专利名称：可活化构建体的制作方法 血小板来源于其在骨髓中的细胞前体巨核细胞。当内皮完整时正常的 静息血小板在血液循环各处自由流动。当单层内皮屏障受损时，静息的血小板通过糖蛋白(GP)受体黏附于内皮下结构。例如，GPIaIIa和GPVI结合胶原；GPIcIIa结合纤连蛋白；GPIc*IIa结合层粘连蛋白而GPIb-V-IX结合von Willebrand因子(vWF)聚合体。血小板以该方式的黏附导致其改变形状并释放其a颗粒和致密颗粒。反过来，这导致过多其它糖蛋白血小板受体例如GPIIbIIIa (其结合纤维蛋白原/纤维蛋白)、TLT-I和CREB-2的暴露；以及以下因子的释放凝血因子I (纤维蛋白原)、V和XI ;其它前凝血剂例如ADP、Ca2+和血清素；抗凝血剂例如组织因子通道抑制剂(TFPI)和对血小板补充和愈合必需的化合物例如血小板衍生生长因子(TOGF)。活化的血小板以快速反应彼此结合并交联纤维蛋白。活化的血小板还通过在其(细胞)膜上展示的选择蛋白而在白细胞归巢至血管损伤和炎症的部位中发挥重要作用。组织因子(TF)(—种跨膜糖蛋白)，是血液凝固的主要细胞引发物。其主要在内皮下细胞例如平滑肌细胞和成纤维细胞的表面上表达，并且当内皮的完整性被打断时例如当血管被切断时结合凝血因子VII (FVII)和凝血因子Vila (FVIIa)两者。当TF结合FVII时，其促进FVII向FVIIa活化。TF还极大提高了因子VIIa对其生理学底物因子IX和因子X的蛋白水解活性。其通过提供用于最佳大分子外部位(exosite)的相互作用的支架并通过诱导因子VIIa的蛋白酶结构域的构象改变来如此进行，该构象改变导致活性位点区域的正确限定。因此，TF是传统上被称作血液凝固的外部途径的起始复合体中FVIIa的辅因子。凝血级联的后续步骤最终导致纤维蛋白聚合体的形成，该聚合体被活化的血小板结合并与FXIIIa交联。因此，活化的血小板和凝血级联的纤维蛋白聚合体产物一同形成稳定的血块并促进组织愈合。在凝血病的受试者中，例如在患有A型血友病和B型血友病的人中，凝血级联的许多步骤由于例如凝血因子的缺乏或存量不足而使得功能障碍。凝血的一部分的此类功能障碍导致血液凝固不足和潜在地危及生命的出血。本发明的一个目标是提供在此类受试者中适用作促凝血药物的构建体。本发明的第二个目标是提供在血液凝固起始的所需物理点活化的构建体。本发明的第三个目标是提供在生理学上合适的微环境中上调血液凝固的构建体。本发明的另一个目标为将单克隆抗体或其生物学上有活性的片段或变体引导至活化的血小板或内皮细胞的表面。因此，所述目标是能够在位于血管内或血管外的活化血小板的表面上引发血液凝固。这与正常和专有地内皮下典型地血管外血液凝固的引发相反。已知涉及止血的一些过程/分子与组织愈合复杂交织，并因此还与病理过程例如炎症和癌细胞转移复杂交织。因此本发明的ー个目标是提供一种构建体，其亦可用于治疗与出血患者中血管破裂相关产生的并存病特别是炎性疾病以及自身免疫性疾病和癌细胞转移。发明简述 本发明涉及一种构建体，其包含(i)配体例如单克隆抗体(mAB)或其片段、(ii)可切割基序(CM)和(iii)包含(i)的表位基序(EM)的多肽序列。所述构建体还可包含组织因子(TF)或其生物学上有功能的变体或片段。所述构建体的所述mAB可能能够结合细胞上的受体，所述细胞选自活化的血小板、活化的内皮细胞和白细胞。在ー个方面，所述mAB能够结合活化的血小板上的受体。该受体可为选择蛋白，例如E-选择蛋白(CD62E)、P-选择蛋白(⑶62P)或L-选择蛋白(⑶62L)。在一个实施方案中，所述受体为P-选择蛋白(⑶62P)。可工程改造所述构建体，使得所述CM的C端与所述单克隆抗体或其片段的重链的 N端共价连接。可工程改造所述构建体，使得所述可切割基序的C端与所述单克隆抗体或其片段的轻链的N端共价连接。所述表位基序的C端可与所述可切割基序的N端共价连接。本发明的构建体的CM可被酶切割。该酶可为选自以下的蛋白酶凝血酶、因子Vila (FVIIa)、因子 IXa (FIXa)、因子 Xa (FXa)、因子 XIa (FXIa)、因子 XIIa (FXIIa)、激肽释放酶、活化蛋白C (APC)、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。CM可为蛋白酶的切割位点。在ー个特定的实施方案中，所述CM可为血纤肽A(FpA)或其片段；例如SEQ ID NO: 3的氨基酸40-49 (DFLAEGGGVR)。EM可包含与SEQ IDNO: 3的残基20-39 (SVLQCLATGNWNSVPPECQA)对应的氨基酸序列。提供的构建体的mAB可包含SEQ ID NO: 8。所述构建体的mAB可包含SEQ ID NO: 9。所述构建体为这样的如可利用FACS分析检测的，其固有的mAB或其片段可在所述构建体的CM被切割时结合其靶标。本发明还提供了编码本发明的构建体的多核苷酸和能够表达本发明的构建体的分离的细胞。此外，本发明提供了一种治疗有需要的受试者中与血管破裂相关的并存病即出血和炎症的方法，所述方法通过利用本发明的构建体来进行。附图简述 图 I:显示了表示 A) EP-FpA-PBl. 3 HC-V、B) PBl. 3 H(M^PC) PBl. 3 LC-V 的核苷酸序列和氨基酸序列。斜体序列为信号肽序列，粗体序列表示PBl. 3 mAb结合表位(EP)、带下划线的序列表示凝血酶可切割的接头序列。带下划线和斜体的序列表示限制性内切酶识别位点。图 2 :显示了 pIT-EP-FpA-PBl. 3 HC (2A)、pIT-PBl. 3 HC (2B)和 pTT-PBl. 3 LC(2C)的质粒图谱。缩写为以下AmpR :氨节青霉素抗性基因；pMBl ori :大肠杆菌(E. coli)的复制起点；pCMV :巨细胞病毒启动子；TPL :三联前导序列；enh MLP :腺主要晚期启动子增强子；oriP EB病毒的复制起点；PolyA :多腺苷酸化位点；SP :信号肽；EP PB1. 3 mAb结合表位；FpA :凝血酶可切割的接头。图3 :显示了 PBl. 3 (3A)和EP-FpA-PBl. 3 (3B)与活化和非活化的血小板的FACS结合实验的結果。两种实验中包括了同种型匹配的对照抗体^APC。序列描述 SEQ ID NO: I提供了人⑶62P的多肽序列(包括信号肽)。SEQ ID NO: 2-3提供了 EP-FpA-PBl. 3 HC-V构建体的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 4_5提供了人源化抗⑶62P单克隆抗体PBl. 3的重链的可变域的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 6_7提供了人源化抗⑶62P单克隆抗体PBl. 3的轻链的可变域的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 8提供了能够结合⑶62P的单克隆抗体的重链的多肽序列。SEQ ID NO: 9提供了能够结合⑶62P的单克隆抗体的轻链的多肽序列。 SEQ ID NO: 10-11提供了组织因子的多核苷酸序列和多肽序列。SEQ ID NO: 12_13提供了 TF的胞外域的多核苷酸序列和多肽序列。发明详述 CD62P
CD62P(P-选择蛋白)为众所周知且已良好表征的受体分子，其已在活化的血小板和内皮细胞上被鉴定。CD62P存在于静息血小板的a -颗粒和内皮细胞的怀布尔-帕拉德体中并且可在活化时迅速易位至细胞表面。在血小板的活化时，其a-颗粒与质膜融合，使CD62P膜蛋白易位至细胞表面。在血小板活化后数分钟内P-选择蛋白的表面表达增加40-50倍。CD62P属于选择蛋白黏附分子家族并在刺激时由血小板和内皮细胞表达。已证明⑶62P为与心血管病症、炎症和肿瘤转移相关的可能的数种分子之一。例如，已知CD62P的结合经由配体例如P-选择蛋白糖蛋白配体-1 (PSGL-I)活化白细胞和内皮细胞；血小板介导的白细胞滚旋依赖于CD62P并且内皮CD62P在免疫介导的疾病例如炎性肠病、多发性硬化、银屑病或类风湿性关节炎中引发白细胞外滲。按照本发明，CD62P可来自任何脊椎动物，例如任何哺乳动物，例如小鼠、大鼠、免、豚鼠、猪、牛、猿或人。CD62P可从产生功能性蛋白的任何天然存在的基因型或等位基因翻译。一种人⑶62P的非限制性实例为SEQ ID NO: I的多肽序列。组织因子
