专利名称：重要肠道致病病毒检测基因芯片的制备和用途的制作方法肠道病毒(enterovirus)是一大群通过粪-口途径传播，经过消化道感染的病毒。 其感染虽然始于胃肠道，但很少引起这些部位的疾病。肠道病毒属RNA病毒类的小RNA病毒科(picornaviridae),包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(enterocytopathic human orphan virus, ECHO简称埃可病毒)及新型肠道病毒共71个血清型，肠道病毒属病毒引起的传染病。临床表现轻者只有倦怠、乏力、低热等，重者可全身感染，脑、脊髓、心、肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有，在温带夏季多见，在温暖、潮湿、 卫生条件差、人群拥挤的地区发病率高。肠道病毒引起的疾病，临床表现复杂而多样化，同型病毒可引起不同的临床综合症，而不同型别病毒又可引起相似的临床表现。多数肠道病毒感染后不出现或只出现轻微症状，如发热或上呼吸道感染等，但有些肠道病毒感染可引起明显的临床症状，且肠道病毒引起的临床症状很少与肠道疾病有关。肠道病毒所致的疾病主要有(I)脊髓灰质炎85% 的脊髓灰质炎由脊髓灰质炎病毒I型引起，偶有些由脊髓灰质炎病毒2、3型引起。(2)无菌性脑膜炎、脑炎和轻瘫几乎所有的肠道病毒感染都与无菌性脑膜炎、脑炎和轻瘫有关。肠道病毒性脑膜炎几乎每年夏秋季均有发生。其中有些型别，如埃可病毒3、11、18、19、肠道病毒71型等曾引起过暴发流行。(3)疱疹性咽峡炎主要由柯萨奇病毒A组引起，典型症状是在软腭、腭垂周围出现水疱性溃疡损伤。(4)手足口病主要由柯萨奇病毒A组5、10、16 型和肠道病毒71型引起，可导致暴发感染。(5)肋肌痛主要由柯萨奇病毒B组1-5型引起，患者表现为突发性发热和单侧胸痛，有时扩展为双侧胸痛或腹痛。(6)心肌炎和心包炎 主要由柯萨奇病毒B组1-5型引起，散发流行于成人和儿童，但对新生儿威胁最大，在婴儿室可引起暴发流行。新生儿感染后，病毒可直接破坏心肌细胞，患儿出现发热和突然的、不明原因的心力衰竭，死亡率高。(7)急性非细菌性胃肠炎轮状病毒呈世界性分布。A组轮状病毒感染最为常见，是引起6个月至2岁婴幼儿严重胃肠炎的主要病原体，占病毒性胃肠炎的80%以上，是导致婴幼儿死亡的主要原因之一。年长儿童和成人常呈无症状感染。轮状病毒感染的传染源是病人和无症状带毒者。病人每克粪便中排出的病毒体可达IOltl个， 粪-口是主要的传播途径。病毒还可能通过呼吸道传播，从有呼吸道症状儿童的呼吸道分泌物中曾检出轮状病毒的存在，在动物中已证明气溶胶可传播病毒。B组轮状病毒可在成人中产生暴发流行，但至今仅在我国有过报道。C组轮状病毒对人的致病性类似A组，但发病率很低。及时准确的甄别病毒型别是临床诊治和疾病监控的关键环节。传统的肠道病毒实验室检测方法包括组织细胞培养法；血清学和直接检测法(包括电镜法)；间接、直接免疫荧光抗体法(IFA/DFA);酶免疫测定(EIA)、酶活性测定(神经氨酸酶测定)；核酸扩增法 (PCR)。病毒的分离培养与鉴定及血清学实验等传统实验技术，在病毒性疾病诊断中曾起着十分重要的作用。组织细胞培养仍然是发现新病毒的重要技术手段，是其他任何技术不可替代的。然而，这些技术都还存在一些无法弥补的缺陷，操作费时、费力、敏感性差、诊断效率低等。总之，传统的实验室诊断方法和目前应用的实验技术，远远不能满足临床诊断的需要，医生单凭自己的临床经验进行病毒性疾病诊断的事是经常发生的。据此，病毒性疾病的实验室诊断技术必须改革，要寻找和建立快速、特异、敏感和简便的实验技术，以适应临床工作的需要。基因芯片技术是20世纪90年代初发展起来的一种用于基因分析的高新生物技术，广泛用于临床疾病的研究，特别是用于诊断一些微生物病原体的感染。与传统的分子生物学技术相比，基因芯片技术其突出的特点是高通量、集成化、微型化、自动化等。特别适合于对大量未知样品进行平行快速高通量的分析。病毒的基因组较简单，每种病毒只有一种核酸，但是病毒增殖速度极快，故病毒较其他微生物更具有遗传不稳定性，即变异性。国内外文献专利报道的基因芯片技术用于检测肠道病毒的方法比较少，多数报道仅针对肠道病毒属中的一种或几种。