的CaCl2水溶液、 lmol/L的MgSO4水溶液、磷酸盐缓冲液和蒸馏水混合均匀得到培养液，密封后置于高压蒸汽灭菌锅中，并在120°C下灭菌处理20min，然后降温至55°C，并在无菌环境下加入待检测食用油，再转移至培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到培养基；二、培养向步骤一制备的培养基中均匀涂入浓度为I. O X IO9个/mL大大肠杆菌0P50菌液，然后 37°C培养10h，再将接入秀丽隐杆线虫幼虫进行培养46h，在培养24h时秀丽隐杆线虫幼虫发育为秀丽隐杆线虫成虫并产卵，继续培养12h时产卵发育成第二代秀丽隐杆线虫幼虫， 再继续培养IOh。本试验步骤一中所述的培养液中NaCl的浓度为3X10_3g/mL，琼脂粉的浓度为 17X 10_3g/mL，蛋白胨的浓度为2. 5 X 10 VmL, CaCl2的浓度为I X W6gMU MgSO4的浓度为IX l(T6g/mL ;本试验步骤一中所述的培养液中加入的磷酸盐缓冲液占培养液总体积的 25%。；本试验步骤一中所述加入的待检测食用油与培养液的体积比为5 1000，且所述的待检测食用油为植物油。本试验步骤一中所述的磷酸盐缓冲液是由KH2P04、KOH和蒸馏水配置而成，磷酸盐缓冲液中KH2PO4的浓度为I. 36 X 10 VmL, KOH的浓度为O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸盐缓冲液的pH值为6.0。本试验步骤二中所述浓度为I. OX IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液的涂入量为2mL/ cm2 ;本试验步骤二中所述的秀丽隐杆线虫幼虫的接种量为10只/cm2。本试验步骤二中再继续培养IOh后第二代秀丽隐杆线虫幼虫进入休眠状态，表现为行为显著减缓甚至静止，不摄食，体型瘦长，体色增黑，表皮增厚，因为植物油中不含有秀丽隐杆线虫生长需要的胆固醇，因此第二代秀丽隐杆线虫幼虫进入休眠状态。试验二 一、制备培养基采用NaCl、琼脂粉、蛋白胨、lmol/L的CaCl2水溶液、 lmol/L的MgSO4水溶液、磷酸盐缓冲液和蒸馏水混合均匀得到培养液，密封后置于高压蒸汽灭菌锅中，并在120°C下灭菌处理20min，然后降温至55°C，并在无菌环境下加入待检测食用油，再转移至培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到培养基；二、培养向步骤一制备的培养基中均匀涂入浓度为I. O X IO9个/mL大大肠杆菌0P50菌液，然后 37°C培养10h，再将接入秀丽隐杆线虫幼虫进行培养46h，在培养24h时秀丽隐杆线虫幼虫发育为秀丽隐杆线虫成虫并产卵，继续培养12h时产卵发育成第二代秀丽隐杆线虫幼虫， 再继续培养IOh。本试验步骤一中所述的培养液中NaCl的浓度为3X10_3g/mL，琼脂粉的浓度为 17X 10_3g/mL，蛋白胨的浓度为2. 5 X 10 VmL, CaCl2的浓度为I X W6gMU MgSO4的浓度为IX l(T6g/mL ;本试验步骤一中所述的培养液中加入的磷酸盐缓冲液占培养液总体积的 25%。；本试验步骤一中所述加入的待检测食用油与培养液的体积比为5 1000，且所述的待检测食用油为动物油。本试验步骤一中所述的磷酸盐缓冲液是由KH2P04、KOH和蒸馏水配置而成，磷酸盐缓冲液中KH2PO4的浓度为I. 36 X 10 VmL, KOH的浓度为O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸盐缓冲液的pH值为6.0。本试验步骤二中所述浓度为I. OX IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液的涂入量为2mL/ cm2 ;本试验步骤二中所述的秀丽隐杆线虫幼虫的接种量为10只/cm2。本试验步骤二中再继续培养IOh后第二代秀丽隐杆线虫幼虫不进入休眠状态，与正常培养基生长的秀丽隐杆线虫子代无明显差别，因为动物油中含有秀丽隐杆线虫生长需要的胆固醇，因此第二代秀丽隐杆线虫幼虫不进入休眠状态，与正常培养基生长的秀丽隐杆线虫子代无明显差别。试验三一、制备培养基采用NaCl、琼脂粉、蛋白胨、lmol/L的CaCl2水溶液、 lmol/L的MgSO4水溶液、磷酸盐缓冲液和蒸馏水混合均匀得到培养液，密封后置于高压蒸汽灭菌锅中，并在120°C下灭菌处理20min，然后降温至55°C，并在无菌环境下加入待检测食用油，再转移至培养皿中，最后在温度为20°C的无菌环境下干燥10h，即得到培养基；二、培养向步骤一制备的培养基中均匀涂入浓度为I. O X IO9个/mL大大肠杆菌0P50菌液，然后 37°C培养10h，再将接入秀丽隐杆线虫幼虫进行培养46h，在培养24h时秀丽隐杆线虫幼虫发育为秀丽隐杆线虫成虫并产卵，继续培养12h时产卵发育成第二代秀丽隐杆线虫幼虫， 再继续培养IOh。本试验步骤一中所述的培养液中NaCl的浓度为3X 10_3g/mL，琼脂粉的浓度为 17X 10_3g/mL，蛋白胨的浓度为2. 5 X 10 VmL, CaCl2的浓度为I X W6gMU MgSO4的浓度为IX l(T6g/mL ;本试验步骤一中所述的培养液中加入的磷酸盐缓冲液占培养液总体积的 25%。；本试验步骤一中所述加入的待检测食用油与培养液的体积比为5 1000，且所述的待检测食用油为地沟油。本试验步骤一中所述的磷酸盐缓冲液是由KH2P04、KOH和蒸馏水配置而成，磷酸盐缓冲液中KH2PO4的浓度为I. 36 X 10 VmL, KOH的浓度为O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸盐缓冲液的pH值为6.0。本试验步骤二中所述浓度为I. OX IO9个/mL大肠杆菌0P50菌液的涂入量为2mL/ cm2 ;本试验步骤二中所述的秀丽隐杆线虫幼虫的接种量为10只/cm2。本试验步骤二中再继续培养IOh后第二代秀丽隐杆线虫幼虫不进入休眠状态，与正常培养基生长的秀丽隐杆线虫子代无明显差别，因为地沟油中含有秀丽隐杆线虫生长需要的胆固醇及其胆固醇衍生物，因此第二代秀丽隐杆线虫幼虫不进入休眠状态，与正常培养基生长的秀丽隐杆线虫子代无明显差别。


利用秀丽隐杆线虫休眠作为生物标志物甄别地沟油的方法，它涉及一种地沟油甄别方法。本发明目的要解决现有地沟油鉴定方法存在灵敏度低、精确度差、操作复杂、成本高的问题。方法，一、采用NaCl、琼脂粉、蛋白胨、CaCl2水溶液、MgSO4水溶液、磷酸盐缓冲液和蒸馏水混合均匀得到培养液，然后灭菌处理，最用经干燥处理即得到培养基；二、先向步骤一制备的培养基中涂入大肠杆菌OP50菌液，并培养一定时间，再将接入秀丽隐杆线虫幼虫进行培养46h。优点一、实现对特异成分痕量低的高精炼地沟油可以有效鉴定；二、操作方便，成本低廉，易于培训和掌握。本发明主要用于甄别地沟油。