组织因子为263个氨基酸的膜内在糖蛋白受体。其由以下组成胞外部分(折叠成两个各自通过单个ニ硫键稳定的紧密的纤连蛋白III型样结构域(1-219))、跨膜区段(220-242)和短的胞质尾部(243-263)。其与因子VII/FVIIa形成紧密的依赖Ca2+的复合体。按照本发明，“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可为能够结合因子VII/VII(a)使得引发血液凝固的任何多肽。“组织因子”可来源于任何脊椎动物，例如任何哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猪、牛、猿或人。“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可为人组织因子的胞外域。“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可为与SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的组织因子的多肽序列有至少90%、例如至少91%、例如至少92%、例如至少93%、例如至少94%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%同一性的任何多肽。“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可为与组织因子的胞外域的多肽序列有至少90%、例如至少91%、例如至少92%、例如至少93%、例如至少94%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%同一性的任何多肽。“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可为能够作为FVII和FVIIa的辅因子发挥功能的任何多肽。因此，“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可为能够刺激FVIIa的酰胺水解活性(amidolytic activity)的任何多肽。所述“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可为组织因子的胞外域AA1-219 (SEQ ID NO: 13)。“组织因子多肽”可为包含组织因子的可溶性胞外域，即氨基酸1-219(在以下被称作sTF或sTF (1-219))，或其功能性变体或截短形式的多肽。优选地，所述组织因子多肽至少包含与组织因子的氨基酸序列6-209对应的片段。其实例为sTF (6-209)、sTF (1-209)和 sTF (1-219)。根据本发明，“组织因子或其任何生物学上有功能的变体或片段”可具有以上列出的任何一个或多个特征。同一性 如本领域已知的术语“同一性”，是指如通过比较序列确定的两条或更多条多肽的序列之间的关系。在本领域中，在本领域中，“同一性”亦意指多肽之间的序列相关程度，其通过两个或更多个氨基酸残基串之间匹配的数目来确定。“同一性”衡量由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)得出的两个或更多个具有空位比对(如果有的话)的序列中较小者之间的相同匹配百分比。可用已知方法容易地计算相关多肽的同一性。所述方法包括但不限于以下文献中所阐述的方法Computational Molecular Biology (计算分子生物学)，Lesk, A. M.编辑，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing:Informatics and Genome Projects (生物计算信息学和基因组项目)，Smith, D. W.编辑，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data (序列数据的计算机分析)，第一部分，Griffin, A. M.,和 Griffin, H. G.编辑，Humana Press,New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物学中的序列分析)，von Heinje, G. , Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer (序列分析引物)，Gribskov, M.和 Devereux, J.编辑，M. Stockton Press, New York, 1991 ;和Carillo 等，SIAM J. Applied Math. , 48, 1073, (1988)。设计确定同一性的优选方法以在待测序列之间获得最大匹配。在可公开获得的计算机程序中阐述了测定同一性的方法。在两个序列之间测定同一性的优选计算机程序方法包括 GCG 程序包(包括 GAP) (Devereux 等，Nucl. Acid. Res. 12, 387，(1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, ffis.)、BLASTP、BLASTN和 FASTA (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215, 403-410，(1990))。BLASTX 程序可公开获自国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual, Altschul等，NCB/NLM/NIHBethesda, Md. 20894 ;Altschul等，上述)。亦可使用众所周知的Smith Waterman算法来测定同一性。例如，使用计算机算法GAP (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, Wis.),比对待测定序列同一丨I"生百分比的两条多肽以最佳匹配其各自的氨基酸(“匹配跨度(matched span)”，其由算法确定)。与算法一起使用空位开放罚分(其计算为3乘以平均对角线；“平均对角线”为待使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”为由特定比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的评分或数字)和空位延伸罚分(其通常为{分数(1/10)}乘以空位开放罚分)以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM62。算法亦使用标准比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵參见Dayhoff等,Atlas of ProteinSequence and Structure (蛋白质序列和结构图集)，第5卷，增补本3 (1978);关于BLOSUM 62 比较矩阵參见 Henikoff 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919，(1992))。肽序列比较的优选參数包括以下算法Needleman等，J. Mol. Biol 48,443-453，(1970);比较矩阵来自 Henikoff 等，PNAS USA 89, 10915-10919，(1992)的BLOSUM 62 ;空位罚分12，空位长度罚分4，类似性阈值0。具有以上參数的GAP程序为有用的。前述參数为用GAP算法进行肽比较的默认參数(连同末端空位没有罚分)。构建体
本发明提供了一种构建体，其包含配体例如单克隆抗体(mAB)或其片段、可切割基序(CM)和包含所述mAB或其片段的表位基序(EM)的多肽。所述构建体的所述配体组分可能 能够结合选择蛋白，例如CD62P。优选工程改造本发明的构建体使得其在其组分CM未被切割时是惰性的并且使得其组分mAB或其片段在CM被切割时能够结合其靶标。本文所用术语“构建体”是指通过共价和可操作连接的元件表征的多肽分子或多核苷酸分子。例如，构建体可指包含至少mAB、CM和EM的构建体以及编码此类构建体的核酸，所述mAB、CM和EM可操作地连接以提供本文所述的可活化构建体。本发明的构建体还可包含其它元件，例如组织因子或其片段。配体
