专利名称：：一种棉花分子遗传连锁作图的方法：分子遗传连锁图已经在多种植物中构建。棉花分子标记连锁图的构建始于1994年，Reinish应用限制性片段长度多态性(RFLP)标记构建了一张包含705个多态性位点，分布到不同大小的41个连锁群的图谱，总长4675cM(ReinischAJ，DongJM，BrubakerCL，StellyDM，WendelJF，PatersonAH.AdetailedRFLPmapofcottonGossypiumhirsutum×Gossypiumbarbadensechromosomeorganizationandevolutioninadisomicpolyploidgenome.Genetics，1994，138829-847)。Shappley等利用陆地棉×陆地棉F2群体应用限制性片段长度多态性(RFLP)标记构建了总长为865cM，含120个标记，覆盖基因组18.6％左右的连锁图(ShappleyZ.W，JenkinsJ.N.，C.E.MeredithWR，McCarty，JrJC.AnRFLPlinkagemapofUplandcotton，GossypiumhirsutumL.TheorApplGenet，1998，97756～761)。Jiang等应用限制性片段长度多态性(RFLP)得到含261个标记，27个连锁群，平均间距14.4cM，总长3767cM的连锁图谱(JiangCX，WrightRJ，El-ZikKM，PatersonAH.PolyploidformationcreateduniqueavenuesforresponsetoselectioninGossypium(cotton).ProcNatlAcadSci，1998，951419～1424)。Ulloa等构建了总长为700.7cM，覆盖基因组15％左右，包含有81个限制性片段长度多态性(RFLP)多态性位点的分子标记连锁图(UlliaM，MeredithJrWR.GeneticlinkagemapandQTLanalysisofagronomicandfiberqualitytraitsinanintraspecificpopulation.TheJournalofCottonScience，2000，4161～170)。左开井等利用泗绵3号(Bt)与鄂荆1号的152个F2单株，得到67个多态性位点(40个RFLP，11个RAPD，16个SSR位点)，分布在8个连锁群上，图谱长度为1337.4cM(左开井，孙济中，张献龙等。利用RAPD、SSR和RFLP标记构建陆地棉分子标记连锁图。华中农业大学学报，2000，19(3)190～193)。Ulloa等利用Shappley等(1998)和Ulloa和Meredith(2000)构建的两个连锁群和他们新构建的另两张图谱聚合作图，得到了47个连锁群，含284个位点，总长1502.6cM，但标记在各连锁群分布不均匀(UlloaM，MeredithWRJr，ShappleyZW，KahlerAL.RFLPgeneticlinkagemaopsfromF2.3populationsandajoinmapofGossypiumhirsutum.TheorApplGenet，2002，104200～208)。ZhangJ通过半配合产生58个GossypiumhirsutumL.和GossypiumbarbadenseL.的单倍体群体，应用于连锁图构建，624个标记(510个SSR和114个RAPD)中的489个进入43个连锁群，总长3314.5cM(ZhangJ，GuoW，ZhangT.Molecularlinkagemapofallotetraploidcotton(GossypiumhirsutumL.×GossypiumbarbadenseL.)withahaploidpopulation.TheorApplGenet，2002，1051166～1174)。就目前而言，棉花已经构建的多张分子标记连锁图，应用的DNA标记主要是限制性片段长度多态性(RFLP)、简单序列重复(SSR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)。限制性片段长度多态性(RFLP)标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点，但RFLP技术的实验操作过程较复杂，不易实现自动化，并且对DNA的要求高，用量大，对大群体进行分析的费用大。随机扩增多态性DNA(RAPD)标记对DNA的需要量少，对DNA的要求不高，操作简单易行，但RAPD标记易受实验条件影响，重复性差，产率低。简单序列重复(SSR)是一种很好的标记，但棉花的SSR有限，而开发SSR很费时又很昂贵。棉花的分子标记连锁图密度还不够，必须增加标记才能满足应用的需要，现有的标记对增加图谱密度的能力有限，必须应用新的标记。
