专利名称：重要呼吸道致病病毒检测基因芯片的制备和用途的制作方法呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。目前至少有7个病毒科的10多个属共239 个型别的病毒可引起急性呼吸道感染。急性呼吸道感染是临床常见病之一，已成为严重威胁人类健康的一个公共卫生问题。据世界卫生组织2002年统计报告，急性呼吸道感染居全球十大死亡原因中第3位，全球每年近四百万人死于急性呼吸道感染。在儿童和成人中，90%以上的急性呼吸道感染都是由病毒引起的。最常见的呼吸道病毒有甲乙型流感病毒(influenza virus)，1、2、3型副流感病毒(HPIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒 (hMPV)、麻疫病毒(Measlesvirus)、腿腺炎病毒(Mumps virus)、风疫病毒(Rubella virus) 等。这些病毒具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点。感染后因病毒型别种类繁多且其症状相似，如鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、轻度咽炎、全身发热等症状，因此临床上很难鉴别。及时准确的甄别病毒型别是临床诊治和疾病监控的关键环节。传统的呼吸道病毒实验室检测方法包括组织细胞培养法；血清学和直接检测法(包括电镜法)；间接、直接免疫荧光抗体法(IFA/DFA);酶免疫测定(EIA)、酶活性测定(神经氨酸酶测定)；核酸扩增法(PCR)。病毒的分离培养与鉴定及血清学实验等传统实验技术，在病毒性疾病诊断中曾起着十分重要的作用。组织细胞培养仍然是发现新病毒的重要技术手段，是其他任何技术不可替代的。然而，这些技术都还存在一些无法弥补的缺陷，操作费时、费力、敏感性差、诊断效率低等。总之，传统的实验室诊断方法和目前应用的实验技术，远远不能满足临床诊断的需要，医生单凭自己的临床经验进行病毒性疾病诊断的事是经常发生的。据此，病毒性疾病的实验室诊断技术必须改革，要寻找和建立快速、特异、敏感和简便的实验技术，以适应临床工作的需要。基因芯片技术是20世纪90年代初发展起来的一种用于基因分析的高新生物技术，广泛用于临床疾病的研究，特别是用于诊断一些微生物病原体的感染。与传统的分子生物学技术相比，基因芯片技术其突出的特点是高通量、集成化、微型化、自动化等。特别适合于对大量未知样品进行平行快速高通量的分析。病毒的基因组较简单，每种病毒只有一种核酸，但是病毒增殖速度极快，故病毒较其他微生物更具有遗传不稳定性，即变异性。国内外文献专利报道的基因芯片技术用于检测呼吸道病毒的方法，多为随机引物结合基因芯片方法。虽然随机PCR扩增法的检测范围有了很大的改观，但该法扩增的靶基因用于芯片杂交，其杂交信号特异性差，国内相关的研究包括杨银辉等制备的cDNA探针基因芯片，可成功检测SARS病毒、东方马脑炎病毒等10种烈性RNA病毒，其敏感性为IO2拷贝数，但特异性较差，与其他属的探针之间有非特异性杂交；黄岩山等建立了能检测十几种呼吸道病毒的基因芯片，种特异性探针长60mer，样品扩增采用随机接头PCR方法，使用该芯片可以成功检测细胞培养的甲型和乙型流感病毒，但是特异性和灵敏度均不高，由于所用引物在扩增时没有特异性，也必然导致扩增效率低，因此检测灵敏度也相应会下降。荧光检测法是基因芯片的常规检测方法，即将荧光色素化合物直接或间接标记在待检核酸上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。该方法的缺点荧光信号易饱和， 易淬灭；存在自发荧光现象；而且更重要的是检测仪器价格昂贵，体积笨重，从而严重限制了基因芯片在国内的推广应用，尤其是在中小医疗机构以及现场检测的推广应用。开发成本低廉、检测方便、适合现场检测的基因芯片检测新技术势在必行。金标银染技术(GLSS)的出现弥补了荧光检测法的不足，使基因芯片可视化检测成为可能。该技术的原理是首先用纳米金标记待检的PCR产物，然后在体系中引入银离子。 小尺寸效应使纳米金具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而这些银颗粒又可以进一步催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹纳米金颗粒积聚成团状银壳，形成肉眼可见的黑色颗粒，肉眼即可观测。基于金标银染的原理的可视化芯片检测技术能够大幅降低生物芯片的检测成本， 但是单步金标银染的检测灵敏度还不能满足分子检测领域的更高要求，进一步提高可视化的灵敏度，使可视化检测能够完全代替荧光检测，对于生物芯片技术的推广应用具有重要意义。TSA(tyramine siganal amplification,酪胺信号放大技术)是一种基于辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)催化的生物信号放大技术，是由Bobrow等人于1989 年首次提出的。信号放大分子酪胺是一个酚基化合物，可以作为HRP的作用底物。TSA的原理是在HRP酶催化下，大量连接半抗原的酪胺分子沉积，这些半抗原主要是生物素、荧光素等小分子物质。1992年,Adams将应用Biotin-Tyramine的TSA系统首先引入免疫组化,用于抗原或抗体的检测。现在，TSA技术在免疫印迹、ELISA分析以及原位杂交等诸多领域都得到了广泛的应用。本研究采用多重PCR结合可视化芯片检测技术研发了重要呼吸道致病病毒检测基因芯片试剂盒，该芯片试剂盒敏感性好，特异性高，适合于多种呼吸道病毒的快速鉴定。