因此文献中报道的方法不能充分利用基因芯片高通量检测这一特点，国内相关的研究包括顾大勇等人仅针对诺如病毒、轮状病毒做了相关研究，史蕾等人针对诺如病毒的分型作了介绍。荧光检测法是基因芯片的常规检测方法，即将荧光色素化合物直接或间接标记在待检核酸上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。该方法的缺点荧光信号易饱和， 易淬灭；存在自发荧光现象；而且最大缺点是检测仪器价格昂贵，体积笨重，从而严重限制了基因芯片的推广应用，尤其是在中小医疗机构以及现场检测的推广应用。开发成本低廉、 检测方便、适合现场检测的基因芯片检测新技术势在必行。金标银染技术(GLSS)的出现弥补了荧光检测法的不足，使基因芯片可视化检测成为可能。该技术的原理是首先用纳米金标记待检的PCR产物，然后在体系中引入银离子。 小尺寸效应使纳米金具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而这些银颗粒又可以进一步催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹纳米金颗粒积聚成团状银壳，形成肉眼可见的黑色颗粒，肉眼即可观测。基于金标银染的原理的可视化检测技术能够大幅降低生物芯片的检测成本，但是单步金标银染的检测灵敏度还不能满足分子检测领域的更高要求，进一步提高可视化的灵敏度，使可视化检测能够完全代替荧光检测，对于生物芯片技术的推广应用具有重要意义。 TSA(tyramine siganal amplification,酪胺信号放大技术)是一种基于辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase, HRP)催化的生物信号放大技术，是由Bobrow等人于1989年首次提出的。信号放大分子酪胺是一个酚基化合物，可以作为HRP的作用底物。TSA的原理是在HRP酶催化下，大量连接半抗原的酪胺分子沉积，这些半抗原主要是生物素、荧光素等小分子物质。1992年,Adams将应用Biotin-Tyramine的TSA系统首先引入免疫组化,用于抗原或抗体的检测。现在，TSA技术在免疫印迹、ELISA分析以及原位杂交等诸多领域都得到了广泛的应用。本研究采用不对称RT-PCR结合可视化基因芯片检测技术研发了常见肠道致病病毒核酸检测可视化基因芯片，可对目前较常见的肠道致病病毒进行甄别，该芯片法敏感性5好，特异性高，适合于多种肠道病毒的快速鉴定。
本发明的目的在于提供一种检测常见肠道致病病毒核酸的可视化基因芯片，该芯片依托可视化芯片检测技术实现了检测信号的可视化，能同时检测十种肠道致病病毒，包括脊髓灰质炎病毒1、2、3型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B3、B4、B5型、 埃可病毒30型、轮状病毒，从而实现高通量、特异、敏感、快速检测常见肠道致病病毒的目的。为了达到上述目的，本发明开发了常见肠道致病病毒核酸检测可视化基因芯片， 其制备方法如下I.步骤一制备特异引物经过比对各肠道病毒基因组，选择病毒的特异、保守片段作为检测靶基因，在保证各病毒靶基因特异性扩增的前提下兼顾其灵敏度，故将5对肠道致病病毒引物进行分管组合，经优化最终确定了 3管多重RT-PCR体系。优选的5对肠道致病病毒引物及其对应的扩增靶病毒种类和分管组合情况，如表I所示表I肠道致病病毒引物及其对应的扩增靶病毒种类和分管组合情况本发明涉及一种重要肠道致病病毒检测基因芯片，其制备方法包括制备特异引物，制备病毒特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系，制备可视化检测试剂及建立显色方法。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别10种常见肠道致病病毒，包括包括脊髓灰质炎病毒1、2、3型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B3、B4、B5型、埃可病毒30型、轮状病毒，为常见肠道致病病毒高通量、快速检测提供一种新的解决方案，可为肠道致病病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。