本发明的目的在于克服现有应用于棉花分子连锁图构建的缺陷，应用SRAP构建棉花的分子标记连锁图，平均每个引物组合可产生3.75个多态性条带，最多可产生13条带，具有产率高、增加标记所需时间短的特点，可大幅度增加棉花分子标记连锁图的密度。本发明通过以下技术方案实现一种评价棉花连锁遗传的方法，特别是棉花分子遗传连锁遗传作图的方法，其特征在于按照下列步骤1)以海岛棉品系Pima90为父本，陆地棉品种邯郸208为母本，配制杂交组合，将得到的F2单株作为分子遗传连锁作图的起始材料，并将所述的材料种植于田间；2)从所述的田间材料中取所述的亲本和F2群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA；3)应用序列相关扩增多态性(Sequence-relatedamplifiedpolymorphismSRAP)标记方法，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增引物检测所述群体的多态性并进行遗传作图，其中所述的引物除Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)报道的引物外，另外自行设计了引物，该引物的编号从me6--m9，(上游引物)；em7--e17(下游引物)。本发明自行设计的引物如附图1所示；4)将步骤3)扩增的DNA片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，该方法包括先用2000伏电压预电泳至电流为30mA，上样后用2500伏恒压再电泳1.5～2h，在电泳过程中控制胶板温度不高于50℃；5)对步骤4)获得的凝胶片进行银染，染色时先染凝胶下部，待显出带后再染上部；6)结合凝胶片所显示的带型进行遗传连锁评价并作图。在本发明中所述的PCR反应体系是DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中随机取上、下游引物各1个，配对使用，每个引物用量为30ng，dNTPs为200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2为1.5mM；Taq酶1U，总体积为20ul，不足部分用ddH2O补充。附图及其说明图1是本发明中设计的SRAP分子标记引物；图2是本发明的引物m3e14在部分F2群体上的扩增图；图中，M100bpladder；P1邯郸208；P2Pima90；其它为F2部分单株；箭头示多态性条带。图3是本发明的棉花SRAP分子标记连锁图；以下结合说明书及附图对本发明作进一步描述1、供试材料以Pima90(海岛棉)为父本，邯208(陆地棉)为母本，配制杂交组合，得到129个F2单株作为作图群体。所有材料种于中国湖北省武汉市华中农业大学试验田。2、总DNA提取方法从所述的田间材料中取所述亲本和F2群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA，具体方法参照1994年Paterson等(PatersonAH，CurtLB，WendelJF，Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPandPCRanalysis.PlantMolBilRep，1993，11112-127)发表的方法提取。3、SRAP标记分析(1)棉花SRAP标记分析PCR引物除Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)论文中发表的引物外，另自行设计引物，该引物的编号从me6--m9，(上游引物)；em7--e17(下游引物)。本发明的引物见附图1所示。之后将本发明所设计的引物交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。在本发明中PCR反应体系为DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中随机取上、下游引物各1个，配对使用，每个引物用量为30ng(用量参照AFLP方法见文献VosP，HogersR，BleekerM，ReijansM，vandeLeeT，HomesM，FrijtersA，PotJ，PelemanJ，KuiperM，ZabeauM.AFLPanewtechniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsRes，1995，234407～4414)；dNTPs为200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2为1.5mM；Taq酶1U(购自MBI公司)，总体积为20ul，不足部分用ddH2O补充。DNA扩增程序参照Li和Quiros报道的方法，扩增反应在PTC-100PCR仪上进行。