专利名称:一种香石竹四种病毒的同步检测方法在香石竹病毒的RT-PCR检测技术中,孔宝华等人(孔宝华,蔡红等.香石竹斑驳 病毒的鉴定和PT-PCR检测[J].植物保护,2002,2,观(1) :5_8)根据香石竹斑驳病毒CarMV 的RNA序列设计引物,可从RNA稀释IO4的RNA粗提液中检出香石竹斑驳的病毒。赵珊等人 (赵珊,王继华,王丽花,杨秀梅.香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测[J].西南农业学报, 2010,1 =103-106)通过设计引物能从香石竹坏死斑点病毒CNFV感病香石竹组织中检测出 CNFV病毒,灵敏性测定结果表明该特异性引物RT-PCR可从稀释IO6植物总RNA中检测出病经过多年不断的完善,目前PCR技术已经发展成为一种通用技术,多重RT-PCR可 以在一个反应中同时提供常规法数次反应的扩增信息,这种高效快速的优势使其在植物病 毒检测与无病毒苗快速繁育推广中具有重要意义,但利用该技术同时检测多种香石竹病毒 中尚未见报道。香石竹病毒病是香石竹上的一类重要病害,引起香石竹病毒病的病毒种类很多, 国内外已报道有10余种,但一般认为,香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)、 潜隐病毒(Carnation latentvirus, CLV)、环斑病毒(Carnation ring spot virus, CRSV) 和坏死斑点病毒(Carnation necrotic fleck virus,CNFV)是世界上对香石竹生产危害最 大的4种病毒。
为了解决上述问题,本发明的目的在于提供用于香石竹四种病毒的同步检测的引 物、检测方法及其检测试剂盒。本发明的一个目的在于提供用于香石竹四种病毒同步检测引物,包括CarMV 上游引物ACGCTCACCTCGCCAATTTGCTTCarMV 下游引物TCCGCAGTCCGCACATTCCTACT ;CRSV 上游引物AATCCAAAATGGCGCTGGTGCCTCRSV 下游引物CATCAGTGAAACGCGACCGCTCA ; CLV 上游引物TGTTGGGCTGTCGCACGTTACTGCLV 下游引物GGTGGGGATTTGGCGAACAGCAT ;CNFV 上游引物TGGAGTGCGTCACCTTGAGTGGTCNFV 下游引物GTCGAAAGTGCCGCCTCCGAAAT。本发明的另一个目的在于提供香石竹四种病毒同步检测方法,包括如下步骤1)提取香石竹的总RNA ;2) RT-MPCR 将步骤1)中得到的RNA反转录后,用权利要求1所述的引物扩增反转录产物,并进行电泳检测。本发明还提供香石竹总RNA的提取方法,步骤如下1)称取0. 05 0. Ig香石竹幼叶或花瓣至研钵中,在液氮下研成极细粉末,将粉末 迅速转移至预冷的1. 5mL离心管中,加0. 8 1. 2mLTrizol后用漩涡混合器充分混勻,于室 温下静置5min,使其充分裂解;2) 13000rpm,4°C离心10 15min,吸上清,加等体积的体积比为24 1的氯仿 异戊醇,漩涡混合器充分混勻,静置2 ;3min ;3) 12000rpm,4°C离心10 15min,吸上清至新的离心管,加0. 7倍体积的异丙醇, 漩涡混合器充分混勻,_70°C静置10 30min ;4) 12000rpm,4°C离心10 15min,弃上清,加300 500 μ L 75%乙醇进行洗涤, 温和振荡离心管,悬浮沉淀,7500rpm,4°C离心5 lOmin,弃上清;5) 300 500 μ L 75 %乙醇重复洗涤一次,室温晾干或真空干燥5 lOmin,用 50 100 μ L无RNase的双蒸水溶解RNA样品,于_70°C保存备用。根据本发明,扩增香石竹反转录产物的PCR反应体系为本发明涉及一种香石竹四种病毒同步检测方法,具体涉及香石竹斑驳病毒、潜隐病毒、环斑病毒和坏死斑点病毒的同步检测方法。本发明具体公开了上述四种病毒同步检测的引物,其序列如SEQ ID No.1~8所示。本发明还公开了上述四种病毒的同步检测方法,包括1)提取香石竹的总RNA;2)RT-MPCR将步骤1)中得到的RNA反转录后,将上述四对引物在一个反应中对反转录产物进行同步扩增,同步检测上述的四种病毒。本发明提供的引物兼容性好,条带清晰易区分;本发明提供的方法降低了检测成本,提高了检测速度,实现了香石竹病毒检测的同步性、高效性和灵敏性。
一种香石竹四种病毒的同步检测方法
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