专利名称：一种表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯液体深层发酵制备的方法表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)是抗氧化活性最强的茶儿茶素，被广泛应用于医药、食品和化妆品行业。目前主要从茶叶中获得，然而从茶叶中提取分离存在以下几个 问题:需要有机溶剂提取，获得的混合物需要繁琐的纯化过程导致成本高和环境影响，以及得率低。制备方法存在着有害有机溶剂(氯仿、二氯甲烷)残留问题；获得高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)的纯化制备成本高、价格昂贵；提取物的颜色较深影响在饮料、高档护肤品中应用等问题。而植物组织细胞培养又面临不经济和难以大规模培养的问题，因此科学界已经过10年努力尚没有商业化大规模的植物组织细胞产茶儿茶素的系统出现。真菌被人类发现、认识、利用已经有很长的历史，最为人们所熟知的是大型食药用真菌。它们不仅营养丰富，而且含有的许多成分有较强的生理和药理活性。现代研究表明高级担子菌具有广泛的治疗和预防疾病的功能。多孔菌真菌是担子菌中的一大类群，我国的菌类药物中许多属于这一类真菌，如有名的传统中药灵芝、猪苓、茯苓等等。采用液体深层发酵的方法，和传统的真菌培育方法相比，具有生产周期短，成本低，产量质量稳定，产品可以控制等优越性。利用生物技术生产真菌的生物有效成分是必然的趋势，目前国际上已有许多药用真菌商业上采用液体深层发酵来获得有效成分。自1948年美国成功地对蘑菇进行深层发酵和1957年以发酵罐对羊肚菌的液体深层培养以来，液体深层发酵技术在食药用菌制种、综合利用等方面的应用日趋广泛。目前，世界上已有50多种食药用菌进行了液体发酵实验。国内已进行深层发酵并工业化生产应用的食药用菌有冬虫夏草、云芝、灵芝、银耳、猴头、竹荪、猪苓、蜜环菌、香菇、麦角菌、小杯珊瑚菌、小刺猴头坐寸ο在液态发酵培养时，各种理化因素都会影响真菌的生长速度、生物量以及代谢途径，所以开发合适的培养基和发酵条件是提高食药用真菌活性物质产量，得到高活性产物的有效途径。本发明利用白腐真菌液体深层发酵制备表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)，而且为了提高白腐真菌在液体深层发酵中EGCG和ECG的生物合成，在液体深层发酵培养基中添加甘蔗渣、玉米秸杆、稻杆、麦杆和木屑，以及脂肪酸、有机溶剂、表面活性剂等促进剂，来提高EGCG和ECG的产量。本发明以属于白腐真菌的珍稀药用真菌桦褐孔菌(Inonotus obliquus)又名白桦茸为例。桦褐孔菌属担子菌亚门，层菌纲，非褐菌目，多孔菌科，褐卧孔菌属。生于白桦、银桦、榆树、赤杨等的树皮下或砍伐后的枯干上。十六世纪以来，桦褐孔菌作为一种民间药用真菌，在俄罗斯及西伯利亚、东欧地区被用来防治疑难杂症，包括糖尿病、传染性病毒及多种癌症，被认为是具有显著的药理活性而对人体没有任何副作用的一种药用真菌。本发明利用纤维素、半纤维素、木质素的降解以及促进剂的作用来提高桦褐孔菌液体发酵的EGCG和ECG生物合成的效率，具有重要的科学意义和应用前景。
本发明是以生产桦褐孔菌液体发酵儿茶素类物质EGCG和ECG为目标，建立了一种桦褐孔菌液体发酵高效、高产制备EGCG和ECG的方法。本发明的技术方案:桦褐孔菌真菌为出发菌种，采用斜面菌种进行液体种子培养。在玉米淀粉水解糖为发酵碳源的基础上，在液体培养基中添加一定量的秸杆或木屑、以及脂肪酸、有机溶剂、表面活性剂，进行液体深层发酵。发酵条件为:27_28°C，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌转速为70-150转/分钟，内部压力0.1-0.25公斤/立方厘米，发酵周期10-14天。胞外EGCG和ECG的产量提高200%以上。实现本发明的具体步骤如下:(1)取出斜面菌株接入新鲜配置的斜面培养基中，斜面菌种培养温度为25-30°C，培养200-250小时。(2)将步骤I中的斜面菌种转入装有液体种子培养基的摇瓶中，液体种子培养条件:温度为27-28°C，摇床转速70-150转/分钟。培养96-120小时。(3)将步骤2中的液体菌种转入装有液体发酵培养基的发酵罐中，进行液体深层发酵。发酵条件:温度为27-28°C，摇床转速70-150转/分钟。培养288小时。本发明中斜面菌种培养基组成(g/100mL):麦芽浸膏30，蛋白胨3，琼脂15。pH值为 5.4-5.6。本发明中摇瓶种子培养基组成(g/100mL):葡萄糖2，蛋白胨0.3，酵母浸膏0.2，KH2P04 0.1，MgS04 0.15，CaCl2 0.01。