(2)电泳电泳仪为美国生命科学公司的EC-160电泳仪，电泳缓冲液为0.5×TBE。20ul扩增产物中加入10ulLoadingBuffer(98％去离子甲酰胺，10mMEDTA，0.25％溴粉兰，0.25％二甲苯青)，95℃变性5min，上样5ul。采用6％PAGE胶(7mol/L尿素)分离，2000伏电压预电泳至电流为30mA，上样后用2500伏恒压电泳1.5～2h，电泳过程中确保胶板温度不高于50℃。(3)电泳后银染，银染方法参考吴冠芸等的方法(吴冠芸，潘华珍，吴羽生物化学与分子生物学实验常用数据手册，北京，科学出版社，1999)。染色时，先染凝胶下部，待显出带后，再染上部。4、数据整理及连锁分析分子标记的记录采用Mapmaker软件(LincolnS，DalyM，LanderES.ConstructiongeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0.InWhiteheadInstituteTechnicalReport，2nded.CambridgeWhiteheadInstitute，1992)记录方法。对于共显性标记，用“A”表示邯郸208亲本的纯合带型；用“B”表示Pima90亲本的纯合带型；“H”表示两亲本的杂合带型。对于显性标记，邯郸208亲本为纯合带型，记为“A”；Pima90亲本的纯合带型与杂合带型记为“C”。Pima90亲本的纯合带型记为“B”；邯郸208亲本的纯合带型与杂合带型记为“D”。缺失数据用“-”表示。采用“引物组合+标记分子量”的方法对标记进行命名，如m1e1-550，“m1e1”表示引物组合me1和em1，“-550”表示该标记的分子量；引物组合后面的“-K”表示该标记的分子量为1000bp。利用MAPMAKER/EXP.3.0(LincolnS，DalyM，LanderES.ConstructiongeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0.InWhiteheadInstituteTechnicalReport.2nded.CambridgeWhiteheadInstitute，1992)为作图软件，先用Group和Order命令进行标记间连锁分析(LOD＝3.0，r＝0.4)，对未进入连锁群的标记用Try命令连到相应连锁群上，最后用Ripple命令确定最佳排列顺序，构建棉花分子标记连锁图。利用Kasambi函数将重组率转换为遗传图距(cM)。本发明的效果1、利用SRAP构建的棉花分子标记连锁图，标记在连锁图中分布均匀，克服了已发表的连锁图标记分布不均匀的缺点。2、标记产率高，平均每个引物组合可产生3.75个多态性条带，最多可产生13条多态性条带，比已应用于棉花分子遗传连锁图构建的其它标记的产率都高。3、本发明采用的电泳处理，从而确保结果的准确性、可重复性及高分辨性。具体实施例方式实施例11、以海岛棉品系Pima90为父本，陆地棉品系邯208为母本，配制杂交组合，将得到的F2单株作为遗传连锁作图的起始材料，并将所述的材料种植于田间；2、从所述的田间材料中取所述亲本和F2单株群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA；3、利用SRAP标记构建棉花分子标记连锁图，得到一张含237个位点的39个连锁群，总长3030.7cM，覆盖整个基因组的65.4％，标记间平均间距12.79cM。这是首张用SRAP构建的棉花分子遗传连锁图谱。具体步骤如下3.1SRAP标记分析SRAP分析PCR引物除Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)论文中发表的引物外，另自行设计引物(见附图1所示上游引物编号从me6--m9；下游引物编号从em7--e17，本发明设计的引物交由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中随机取上、下游引物各1个，配对使用，每个引物用量为30ng；[用量参照AFLP操作方法(文献见VosP，HogersR，BleekerM，ReijansM，vandeLeeT，HomesM，FrijtersA，PotJ，PelemanJ，KuiperM，ZabeauM.AFLPanewtechniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsRes，1995，234407～4414)]。dNTPs为200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2为1.5mM；Taq酶1U(购自MBI公司)，总体积为20ul，不足部分用ddH2O补充。