本发明的目的在于提供一种检测常见呼吸道致病病毒核酸的可视化基因芯片，该芯片依托可视化芯片检测技术实现了检测信号的可视化，能同时检测九种呼吸道致病病毒，包括A、B型流感病毒，副流感病毒1、2型，人偏肺病毒，呼吸道合胞病毒，麻疹病毒，风疹病毒，腮腺炎病毒，从而实现高通量、特异、敏感、快速检测常见呼吸道致病病毒的目的。为了达到上述目的，本发明开发了常见呼吸道致病病毒核酸检测可视化基因芯片，其制备方法如下I.步骤一制备特异引物经过比对各呼吸道病毒基因组，选择病毒的特异、保守片段作为检测靶基因，在保证各病毒靶基因特异性扩增的前提下兼顾其灵敏度，故将九种呼吸道病毒特异性引物进行分管组合，经优化最终确定了 3管多重RT-PCR体系。优选的9对呼吸道病毒特异性引物及其对应的扩增靶病毒种类和分管组合情况，如表I所示表I呼吸道病毒特异性引物及其对应的扩增靶病毒种类和分管组合情况分管引物名称序列F-3’)序列号靶病毒A管F75 R76AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAG Bio-CTTCCTGTGCTGACTTTGCATGGGTASEQ ID NO: I SEQ ID NO:2人偏肺病毒HRSV-FTTAACCAGCAAAGTGTTAGASEQ ID NO:3呼吸道合胞病HRSV-RBio-TTTGTTATAGGCATATCATTGSEQ ID NO:4毒F69 R70TTTGATCTCTCTCTTGGCTTCAC Bio-TGGACAATCTGGTTATCACACGSEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6麻疹病毒B管F84TGCTTTGCCCCATGGGACCTCGAGSEQ ID NO:7风疹病毒R86Bio-GGCGAACACGCTCATCACGGTSEQ IDNO:8F61GAGCGATTCACAATAGAACAGGASEQ ID NO:9腮腺炎病毒R62Bio-CATTATTTATGGTTGGAGGGAGGSEQ ID NO: 10Influenza AsAAAGCGAATTTCAGTGTGATSEQ ID NO: 11流感病毒A型InfluenzaA asBio-GAAGGCAATGGTGAGATTTSEQ ID NO:12C管Influenza Bs Influenza B asGTCCATCAAGCTCCAGTTTT Bio-TCTTCTTACAGCTTGCTTGCSEQ IDNO:13 SEQ ID NO:14流感病毒B型PIVlFlACCTACAAGGCAACAACATCSEQ ID NO: 15副流感病毒I型PIVlRlBio-CTTCCTGCTGGTGTGTTAATSEQ ID NO:16PIV2F1CCATTTACCTAAGTGATGGAASEQ ID NO:17副流感病毐2型PIV2R1Bio-CGTGGCATAATCTTCTTTTTSEQ ID NO:182.步骤二:制备病毒特异性探针本着型间保守、属间特异的原则，根据9种呼吸道病毒靶基因序列间的比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行特异性探针的设计。每种靶病毒对应一条特异性寡核苷酸探针。优选的病毒特异性探针序列及对应的靶病毒如表2所示表2病毒特异性探针序列及对应的靶病毒探针名称序列(5’-3’)序列号靶病毒HMPVAATTAATGTTGCTGAGCAATCAAAGGAGSEQ ID NO: 19人偏肺病毒HRSVCCAACAAAAGAACAACAGACTACTAGAGATT ACCAGGSEQ ID N0:20呼吸道合胞病毒MealesTGGACAGGCATATTATAGTACCTASEQ IDNO:21麻疹病毒MumpGAAGCTCAGATAGAACGCTGTGAGSEQ ID NO:22月思腺炎病毒RubellaCTGCATTTGCGAGATCCCCACTGATGSEQ ID NO:23风疹病毒INFAAGGGCTTTCACCGAAGAGGGSEQ ID NO:24流感病毒A型INFBAACGAAGTAGGTGGAGACGGAGGSEQ ID NO:25流感病毒B型PIVlCAAACGATGGCTGAAAAAGGGASEQ ID NO:26副流感病毒I型PIV2CAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCSEQ ID NO:27副流感病毒2型 3.步骤三制备寡核苷酸芯片—个优选的实施方案，步骤二中各个寡核苷酸探针在点样时，用2X点样液 (6XSSC,O. 1% SDS)稀释至终浓度50μΜ。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥18小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中包括九种呼吸道病毒特异性探针，如表3所示。其中片基质控探针为20Τ序列，5’端cy3标记、3’端NH2修饰，用来监测醛基片片基质量。表3寡核苷酸探针阵列


本发明涉及一种重要呼吸道致病病毒检测基因芯片，其制备方法包括制备特异引物，制备病毒特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系，制备可视化检测试剂及建立显色方法。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别9种常见呼吸道致病病毒，包括包括A、B型流感病毒，副流感病毒1、2型，人偏肺病毒，呼吸道合胞病毒，麻疹病毒，风疹病毒，腮腺炎病毒，为常见呼吸道致病病毒高通量、快速检测提供一种新的解决方案，可为呼吸道致病病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。