术语“配体”是指能够结合生物分子并与生物分子形成复合体以用于生物学目的的任何物质。在该术语的一个含义中，其为通过分子间カ例如离子键、氢键和范德华カ结合靶蛋白上的位点的信号触发分子。配体与所述生物分子的缔合通常可逆。天然存在的配体与其对应物受体的结合改变受体蛋白的化学构象。本发明的配体可为任何天然存在或合成的配体，其结合活化的内皮细胞、血小板或白细胞上的选择蛋白，或者所述配体可为针对选择蛋白产生的抗体或其片段。本发明的配体可导致或不可导致所述选择蛋白的化学构象的改变。此外，本发明的配体可由于结合其靶选择蛋白，导致或不导致胞内信号转导。因此，本发明的配体利用天然存在的受体以便实现本发明独特的且由本发明所提供的作用。本发明的配体可不结合选择蛋白以获得模拟其天然配体的生物作用的作用。因此CD62P的配体的类似物PSGL-I可为本发明的配体，前提是其阻断CD62P的活化而非引起⑶62P的活化。或者，本发明的配体可为能够结合选择蛋白例如CD62P的单克隆抗体或其片段。抗体
本文提及的术语“抗体”包括完全抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。抗体是指包含通过ニ硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。各轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。VH区和VL区还可细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布着更保守的称为框架区(FR)的区域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。本发明的抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体为单克隆抗体。本发明的抗体可为嵌合抗体，CDR-移植抗体、人抗体或人源化抗体或其任一种的抗原结合部分。对于单克隆抗体和多克隆抗体两者的生产，实验动物合适地为哺乳动物例如山羊、兔、大鼠或小鼠。多克隆抗体为来源于不同B细胞系的抗体。多克隆抗体可包含针对特定抗原的不同免疫球蛋白分子的混合物。多克隆抗体可包含不同免疫球蛋白分子的混合物，所述免疫球蛋白分子结合抗原分子内的一种或多种不同表位。多克隆抗体可通过常规方法生产，例如用目标抗原对合适的动物免疫。随后可从所述动物中移出血液并纯化免疫球蛋白级分。单克隆抗体为彼此相同并且对于特定表位具有单一结合特异性和亲和力的免疫球蛋白分子。本发明的单克隆抗体(mAb)可通过多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法(例如Kohler和Milstein (1975) Nature 256: 495的标准体细胞杂交技术)或B淋巴细 胞的病毒转化或致癌转化。制备杂交瘤的优选动物系统为鼠系统。小鼠中的杂交瘤生产是非常良好确立的程序。免疫方案和用于融合的免疫脾细胞的分离的技术为本领域已知。还已知融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序。为产生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤，可从免疫小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞并融合至合适的永生化细胞系例如小鼠骨髓瘤细胞系中。可针对抗原特异性抗体的生产筛选所得杂交瘤。可将分泌抗体的杂交瘤再铺板，再次筛选，并且若仍对合适的IgG呈阳性，可通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。接着可将稳定的亚克隆在体外培养以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。术语抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原(例如本文所述的CD62P或另一种靶蛋白)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包括=Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段和分离的互补决定区(⑶R)。单链抗体例如scFv和重链抗体例如VHH和骆驼抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”之内。这些抗体片段可利用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且所述片段可以与完整抗体相同的方式针对效用进行筛选。本发明的抗体可通过重组的方式制备、表达、产生或分离，例如(a)从针对目标免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)中分离的抗体，或从所述动物制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从转化以表达目标抗体的宿主细胞例如从转染瘤中分离的抗体，(C)从重组的、组合抗体文库中分离的抗体和(d)通过任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述方法涉及免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列。本发明的抗体可为人抗体或人源化抗体。本文所用术语“人抗体”意指包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，若抗体包含恒定区，所述恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文所用术语“人抗体”意指不包括其中来源于另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。
此类人抗体可为人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可通过杂交瘤产生,所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从转基因非人动物例如转基因小鼠中获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。人抗体可通过人淋巴细胞的体外免疫接着用EB病毒转化所述淋巴细胞来制备。术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另ー种物质或另一种抗体的缀合物。术语“人源化抗体”意指这样的抗体，其中来源于另ー种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已移植至人框架序列上。在人框架序列内可进行另外的框架区修饰。本发明的抗体可通过例如标准的ELISA或蛋白印迹针对与靶蛋白的结合测试。 ELISA测定还可用于筛选对靶蛋白呈阳性反应性的杂交瘤。抗体的结合特异性还可通过监控抗体与表达靶蛋白的细胞的结合例如通过流式细胞术来确定。本发明的抗体对靶蛋白的特异性可进ー步通过确定抗体是否结合其它蛋白来研究。例如，当需要产生特异性结合CD62P或CD62P的特定部分例如表位的抗体时，抗体的特异性可通过确定抗体是否也结合其它分子或缺少目标部分的CD62P的修饰形式来评价。本发明的多肽或抗体“片段”可通过截短，例如通过从多肽的N端和/或C端移除一个或多个氨基酸来制备。以该方式可从N端和/或C端移除多至10个、多至20个、多至30个、多至40个或更多个氨基酸。片段还可通过ー个或多个内部缺失来产生。形成本发明的构建体的部分的抗体可具有结合活化的内皮细胞、血小板或白细胞的表面上的选择蛋白的能力。所述抗体可能能够结合选择蛋白，使得阻止通常结合所述选择蛋白的配体结合该选择蛋白。因此，所述mAB或其片段可阻断通常结合选择蛋白的配体的活性。本发明的抗体可为抗CD62P抗体或其变体的片段或可包含抗CD62P抗体或其变体的片段。形成本发明的构建体的一部分的mAB可为描述于美国专利5，800, 815的mAB，所述专利通过引用以其整体结合于本文中。同样地，本发明的构建体可包含美国5，800，815中所述的mAB的片段。可被本发明的构建体阻断的配体可为PSGL-1。本发明的抗体可为如以上进ー步讨论的该抗体或其变体的抗原结合部分或可包含该抗体或其变体的抗原结合部分。例如，本发明的抗体可为该抗体或其变体的Fab片段，或可为来源于该抗体或其变体的单链抗体。表位
