专利名称：包含羟基氯喹的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物的制作方法肿瘤是细胞无限增殖而妨碍正常细胞的功能的疾病，根据病理组织学及临床学的判断标准来分离成恶性肿瘤和阳性肿瘤，所谓的癌症属于恶性肿瘤。癌症目前占有韩国国内死亡原因第一位，全球上也独占死亡原因的首位。癌症的发病原因或治疗方法尚未明确查清，迄今所开发的治疗剂在临床上应用时存在致命的副作用、体现耐性、淋巴球及骨髓破损等问题。因此，迫切需要开发出对于正常细胞不呈现活性， 而只对癌细胞呈现细胞毒性的新型抗癌剂。目前，在人体内所发生的癌症大约有270多种，据报告，用于研究这些癌症的细胞株有肉瘤(Sarcoma-180)、黑素瘤(melanoma)、腺瘤(adenoma)、腺癌(adeno-carcinoma)、 艾氏腹水瘤(Ehrlich ascites tumor)及沃克癌(Walker carcinoma)等。据研究报道，其中，肉瘤-180是来源于白色雄性老鼠的腋窝癌的肉瘤化的肿瘤，使其继代演变为腹水癌而维持起来，以便能够相互容易地体现实体型和腹水型，移植时没有种属特异性。另一方面，羟基氯喹(hydroxychloroquine)目前应用于类风湿性关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮及光敏性皮肤病的治疗剂，还应用于疟疾的治疗和预防，近来已报告关于肾损伤抑制及安全神经胶质瘤的研究等。在韩国专利授权第10-0390332号中已公开抗癌剂复合组合物，该组合物通过将作为抗疟疾剂而常用的羟基氯喹、氯喹及伯氨喹等与作为抗癌剂的阿霉素及顺钼等合并投用，来降低抗癌剂的最小有效浓度(IC5tl),并能抑制因抗癌剂而导致的癌细胞的耐药性。其中，羟基氯喹等的抗疟疾剂用作通过抑制抗癌剂的耐性来提高抗癌效果的辅助剂，根据基于经口及非经口等抗癌剂的投药途径的全身性投药来呈现效果。S卩，迄今尚未报告羟基氯喹具有抗癌效果的研究结果，因此，也查不到用作抗癌剂的主成分的例子。
技术问题本发明为了将羟基氯喹用作局部投药用抗癌剂，提供一种局部投药用抗癌剂组合物，本发明将尤其对正常细胞不呈现活性，而只对癌细胞呈现细胞毒性的抗癌剂组合物直接注射或注入到癌细胞。解决问题的手段为了实现上述目的，本发明提供一种包含羟基氯喹(hydroxychloroquine)或其盐的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物。优选地，本发明的抗癌剂组合物能够直接注射或注入到癌细胞，还包含利多卡因等局部麻醉剂和/或核黄素等抗氧化剂。本发明通过向癌细胞直接注射或注入将羟基氯喹用作主成分的组合物的局部投药来发挥抗癌效果。将含有羟基氯喹的局部投药用组合物直接投用在患处来使局部组织硬化，从而将会阻断代谢。癌细胞相比正常细胞代谢快速，因此如果通过羟基氯喹来阻断代谢，组织则会惰性化，最终引发组织的坏死。在本发明的组合物中，羟基氯喹的含量优选为5 25% (w/v)，更优选为20 25% (w/v)。如果羟基氯喹的含量低于5% (w/v)，则难以期待治疗效果，如果高于25% (w/ ν)，则会引发癌细胞周边的正常组织的坏死也一同发生的副作用，因此并不优选。在根据本发明的局部投药用注射剂组合物中，局部麻醉剂通过注射方式直接投用到癌细胞时，以去除疼痛为目的而使用，优选地使用1 2% (w/v)浓度的利多卡因。并且， 抗氧化剂为了制剂稳定性而进行调配，优选地使用0. 1 0. 5% (w/v)浓度的核黄素。并且，鉴于羟基氯喹相对于水的溶解性，能够使用羟基氯喹的盐，尤其是优选使用硫酸盐。根据本发明的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物，能够通过常用的注射剂制备方法来进行制备。本发明的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物，优选地，直接注射或注入到癌细胞，根据患者的状态，以3 4天为间隔，能够反复投用几周，根据癌细胞的大小和发展状态，以1 2为间隔，反复投用，由此能够抑制癌细胞的增殖及细胞代谢，来在短时间内使癌细胞硬化而惰性化。图1是将通过四甲基偶氮唑蓝显色分析法(MTT assay)来获得的影响肉瘤 (sarcoma) 180细胞株的生长的本发明组合物的效果与对照药物进行比较而表示的图表。图2是将给美国癌症研究所(ICR Institute of Cancer Researcch)老鼠的肉瘤 (sarcoma) 180细胞株的分化带来影响的本发明组合物的效果与对照药物的效果(删除)进行比较而表示的图表。图3是表示影响美国癌症研究所(ICR Institute of Cancer Researcch)老鼠的肉瘤(sarcoma) 180细胞株实体癌的生长的本发明组合物的效果的图表。图4是表示诱发美国癌症研究所(ICR Institute of Cancer Researcch)老鼠的肉瘤180细胞株腹水癌后影响本发明组合物的寿命延长的效果的图表。