本发明中秸杆液体深层发酵培养基组成(g/100mL):玉米粉5，蛋白胨0.3，KH2P04 0.1，ZnS04.2H20 0.001, K2HP04 0.04, FeS04.7H20 0.005, MgS04.7H20 0.05，CuS04.5H200.002，CoC12 0.001，MnS04.H20 0.008。pH值 6.0。本发明的发酵终点确立的标准为还原糖含量低于2%，镜检发现菌丝体开始衰老。本实施例1中摇瓶种子培养，培养基组成(g/100mL):葡萄糖3，蛋白胨0.4，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.1，MgS04 0.15，CaCl2 0.01。本实施例1中玉米秸杆液体深层发酵培养，培养基组成(g/100mL):玉米粉3.5，木屑粉末 4，油酸 0.1，蛋白胨 0.2，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.LZnSO4.2Η20 0.0OLK2HPO4 0.04,FeSO4.7Η20 0.005，MgSO4.7Η20 0.05，CuSO4.5Η20 0.002。pH 值为 6.0。本实施例1中发酵终止的标准为还原糖含量低于2%，镜检菌丝体出现衰老症状。发酵胞外EGCG和ECG的提取:发酵结束后用真空抽滤法分离出发酵液，或是经乙醇沉淀分离多糖后的发酵浓缩液，用体积比1:1乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩、真空或冷冻干燥获总儿茶素。采用色谱等方法进一步纯化。图1为液体深层发酵过程中胞外EGCG和ECG含量随发酵时间的变化规律。桦褐孔菌在本发明秸杆发酵培养基所产生胞外发酵EGCG和ECG的产量随发酵时间的延长而提高，在发酵第13天达到最高。产量比对照培养基中所产生胞外发酵EGCG和ECG提高400%。实施例2:在斜面培养基中接种荷兰CBS菌种保藏库的桦褐孔菌菌丝体。培养温度28 °C，培养240小时。将新鲜的斜面菌种接入装有200mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，28°C培养96小时，摇床转速140转/分钟。将培养好的液体种子按照10% (v/v)接入装有木屑发酵培养基的发酵罐中。28°C培养约302小时。空气流量0.5vvm,内部压力0.1公斤/立方厘米，搅拌转速为140转/分钟。本实施例2中斜面菌种培养,培养基组成是(g/100mL):麦芽浸膏25,蛋白胨4,琼脂 15，pH 值为 5.4-5.6。
本实施例2中摇瓶种子培养，培养基组成(g/100mL):葡萄糖3，蛋白胨0.4，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.1，MgS04 0.15, CaCl2 0.01。摇床转速为 150 转 / 分钟。本实施例2中液体深层发酵培养，培养基组成(g/100mL):玉米粉2.5，玉米/水稻/ 麦秸杆粉末 3.5，吐温 80 0.1，蛋白胨 0.2，酵母浸膏 0.1，KH2P04 0.1，ZnSO4.2H20 0.001，K2HPO40.04，FeSO4.7H20 0.005，MgSO4.7H20 0.05，CuSO4.5H20 0.002。pH 值 6.0。本实施例2中发酵终止的标准为还原糖含量低于2%，镜检菌丝体出现衰老症状。桦褐孔菌在本发明秸杆发酵培养基所产生胞外发酵EGCG和ECG的产量随发酵时间的延长而提高，在发酵第9天达到最高(附图1，蓝色曲线)。产量比对照培养基中所产生胞外发酵EGCG和ECG提高300% (附图1，红色曲线)。


图1是桦褐孔菌液体深层发酵过程中胞外EGCG和ECG产量图，发酵基础培养基(红色曲线)，添加秸杆培养基(蓝色曲线)，添加木屑培养基(黑色曲线)。


通过添加纤维素、半纤维素和木质素、以及脂肪酸、有机溶剂和表面活性剂提高白腐真菌液体深层发酵的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)的产量的方法。以通过液体深层发酵白腐真菌如桦褐孔菌儿茶素类物质为目标，以荷兰CBS菌种库桦褐孔菌为出发菌种，进行液体发酵罐发酵。发酵条件27-28℃，空气流量0.5-1.5vvm，搅拌转速80-160转/分钟，内部压力0.15-0.35公斤/立方厘米，发酵周期10-14天。此方法提高桦褐孔菌液体深层发酵的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)的产量。