本文所用术语“表位”定义干“抗原结合多肽”(Ab)与其对应的“抗原”(Ag)之间的分子相互作用的背景中。本文所用术语Ab包含抗体或其片段，例如但不限于Fab片段、F(ab’)2片段或Fv片段，其特异性结合对应的Ag。术语Ag是指用于免疫活性的脊椎动物的免疫以产生识别该Ag的Ab的分子实体。在本文中，Ag范围更广地称呼并且通常g在包括被Ab特异性识别的分子，因此包括在产生Ab的免疫过程中使用的分子的片段或模拟物。一般而言，术语“表位”是指Ab特异性结合的Ag上的区或区域。蛋白表位可包含直接涉及结合Ab的Ag中的氨基酸残基(也被称作表位的优势免疫组分)和不直接涉及结合的其它氨基酸残基，例如Ag上被Ab有效阻断的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基在Ab的“溶剂排斥的表面”和/或“足迹”内)。本文术语表位除非另外指出(例如在一些情况中本发明涉及直接结合特定的氨基酸残基的抗体)，否则包括特异性结合抗选择蛋白抗体或者本发明另一种选择蛋白特异性构建体组分的选择蛋白例如CD62P任何特定区域上的两种类型的结合位点。任何选择蛋白可包含许多不同的表位，其可包括但不限于(I)线性肽抗原决定簇；(2)由一个或多个非邻接氨基酸组成的构象抗原决定簇，所述氨基酸在成熟的受体构象中彼此相近定位；和(3)全部或部分由与给定选择蛋白共价连接的分子结构(例如糖基)组成的翻译后抗原决定簇。给定Ab/Ag对的表位可利用多种实验表位作图法和计算表位作图法在不同的细节水平限定和表征。所述实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)光谱学、氢氘交换质谱(HX-MS)和各种竞争结合法。由于各方法依靠于独特原理，表位的描述与通过测定该表位的的方法紧密相联系。因此，给定Ab/Ag对的表位可不同地限定，这视采用的表位作图法而定。
在其最详细的水平上，表位可通过原子接触限定，所述原子接触对Ag与Ab之间的相互作用是重要的。在不太详细的水平上表位可通过其包含的氨基酸残基来表征。在更不太详细的水平上表位可通过功能例如通过与其它Ab的竞争结合来表征。在通过Ab例如Ab的Fab片段与其Ag之间复合体的原子座标限定的X射线衍生晶体结构的背景中，术语表位在本文中除非另外说明或与上下文矛盾，否则特别地定义为特征在于具有离Ab中的重原子在4 A的距离内的重原子(即非氢原子)的残基。根据以下事实在不同的细节水平上得到取决于使用的表位作图法的表位的描述和定义，因而得出不同Ab对于相同Ag的表位的比较可类似地在不同的细节水平上进行。氨基酸水平上描述的表位，例如从X射线结构确定的表位，若其包含相同套的氨基酸残基，则认为是相同的。若至少一个氨基酸被表位共享，则认为表位重叠。若无氨基酸残基被表位共享，则认为表位是分开的(唯一的)。若对应Ab的结合相互排斥，即一种Ab的结合排斥其它Ab的同时结合，则认为通过竞争结合表征的表位重叠。若Ag能够容纳两个相对应Ab的同时结合,则认为所述表位是分开的(唯一的)。互补位
一般而言，术语“互补位”是指Ag特异性结合的Ab上的区或区域。在通过Ab例如Ab的Fab片段与其Ag之间复合体的原子座标限定的X射线衍生晶体结构的背景中，术语互补位在本文中除非另外说明或与上下文矛盾，否则特别地定义为特征在于具有离表位的重原子在4 A的距离内的重原子(即非氢原子)的Ag残基。表位基序
本发明的构建体的表位基序(EM)通常是指这样的氨基酸序列，其位于构建体中使得在未切割状态，甚至在单克隆抗体(mAB)或其片段的靶标存在的情况下，EM干扰所述mAB或mAB片段与其靶标的结合。然而，在构建体的被切割状态中，EM与所述靶标的结合减少，从而允许所述mAB或其片段更大地接近靶标并提供靶标结合。因此，EM为这样的EM :其当未切割构建体时阻止mAB或其片段结合其靶标，但一旦构建体被切割，则基本上或显著地并不干扰mAB对靶标的结合或与mAB竞争结合靶标。因此，EM和CM的联合提供了可活化构建体，其中当未切割所述构建体时EM减少靶标结合，并且CM经由蛋白酶的切割提供增加的靶标结合。EM的结构性质视许多因素而变化，例如干扰mAB与其靶标结合所需的最小氨基酸序列、互补位/表位的相互作用、CM的长度、CM是否位于EM内、接头存在与否、mAB或其片段之内或侧翼是否存在可提供半胱氨酸-半胱氨酸ニ硫键的半胱氨酸等。所述EM的C端可与所述CM的N端共价连接。所述EM的C端可与mAB或其片段通过例如半胱氨酸化学法、聚糖化学法、N端化学法或赖氨酸化学法共价连接。所述EM可包含与所述mAB或其片段的CDR区相互作用的靶选择蛋白的ー个或多个残基。所述EM可为线性的，或者其可为结构表位的线性装配体。如可通过结合相互作用分析(例如实施例4和5中所述的分析)检测的，所述EM可阻止所述mAB或其片段结合其靶标。所述EM可包含与SEQ ID NO: 3的残基20-39 (SVLQCLATGNWNSVPPECQA)对应的氨基酸序列。所述EM可以多种不同的形式提供。所述EM可以与其靶选择蛋白相同的亲和カ结合mAB或其片段。所述EM可以小于其靶选择蛋白的亲和カ结合mAB或其片段，例如以在CM被切割时减少靶标-mAB结合中EM的干扰。所述mAB和EM可包含非天然存在的氨基酸序列。所述mAB和EM可为抗CD62P mAB或其片段的结合配偶体对，和选择蛋白例如CD62P或其衍生物的完整或部分胞外域，其充当所述mAB或其片段的结合配偶体。还可选择mAB或其片段和EM使其不是天然的结合配偶体。例如EM可为mAB或其片段的修饰的结合配偶体。 在该情况下，EM可包含氨基酸修饰，所述氨基酸修饰至少稍稍降低其对mAB结合的亲和カ和/或亲合力，使得在切割后，EM基本上或显著地并不干扰mAB-靶标的结合。或者，EM不能特异性结合mAB或其片段，而是经由非特异相互作用例如位阻干扰mAB-靶标的结合。EM可包含⑶62P的片段。此类片段可包含⑶62P的多至200个、例如多至150个、例如多至100个、例如多至75个、例如多至50个、例如多至25个、例如20个、例如19个、例如18个、例如17个、例如16个、例如15个、例如14个、例如13个、例如12个、例如11个、例如10个、例如9个、例如8个、例如7个、例如6个、例如5个、例如4个、例如3个、例如2个、例如I个氨基酸。这些片段可为氨基酸的単一连续区段。这些片段还可装配为许多以特定顺序结合到一起的氨基酸的短连续区段。所述片段还可与并不属于人CD62P的序列的氨基酸的任何其它连续区段组合。在一个实施方案中，此类片段可为⑶62P20-39。可按照通过实验表位作图法和计算表位作图法得到的结构信息设计EM候选物。这些实验方法包括诱变、X射线晶体学(XTal)、核磁共振(NMR)光谱学、氢氘交换质谱(HXMS)和各种竞争结合法例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、Biacore或荧光激活细胞分选术FACS法。所有这些方法已良好建立。EM候选物还可利用基于进化的筛选法例如噬菌体展示和细菌展示来鉴定。这些方法通过将编码此类肽的基因剪接至编码靶向外膜的噬菌体衣壳结构蛋白或细菌蛋白或装配至鞭毛和菌毛结构的蛋白的基因，来利用噬菌体颗粒的表面或细菌表面上外来(多)肽的展示。利用重组DNA技术，可构建噬菌体上提呈的数亿肽、蛋白变体、基因片段编码的蛋白或cDNA编码的蛋白的集合(所谓的展示文库)。一个众所周知的实例为FliTrx系统，其中肽作为大肠杆菌硫氧还蛋白的活性位点环内的限制性插入呈现，所述活性位点环进而被插入丰富的重复鞭毛蛋白FliC的表面暴露的区域中。然后抗体的结合特异性和特定表位的确定可通过将讨论中的展示法与利用例如磁性激活细胞分选术(MACS)或荧光激活细胞分选术(FACS)方法的选择和筛选程序组合来确定。这样可选择(多)肽作为基于讨论中的抗体或其片段的结合特异性的可活化构建体的表位基序候选物[參考文献Daugherty, P. S. (2007)用细菌工程改造的蛋白(Protein engineering withbacterial). Curr Opin Struct Biol 17: 474-80. Bratkovi , T. (2010)曬菌体展不的发展技术演变及其应用(Progress in phage display: evolution of the techniqueand its applications). Cellular and Molecular Life Sciences 67: 749-67]。通过所提及方法之一选择的EM候选物可进一步通过用一种或多种天然或非天然氨基酸改变和/或互换(多)肽的残基来最优化。这样可增加或减少讨论中的抗体或其片段的特异性和/或亲和力。这可用于设计反映例如药物组合物的最佳功能性和/或用法的基序与讨论中的抗体或其片段的特异结合模式。结合亲和力