4助剂添加占调配容量的10 20%的20%乙醇，在水浴箱中加热溶解之后，添加2% (w/v) 浓度的利多卡因及0. 1% (w/v)浓度的核黄素来进行制备。用作阳性对照药的顺钼(cisplatin)是从西格玛公司(USA)购买使用的。(2)癌细胞株在本实施例中使用的癌细胞株为肉瘤(Sarcoma) 180 (KCLB4066)，是由韩国细胞株
库出售的。作为针对细胞株的细胞培养基，使用添加有10%特级胎牛血清(FBS :fetal bovine serum)的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI 1640)培养基，在该培养基中添加链霉素(100 μ 1/Μ1)和青霉素(100 μ 1/Μ1)。在37°C、5% C02培养器中，对肉瘤(sarcoma) 180细胞株进行48小时继代培养之后将其用于实验。为了进行动物实验，将肉瘤(sarcoma) 180细胞株制备成以2 X 107Cells/Ml浓度注入到ICR老鼠腹腔内，采取经过约两周后所获得的腹水来反复清洗两次在2000rpm下离心分离的沉淀液之后，用0. 4%蓝色胰蛋白酶来染色而使其达到2X107cellS/Ml。(3)实验动物购买生后5周龄的ICR系实验用老鼠，使它适应一周之后用于实验。动物的饲养条件为如下室内温度22士2°C，相对湿度维持为50%，以12小时为周期，调节照明来体现日夜。效果试验例1.测定肉瘤(sarcoma) 180中的细胞毒性为了评价本发明的组合物带给细胞毒性的影响，使用了 MTTassay。MTT assay是用于测定细胞的生存率的实验室试验法，可称为标准比色分析法(standard colorimetric assay) 0作为能够正确地测定细胞的增殖和活细胞的方法的MTT assay是生命科学领域， 尤其是肿瘤生物学中必需的方法之一。为了检索用于开发新型抗癌剂的效能或者查看以往开发的抗癌剂的灵敏度，在应用于实验动物等生体之前，应该预先进行客观上证明药物在生体外抑制肿瘤细胞的生长的过程。将以lX105cells/Ml稀释的肉瘤(sarcoma) 180细胞株添加在96-孔板的各个板， 在37°C、5% CO2培养器(inciAator)中，对菌株进行M小时培养。经过M小时培养之后， 将本发明组合物的浓度从1. 0 μ 1至0 μ 1稀释成总共8种浓度，然后添加到各个孔中，通过相同的方法稀释顺钼之后添加到孔中。之后，在37 °C、5% CO2培养器(incubator)中，重新进行M小时培养，并添加 50 μ 1的2mg/Ml MTT (四甲基偶氮唑蓝)试剂之后，在37°C的培养器中放置4小时。利用离心分离器来去除上清液，往各个孔分别添加200 μ 1的二甲基亚砜(DMSO)， 使得MTT染色沉淀物溶解之后，在MOnm波长中，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测仪来测定 OD54tl 值。将50%抑制浓度(IC5tl)定义为使生存率达到50%的药物的浓度，并将IC5tl值用作抗癌效果的指标。图1是将通过四甲基偶氮唑蓝显色分析法(MTT assay)来获得的影响肉瘤 (sarcoma) 180细胞株的生长的本发明组合物的效果与对照药物进行比较而表示的图表。如图1所示，以2X IO7CelVMl的浓度接种肉瘤(sarcoma) 180细胞株悬浮液之后，与作为对照药物的顺钼比较抗癌能力的结果表明，顺钼的IC5tl值为0. 1 μ g/Ml，本发明组合物的IC50值为0.01 μ 1以下。S卩，本发明组合物相对于在生物体外经过四甲基偶氮唑蓝显色分析法(MTT assay)的肉瘤(sarcoma) 180的IC5tl值，呈现相比顺钼低10倍左右的值，由此被判断为具有优良的细胞毒性效果。效果试验例2.癌细胞分化抑制效果为了观察本发明组合物在ICR老鼠中呈现的抗癌能力，接种肉瘤(sarcoma) 180之后，评价了带给肉瘤(sarcoma) 180的分化的影响。按照下表1，将适合于饲养设施的动物分为总共6个组(Gl G6)，然后给每个组分配12只的动物而使用。下表1表示实验组设定及投药浓度。表

本发明涉及一种包含羟基氯喹的用于抗癌治疗的局部投药用注射剂组合物，根据本发明的抗癌剂组合物，相对于在生物体外经过四甲基偶氮唑蓝显色分析法的肉瘤180的IC50值，呈现相比顺铂低10倍左右的值，由此具有优良的细胞毒性效果，并且，在生物体内针对因肉瘤80而诱发的实体癌呈现容量依赖性效果，而且针对因肉瘤80而诱发的腹水癌呈现延长寿命的效果。