DNA扩增程序参照Li和Quiros(LiG，QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymorphisim(SRAP)，anewmarkersystembasedonasimolePCRreactionitsapplicationtomappingandgenetagginginBrassica.TheorApplGenet，2001，103455～461)的方法，扩增反应在PTC-100PCR仪上进行。(2)电泳电泳仪为美国生命科学公司的EC-160电泳仪，电泳缓冲液为0.5×TBE。20ul扩增产物中加入10ulLoadingBuffer(98％去离子甲酰胺，10mMEDTA，0.25％溴粉兰，0.25％二甲苯青)，95℃变性5min，上样5ul。采用6％PAGE胶(7mol/L尿素)分离，2000伏电压预电泳至电流为30mA，上样后用2500伏恒压电泳1.5～2h，电泳过程中确保胶板温度不高于50℃。(3)电泳后银染，银染方法参考吴冠芸等的方法(吴冠芸，潘华珍，吴羽。生物化学与分子生物学实验常用数据手册。北京科学出版社，1999)。3.2数据整理及连锁分析分子标记的记录采用Mapmaker软件记录方法。对于共显性标记，用“A”表示邯郸208亲本的纯合带型；用“B”表示Pima90亲本的纯合带型；“H”表示两亲本的杂合带型。对于显性标记，邯郸208亲本为纯合带型，记为“A”；Pima90亲本的纯合带型与杂合带型记为“C”。Pima90亲本的纯合带型记为“B”；邯郸208亲本的纯合带型与杂合带型记为“D”。缺失数据用“-”表示。采用“引物组合+标记分子量”的方法对标记进行命名，如m1e1-550，“m1e1”表示引物组合me1和em1，“-550”表示该标记的分子量；引物组合后面的“-K”表示该标记的分子量为1000bp。利用MAPMAKER/EXP.3.0作图软件，先用Group和Order命令进行标记间连锁分析(LOD＝3.0，r＝0.4)，对未进入连锁群的标记用Try命令连到相应连锁群上，最后用Ripple命令确定最佳排列顺序，构建棉花分子标记连锁图。利用Kasambi函数将重组率转换为遗传图距(cM)。3.3亲本间多态性DNA标记的筛选对两亲本用136个引物组合进行筛选，每个组合可产生50～100个清晰可辨的条带。选取多态性好的76个引物组合进行群体分析，共得到285条多态性条带，每组合的多态性条带数从1～13不等。平均每个引物组合产生3.75个多态性条带(见附图2所示)3.4棉花SRAP分子标记连锁图的构建对得到的285个多态性标记用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图。237个标记进入39个连锁群(LOD≥3.0)，48个独立，总长3030.7cM，覆盖整个基因组的65.4％(见图3)。每个连锁群有2～13个标记，最长的连锁群为227.4cM，最短的连锁群为5cM。标记间最大间距为42.8cM，最小间距为0.2cM，标记间平均间距12.79cM。权利要求1.一种评价棉花连锁遗传的方法，特别是棉花分子遗传连锁作图的方法，其特征在于按照下列步骤1)以海岛棉品系Pima90为父本，陆地棉品种邯郸208为母本，配制杂交组合，将得到的F2单株作为遗传连锁作图的起始材料，并将所述的材料种植于田间；2)从所述的田间材料中取所述亲本和F2群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA；3)应用序列相关扩增多态性(Sequence-relatedamplifiedpolymorphismSRAP)分子标记，聚合酶链式反应(PCR)扩增引物检测所述群体的多态性并进行遗传作图，其中所述的引物序列如附图1所示4)将步骤3)扩增的DNA片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，该方法包括先用2000伏电压预电泳至电流为30mA，上样后用2500伏恒压再电泳1.5～2h，在电泳过程中控制胶板温度不高于50℃；5)对步骤4)获得的凝胶片进行银染，染色时先染凝胶下部，待显出带后再染上部；6)结合凝胶片所显示的带型进行遗传连锁评价并作图。2.根据权利要求1所述的评价棉花连锁遗传的方法，特别是棉花分子遗传连锁传作图的方法，其特征在于所述的PCR反应体系是DNA模板60ng；在所述的涉及的引物中随机取上、下游引物各1个，配对使用，每个引物用量为30ng，dNTPs为200uM；1×ReactionBuffer；MgCl2为1.5mM；Taq酶1U，总体积为20ul，不足部分用ddH2O补充。全文摘要本发明公开了一种利用SRAP分子标记进行棉花连锁遗传作图的方法。作图群体为海岛棉与陆地棉杂交产生F文档编号A01H1/02GK1541514SQ0311901公开日2004年11月3日申请日期2003年4月29日优先权日2003年4月29日发明者张献龙,林忠旭,聂以春,贺道华申请人:华中农业大学