本文术语“结合亲和力”用作两种分子(例如抗体或其片段和抗原)之间的非共价相互作用的强度的衡量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(固有活性)，并且可区别于“结合亲合力”(功能性亲和力)，其是指多价相互作用的强度。两种分子(例如抗体或其片段和抗原)之间通过单价相互作用的结合亲和力，可通过解离常数(Kd)的确定来定量。进而，Kd可通过检测复合体形成和解离的动力学(例如 通过SPR法(Biacore))来确定。与单价复合体的结合和解离对应的速率常数分别被称作结合速率常数ka (或kj和解离速率常数kd (或k。^)。Kd通过等式Kd = kd / ka与ka和kd相关。按照以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对给定抗原的结合亲和力的比较，可通过各个抗体/抗原复合体的Kd值的比较来进行。类似地，相互作用的特异性可通过目标相互作用(例如抗体和抗原之间特异的相互作用)的Kd值与非目标相互作用的Kd值的确定和比较来评价。典型地，抗体对靶标的Kd为抗体对其它非靶标分子例如环境中的不相关物质或伴随物质的Kd的1/2、优选1/5、更优选1/10。更优选地，所述Kd为对其它非靶标分子的Kd的1/50，例如 1/100 或 1/200 ;甚至更优选 1/500，例如 1/1000 或 1/10000。该解离常数的值可通过众所周知的方法直接确定，甚至对于复杂混合物可通过例如以下的方法计算出来，例如Caceci等(Byte 9:340-362, 1984)中所述的那些方法。例如，Kd可利用双滤膜硝化纤维素滤膜结合测定(例如由Wong和Lohman (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90, 5428-5432，1993)公开的方法)建立。评价配体例如抗体对靶标的结合能力的其它标准测定为本领域已知，包括例如ELISA、蛋白印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力还可通过本领域已知的标准测定例如表面等离振子共振(SPR)例如通过使用Biacore 系统来评价。可进行竞争结合测定，其中将抗体与靶标的结合与靶标被该靶标的另一种配体例如另一种抗体的结合进行比较。发生50%抑制的浓度被称作Ki。在理想条件下，Ki等于Kd。Ki值绝不会比Kd小，因此Ki的检测可便利地被取代以提供Kd的上限。本发明的抗体对其靶标可具有I X 10_7M或更少、I X 10_8M或更少、或I X10_9M或更少、或I X I(TkiM或更少、或I X I(T11M或更少、或I X 10_12M或更少的Kd。特异性结合其靶标的抗体可以高亲和力结合其靶标，换言之，表现出如上所述的低KD，并且可以较低亲和力结合其它的非靶标分子。例如，抗体可以I X KT6M或更多、更优选I X KT5M或更多、更优选I X 10_4M或更多、更优选I X 10_3M或更多、甚至更优选I X 10_2M或更多的Kd结合非靶标分子。本发明的抗体优选能够以以下亲和力结合其靶标，所述亲和力为其对另一种非靶标分子的结合亲和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或10000倍或更多。可切割基序
本发明的构建体的可切割基序(CM)可包含这样的氨基酸序列，其可作为蛋白酶(通常为胞外蛋白酶)的底物起作用。CM位于构建体中使得当在靶标存在的情况下，CM被切割剂切割(例如CM的蛋白酶底物被蛋白酶切割)导致形成被切割状态时，单克隆抗体或其片段结合其靶标，而在未切割状态中，在其靶标存在的情况下，单克隆抗体或其片段与其靶标的结合被表位基序(EM)抑制。应指出的是CM的氨基酸序列可与M重叠或包含于M中，使得当构建体处于未切割构象时，全部或部分CM促进单克隆抗体或其片段的互补位的“掩蔽”。如上所述，CM可基于位于与构建体的单克隆抗体或其片段的所需靶标相同的微环境的蛋白酶来选择。已知许多不同的条件，其中目标靶标与蛋白酶共定位，其中蛋白酶的底物为本领域已知的。例如，靶标组织可为活化的血小板。
因此，在选择构建体的mAB使得其能够结合靶标例如⑶62P时，合适的CM为包含可被以下蛋白酶切割的肽底物的CM，所述蛋白酶存在于损伤血管部位，特别是与完整血管相比以升高的水平存在于损伤血管部位。CM可为蛋白酶的切割位点，例如蛋白酶的活化肽，例如丝氨酸蛋白酶的活化肽。所述CM的长度可多至200个氨基酸，例如多至150个氨基酸，例如多至100个氨基酸，例如多至75个氨基酸，例如多至50个氨基酸，例如多至25个氨基酸，例如2-20个氨基酸，例如20个氨基酸，例如19个氨基酸，例如18个氨基酸，例如17个氨基酸，例如16个氨基酸，例如15个氨基酸，例如14个氨基酸，例如13个氨基酸，例如12个氨基酸，例如11个氨基酸，例如10个氨基酸，例如9个氨基酸，例如8个氨基酸，例如7个氨基酸，例如6个氨基酸，例如5个氨基酸，例如4个氨基酸，例如3个氨基酸，例如2个氨基酸。P1’可为选自A、G、I、L、S和T的氨基酸。所述CM的Pl可为选自R和K的氨基酸。在ー个特定的实施方案中，CM的Pl为R。在另ー个特定的实施方案中，CM的Pl为K。在一个实施方案中，CM的P1-P1’为RI0在另ー个实施方案中，CM的P1-P1’为RG。在第三个实施方案中，CM的P1-P1’为RT。在又一个实施方案中，CM的P1-P1’为RS。P2可为选自A、I、L和P的氨基酸。P3可为选自 A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和 V 的任何氨基酸。P4 可为选自 A、Q、G、I、L、F、W和V的氨基酸。CM可为血纤肽A(FpA)或其片段，例如与SEQ ID NO: 3的残基40-49 (DFLAEGGGVR)对应的氨基酸序列。CM可为血纤肽B(FpB)或其片段。CM可为因子V的活化肽。CM可为因子VII的活化肽。CM可为FVIII的活化肽。CM可为PARl的活化肽。CM可为PAR2的活化肽。切割齐U
依照本发明，切割剂可为任何蛋白酶，其在与本发明构建体的靶标相同的生物微环境中存在并有活性并且能够减少可切割基序。因此，所述蛋白酶可存在于活化的血小板或损伤血管附近。CM可被选自以下的酶切割凝血酶、因子Vila (FVIIa)、因子IXa (FIXa)、因子Xa (FXa)、因子XIa (FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、激肽释放酶、活化蛋白C (APC)、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。CM可被凝血酶切割。CM可被FVIIa切割。CM可被FIXa切割。CM可被FXa切割。CM可被FXIa切割。CM可被FXIIa切割。CM可被激肽释放酶切割。CM可被APC切割。CM可被纤溶酶切割。CM可被tPA切割。CM可被uPA切割。术语“蛋白酶”和“能够切割多肽的酶”在本文可互换使用，是指能够水解肽键的任何酶，例如活化的丝氨酸蛋白酶。编码候选构建体的核酸序列的产生
用于筛选法的候选构建体的产生可利用本领域已知的方法来实现。多肽展示、单链抗体展示、抗体展示和抗体片段展示为本领域熟知的方法。一般而言，选择在候选构建体文库中变化的构建体的元件(例如EM)用于随机化。文库中的候选构建体可完全随机化或者在其随机化方面有偏崎，例如通常在核苷酸/残基频率方面或在元件内的氨基酸的位置方面。至于“随机化的”意指在随机化氨基酸序列内任何给定位置上可提供任何遗传上可编码的氨基酸。待优化的构建体的元件的氨基酸序列还可部分随机化。例如构建体元件(例如候选表位基序)可部分随机化以便在选定位置提供仅一个氨基酸亚群(例如以在氨基酸序列的选定位置提供柔性接头、以提供具有所需特征(例如疏水的、极性的、带正电的、带负电的等)的氨基酸残基)。在另一个实例中，构建体元件(例如候选表位基序)可部分随 机化以便选择另外随机化氨基酸序列中的一个或多个残基并在构建体文库成员的群或亚群中保持不变。利用此类方法，可产生在待变化的元件的氨基酸序列长度之内具有氨基酸序列的多种不同的可能组合的候选构建体，从而提供随机化候选构建体的文库。因此，在一些实施方案中，候选构建体的文库可完全随机化，在待优化的元件的任何位置没有序列偏好或恒定。在其它的实施方案中，候选肽的文库有偏崎。换言之，序列内的一些位置或保持恒定，或选自有限数目的可能性。例如，在一个实施方案中，核苷酸或氨基酸残基在例如疏水氨基酸、亲水残基、立体偏崎(小或大)的残基、倾向于产生用于交联的半胱氨酸的限定种类内随机化。嵌合构建体的形成
DNA片段可根据本领域已知的常规技术连接。此类技术包括使用限制性内切酶以消化DNA片段、DNA聚合酶和核苷酸以填满粘性末端以形成平末端，使用碱性磷酸酶以避免非所需连接和使用连接酶以连接片段。本发明构建体的mAB或其片段、CM和EM可连接在一起以形成单一 DNA区段，或其本身可作为分离的区段保持。所述构建体可通过转化与可供用于选择的基因一起引入细胞中，其中所述构建体变得整合至宿主基因组中。通常，所述构建体为具有被宿主细胞识别的复制系统的载体的一部分。表达载体
用于产生本发明的构建体的表达载体包括载体例如质粒。一般而言,此类载体包含调控序列，其允许表达于多种类型的宿主中，包括但不限于原核生物、酵母、真菌、植物和高等真核生物。包含所需的编码序列和调控序列的合适的表达载体可利用本领域已知的重组DNA技术构建,许多所述技术描述于Sambrook,等，Molecular Cloning: A LaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N. Y. (1989)。本发明考虑的表达载体可为Durocher,Y.等，(2002) Nucleic Acid Res, 30:E9中所述的pTT载体。此类表达载体至少能够指导本发明的核酸的复制并优选指导本发明的核酸的表达。一类载体利用提供自主复制染色体外质粒的DNA元件，其来源于动物病毒(例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40病毒)。第二类载体依靠所需基因序列整合至宿主细胞染色体中。本发明可用的表达载体包括控制主题DNA序列的复制和表达的序列。典型地，所述表达载体包含复制起点、位于待表达DNA序列的5’ (即上游)的启动子和转录终止序列。合适的复制起点包括例如Col EUSV40病毒和M13复制起点。合适的终止序列包括例如牛生长激素、SV40、lac Z和苜 蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)多面体多腺苷酸化信号。合适的启动子包括例如免疫球蛋白H链启动子、巨细胞病毒启动子、lac Z启动子、gal10启动子和AcMNPV多面体启动子。表达载体还可包括用于所需产物的优化表达的其它调节序列。此类序列包括稳定性前导序列，其提供表达产物的稳定性；分泌型前导序列，其提供表达产物的分泌；增强子，其上调DNA序列的表达；以及限制性内切酶识别序列，其为限制性内切核酸酶的切割提供位点。所有这些物质为本领域所已知并市售。參见例如Okayama, Mol. Cell. Biol. , 3280 (1983)。合适的表达载体还可包括标记序列，其允许转化的宿主细胞的表型选择。此类标记可提供营养缺陷型宿主的原养型、杀生物剂抗性(例如抗生素抗性)等。选择标记基因可直接与待表达的DNA基因序列连接，或通过共转染引入相同的细胞中。选择标记的实例包括新霉素、氨苄青霉素和潮霉素抗性。宿主细胞
本发明还涉及包含一种或多种表达载体例如质粒的宿主细胞,所述载体包含编码本发明的构建体的DNA序列。当利用与轻链表达载体一起的共转染时，可应用许多不同的原核和真核宿主细胞。合适的原核宿主细胞包括例如大肠杆菌菌株HB101、DH5a和XLl Blue。合适的真核宿主细胞包括例如昆虫细胞例如草地贪夜蛾{Spodoptem frugiperda)和真菌细胞例如巴斯德毕赤酵母iPichia pastor is)细胞和酿酒酵母i^BcchaxomycGS cerevisiae)细胞。其它合适的真核细胞为在体外生长于组织培养物中或动物中的哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可为免疫球蛋白蛋白分子提供翻译后修饰，包括正确的折叠或正确位点上的糖基化。优选的哺乳动物细胞系包括CHO (DUKX细胞(Urlaub和Chasin，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77:4216-4220，1980)、Hl 和 ATCC CCL 61 细胞系)、C0S-1 (ATCC CRL 1650)、幼仑鼠肾(BHK)和 HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham 等，I. Gen. Virol. 36:59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系为tk- tsl3 BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110，1982)，在下文称为 BHK 570 细胞。BHK 570 细胞系可以ATCC登录号CRL 10314获自美国典型培养物保藏所(American Type CultureCollection), 12301 Parklawn Dr. , Rockville, MD 20852 下。tkT tsl3 BHK 细胞系还可以登录号CRL 1632获自ATCC。此外，还可使用许多其它细胞系，包括Rat Hep I (大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)和 NCTC 1469 (ATCC CCL 9. I)细胞。可表达本发明的构建体的细胞可通过以下方法分离FACS、免疫层析或者当可检测的标记有磁性时通过磁性分离。作为分离的结果，细胞群富含表现出所需特征的构建体，例如在其切割后表现出结合选择蛋白例如CD62P的构建体，或者在无切割时具有减少的或无可检测的与靶标的结合的构建体。已结合可检测标记的靶标的候选构建体的选择可利用本领域已知的多种技术实现。例如流式细胞术(例如FACS(R))方法可用于从未标记的候选构建体中分选可检测标记的候选构建体。可实施流式细胞术以在候选构建体的群的分离中提供更多或更少严格性要求，例如通过修改门控以允许“更暗的”细胞群分离至第二群中用于进一步的筛选或要求“更亮的”细胞群以便分离至第二群中用于进一步的筛选。本发明的构建体的筛选方法
本公开内容提供了鉴定本发明的可活化构建体的方法。一般而言，方法包括将多种候选构建体与能够结合被切割的候选构建体的单克隆抗体或其片段的靶标，以及能够切割所述构建体的可切割基序的蛋白酶接触；选择当暴露于蛋白酶时结合靶标的第一群成员，将所述第一群在不存在蛋白酶的情况下与靶标接触，并从所述第一群中通过去除在不存在蛋白酶的情况下结合靶标的所述第一群成员来选择第二群成员，其中所述方法提供这样的候选构建体的选择，所述候选构建体在不存在蛋白酶的情况下表现出与在存在蛋白酶的情况 下的靶标结合相比减少的与靶标的结合。一般而言，用于筛选具有所需可活化表型的候选构建体的方法通过阳性筛选步骤(以鉴定暴露于蛋白酶后结合靶标的成员)和阴性筛选步骤(以鉴定当不暴露于蛋白酶时不结合靶标的成员)来实现。所述阴性筛选步骤可通过例如从群体中去除在不存在蛋白酶的情况下结合靶标的那些成员来实现。文库筛选方法可如下开始通过首先进行阴性筛选以选择在不存在蛋白酶的情况下不结合标记的靶标的候选物(换言之，当完整时不结合标记的靶标)，然后进行阳性筛选(即用蛋白酶处理并选择在被切割状态中结合标记靶标的那些成员)。适应症
本发明的构建体可用于减少损伤部位的炎症。此外，本发明的构建体可经工程改造使得其适于治疗凝血病。出于此目的，本发明的构建体可包含组织因子(SEQ ID NO: 11)或其功能性片段(SEQ ID NO: 13)。本文所用术语“凝血病”是指增加的出血倾向，其可由正常凝血级联的任何促凝血组分的任何定性或定量缺失引起，或由纤维蛋白溶解的任何上调引起。此类凝血病可为先天和/或获得性的和/或医源性的并且可由临床医师鉴定。先天性低凝血病(congenital hypocoagulopathy)的非限定性实例为A型血友病、B型血友病、因子vn缺乏症、因子Xi缺乏症、冯维勒布兰德病和血小板减少症例如Glanzmann血小板机能不全(Glanzmann’ s thombasthenia)和伯-索综合征(Bernard-Soulier syndrome)。获得性凝血病的非限定性实例为由维生素K缺乏引起的丝氨酸蛋白酶缺乏；此类维生素K缺乏可由维生素K拮抗剂例如华法林的给予引起。获得性凝血病还可发生在大范围外伤后。在另外称为“血性恶性循环(bloody vicious cycle) ”的该情况下，其特征为血稀释(稀释的血小板病和凝固因子的稀释)、低体温、凝固因子的消耗和代谢紊乱(酸中毒)。液体疗法和增加的纤维蛋白溶解可使该情况恶化。所述出血可来自身体的任何部分。含“抑制物”(即针对因子VIII的同种抗体)的A型血友病和含“抑制物”(即针对因子IX的同种抗体)的B型血友病为部分先天和部分获得性的凝血病的非限制性实例。医源性凝血病的非限制性实例为过量使用抗凝血剂药物例如肝素、阿司匹林、华法林和其它血小板聚集抑制剂，其可开处方以治疗血栓栓塞性疾病。医源性凝血病的第二个非限制性实例为由过量和/或不适当的液体疗法诱导的凝血病，例如可由输血诱导的凝血病。在本发明的一个实施方案中，出血与A型血友病或B型血友病相关。在另ー个实施方案中，出血与含获得性抑制物的A型血友病或B型血友病相关。在另ー个实施方案中，出血与血小板减少症相关。在另ー个实施方案中，出血与冯维勒布兰德病相关。在另ー个实施方案中，出血与严重的组织损伤相关。在另ー个实施方案中，出血与严重外伤相关。在另一个实施方案中，出血与手术相关。在另ー个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎相关。在另ー个实施方案中，出血为例如在胎盘早剥中的血崩。在另ー个实施方案中，出血发生在具有机械出血的有限可能性的器官中，例如颅内、耳内或眼内。在另ー个实施方案中，出血与抗凝血治疗相关。使用本发明的所述单克隆抗体可显著減少失血。使用本发明的所述单克隆抗体可显著減少出血时间。 治疗
本文所用术语“治疗”是指有需要的任何人或其它动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历了医师或兽医的身体检查，所述医师或兽医已给出了假定或确定的诊断，该诊断提示所述特异治疗的使用对所述人或其它动物受试者的健康是有益的。所述治疗的时限和目的可依据受试者的健康的现状，随不同个体而变化。因此，所述治疗可为预防性的、减轻性的、针对症状的和/或治愈性的。依照本发明，预防性的、减轻性的、针对症状的和/或治愈性的治疗可表示本发明的单独的方面。因此，本发明的构建体可胃肠外给予。本发明的构建体可静脉内给予。本发明的构建体可肌内给予。本发明的构建体可皮下给予。本发明的构建体可预防性给予。本发明的构建体可治疗性给予(需要时)。实施方案
以下为本发明的实施方案的非限制性列表
I.一种构建体，其包含(i)单克隆抗体或其片段、(ii)可切割基序和(iii)包含(i)或其变体的表位基序的多肽序列。2.实施方案I的构建体，所述构建体还包含组织因子或其生物学上有功能的变体或片段。3.实施方案1-2中任一个的构建体，其中所述完整的单克隆抗体或其片段能够结合细胞上的受体，所述细胞选自活化的血小板、活化的内皮细胞和白细胞。4.实施方案1-3中任一个的构建体，其中所述完整的单克隆抗体或其片段能够结合活化的血小板上的受体。5.实施方案1-4中任一个的构建体，其中所述完整的单克隆抗体或其片段不能结合静息的血小板上的受体。6.实施方案1-5中任一个的构建体，其中所述完整的单克隆抗体或其片段能够结合活化的内皮细胞上的受体。7.实施方案3-6中任一个的构建体，其中所述受体为选择蛋白。8.实施方案3或7中任一个的构建体，其中所述受体为E-选择蛋白、P-选择蛋白或L-选择蛋白。9.实施方案8的构建体，其中所述选择蛋白为⑶62P。10.实施方案1-9中任一个的构建体，其中所述可切割基序的C端与所述单克隆抗体或其片段的重链的N端共价连接。11.实施方案1-10中任一个的构建体，其中所述可切割基序的C端与所述单克隆抗体或其片段的轻链的N端共价连接。12.实施方案1-11中任一个的构建体，其中所述可切割基序的Pl可为选自R和K的氨基酸。 13.实施方案1-12中任一个的构建体，其中所述可切割基序为蛋白酶的切割位点。14.实施方案13的构建体，其中所述可切割基序为蛋白酶的活化肽。15.实施方案14的构建体，其中所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。16.实施方案12-15中任一个的构建体，其中所述可切割基序可被选自以下的酶切割凝血酶、因子Vila (FVIIa)、因子IXa (FIXa)、因子Xa (FXa)、因子XIa (FXIa)、因子XIIa (FXIIa)、激肽释放酶、活化蛋白C (APC)、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。17.实施方案12-16中任一个的构建体，其中所述可切割基序的长度为约2-20的氨基酸，例如20个氨基酸、例如19个氨基酸、例如18个氨基酸、例如17个氨基酸、例如16个氨基酸、例如15个氨基酸、例如14个氨基酸、例如13个氨基酸、例如12个氨基酸、例如11个氨基酸、例如10个氨基酸、例如9个氨基酸、例如8个氨基酸、例如7个氨基酸、例如6个氨基酸、例如5个氨基酸、例如4个氨基酸、例如3个氨基酸、例如2个氨基酸。18.实施方案15-17中任一个的构建体，其中P2可为选自A、I、L和P的氨基酸。19.实施方案15-18中任一个的构建体，其中P2可为选自A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V的任何氨基酸。20.实施方案15-19中任一个的构建体，其中P4可为选自A、Q、G、I、L、F、W和V
的氨基酸。21.实施方案15-20中任一个的构建体，其中P1’可为选自A、G、I、L、S和T的氨基酸。22.实施方案14的构建体，其中所述可切割基序为血纤肽A (FpA)或其片段，例如与SEQ ID NO: 3的残基40-49 (DFLAEGGGVR)对应的氨基酸序列。23.实施方案22的构建体，其中所述可切割基序的Pl为R。24.实施方案22-23中任一个的构建体，其中所述可切割基序的P1-P1’为RI。25.实施方案22-24中任一个的构建体，其中所述可切割基序的P1-P1’为RG。26.实施方案14的构建体，其中所述可切割基序为血纤肽B (FpB)或其片段。27.实施方案26的构建体，其中所述可切割基序的Pl为R。28.实施方案26-27中任一个的构建体，其中所述可切割基序的P1-P1’为RG。29.实施方案14的构建体，其中所述可切割基序为因子V的活化肽。30.实施方案29的构建体，其中所述可切割基序的Pl为R。31.实施方案29-30中任一个的构建体，其中所述可切割基序的P1-P1’为RT。
32.实施方案29-31中任一个的构建体，其中所述可切割基序的P1-P1’为RS。33.实施方案15的构建体，其中所述可切割基序为因子VII的活化肽。34.实施方案33的构建体，其中所述可切割基序的Pl为R。35.实施方案33-34中任一个的构建体，其中所述可切割基序的Pl为K。36.实施方案14的构建体，其中所述可切割基序为FVIII的活化肽。37.实施方案36的构建体，其中所述可切割基序的Pl为R。38.实施方案14的构建体，其中所述可切割基序为PARl的活化肽。39.实施方案38的构建体，其中所述可切割基序的Pl为R。

40.实施方案38-39中任一个的构建体，其中所述可切割基序的P1-P1’为RS。41.实施方案14的构建体，其中所述可切割基序为PAR2的活化肽。42.实施方案41的构建体，其中所述可切割基序的Pl为R。43.实施方案41-42中任一个的构建体，其中所述可切割基序的P1-P1’为RS。44.实施方案1-43中任一个的构建体，其中所述表位基序的C端与所述可切割基序的N端共价连接。45.实施方案44的构建体，其中所述表位基序还与单克隆抗体或其片段共价连接。46.实施方案1-45中任一个的构建体，其中所述表位基序包含与所述单克隆抗体或其片段的CDR区相互作用的靶受体的ー个或多个残基。47.实施方案46的构建体，其中所述表位基序是线性的。48.实施方案46的构建体，其中所述表位基序是结构表位的线性装配体。49.实施方案1-48中任一个的构建体，其中如可通过结合相互作用分析(例如实施例4和5中所述的分析)检测的，所述表位基序阻止所述单克隆抗体或其片段结合其靶标。50.实施方案49的构建体，其中所述表位基序包含与SEQ ID NO: 3的残基20-39(SVLQCLATGNWNSVPPECQA)对应的氨基酸序列。51.实施方案1-50中任一个的构建体，其中如可利用荧光激活细胞分选术(FACS)分析(例如实施例4中所述的分析)检测的，所述单克隆抗体或其片段可在所述可切割基序被切割时结合其靶标。52.实施方案1-51中任一个的构建体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO: 8。53.实施方案1-52中任一个的构建体，其中所述单克隆抗体包含SEQ ID NO: 9。54.ー种多核苷酸,其编码实施方案1-53中任一个的构建体。55.ー种载体，其包含实施方案54的多核苷酸。56.ー种质粒,其包含实施方案54的多核苷酸。57.一种分离的细胞，其包含实施方案54的多核苷酸。58.一种分离的细胞，其包含实施方案55的载体。59.一种分离的细胞，其包含实施方案56的质粒。60.实施方案59的分离的细胞，其中所述细胞是真核细胞。61.实施方案60的真核细胞，其为哺乳动物。62.实施方案61的哺乳动物细胞，其选自CHO细胞、BHK细胞和HEK细胞。
63.实施方案57-62中任一个的细胞，其能够表达实施方案1-53中任一个的构建体。64. 一种药物组合物，其包含实施方案1-53中任一个的构建体和药学上可接受的载体。65.实施方案1-53中任一个的构建体在治疗有需要的受试者中与血管破裂相关的并存病即出血和炎症中的用途。66.实施方案1-53中任一个的构建体在治疗凝血病中的用途。67.实施方案1-53中任一个的构建体在抑制动脉硬化性泡沫细胞的增殖中的用途。
68.实施方案1-53中任一个的构建体在治疗炎症中的用途。69.实施方案1-53中任一个的构建体在预防恶性增殖细胞的转移中的用途。70. 一种治疗与血管破裂相关的并存病特别是出血和炎症的方法，所述方法通过给予有需要的受试者实施方案1-53中任一个的构建体来进行。71. 一种治疗凝血病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者实施方案1-53中任一个的构建体。72. 一种治疗炎症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者实施方案1-53中任一个的构建体。73. 一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者实施方案1-53中任一个的构建体。通过以下实施例进一步地阐述本发明，以下实施例不应理解为限制保护的范围。之前描述和以下实施例中公开的特征既可单独地又可以其任何组合作为用于以其多种形式实现本发明的材料。
实施例实施例I :编码EP-FdA-抗CD62P HC、抗CD62P HC和抗CD62 LC的表汰构津体的遞
抗CD62P mAb的LC和HC可变域的氨基酸序列(命名为PBl. 3 HC-V和PBl. 3LC-V)连同PBl. 3结合表位的氨基酸序列(命名为EP)获自美国专利5，800, 815。凝血酶可切割接头的氨基酸序列(命名为FpA)基于人纤维蛋白原a链中的凝血酶切割位点的氨基酸序列(检索自公用数据库)。编码I) EP-FpA-PBl. 3 HC_V、2) PBl. 3 HC-V或编码 3) PBl. 3 LC-V 的 DNA序列在外面的CRO，Geneart Inc, CA, USA合成。制备出如下的DNA序列，其包含5’端HindIII位点(AAGCTT)和紧接起始甲硫氨酸的5’端的kozak序列(GCCGCCACC)，并且对于包含HC-V的序列包含符合读框的3’端NheI位点(GCTAGC)，对于PBl. 3 LC-V序列包含符合读框的3，端 BsiffI 位点(CGTACG)(图 1A、图 IB 和图 1C)。包含 PBl. 3 HC-V 的 DNA 序列(I 和 2)用HindIII和NheI消化并插入基于pTT的表达载体的HindIII和NheI位点中，该表达载体包含人IgG4 CHl-铰链-CH2-CH3序列。所得载体分别命名为pTT_EP-FpA-PBl. 3 HC和pTT-PBl. 3 HC (图2A和图2B)。PBl. 3 LC-V DNA序列用HindIII和BsiWI消化并插入基于PTT的表达载体的HindIII和BsiWI位点中，该表达载体包含人LC k恒定序列。所得载体命名为 pTT-PBl. 3 LC (图 2C)。pIT 载体基本上描述于 Durocher, Y.等，(2002) NucleicAcid Res, 30: E9。利用以下质粒组合建立两种瞬时共转染实验1) pTT-PBl. 3 LC +pTT-EP-FpA-PBl. 3 HC 和 2) pTT-PBl. 3 LC + pTT-PBl. 3 HC。在各转染实验中，质粒以近似等摩尔比共转染。HEK293-6E细胞生长于补充了 1% P/S (GIBC0目录号15140-122)、0. I % pluronic (GIBC0,目录号 24040-032)和 25 ug/mL 遗传霉素(GIBC0，目录号 10131-019)的 Freestyle HEK293 培养基(GIBC0，目录号 12338-018)并将细胞用293fectin (Invitrogen,目录号12347-019)以I X 106/mL的细胞密度转染。对于姆升HEK293-6E细胞，转染通过将I mg质粒DNA稀释至30 mL Optimem (稀释液A)中并通过将 I mL 293fectin 稀释至 30 mL Optimem (GIBC0,目录号 51985-026，稀释液 B)中来进行。将稀释液A和稀释液B混合并在室温孵育30分钟。之后将转染混合物加入HEK293-6E细胞中并将细胞在37°C下孵育于具有定轨旋转(125 rpm)的增湿培养箱中。转染后五天，通过离心去除细胞并将分别包含EP-FpA-PBl. 3 mAb和PBl. 3 mAb的两种所得细胞培养上清液在纯化前无菌过滤。
实施例2 EP-FpA-PBI. 3 mAb构律体和PBl. 3 mAb构律体的純化
mAb构建体EP-FpA-PBl. 3 mAb和PBl. 3的蛋白纯化利用基于蛋白A的亲和树脂MabSelect SuRe (GE Healthcare,目录号 17-5438)进行。树脂填充在 Tricornl0/100柱中至约8 ml的柱床体积。纯化利用Akta Explorer层析系统(GE Healthcare,目录号18-1112-41)进行。用于纯化步骤的缓冲液系统为由20 mM磷酸钠、150 mM NaCl, pH 7.2组成的平衡缓冲液和10 mM甲酸，pH 3. 5组成的洗脱缓冲液。将无菌过滤的细胞培养上清液不作任何调节直接上样于预平衡的MabSelect Sure柱中。将柱用10个柱体积的平衡缓冲液洗涤，并用约I. 5个柱体积的洗脱缓冲液等度洗脱蛋白。根据UV280监控，制备包含洗脱蛋白的流分的合并物并用SDS-PAGE/考马斯、高压液相色谱和基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析来分析。两种制备