专利名称：沉默调节蛋白活化剂和活化测定的制作方法沉默调节蛋白活化剂和活化测定基因的沉默信息调节剂(Silent Information Regulator, SIR)家族代表存在于范围从古细菌(archaebacteria)至真核生物的生物体的基因组中的高度保守性ー组基因。编码的SIR蛋白质涉及从基因沉默的调节至DNA修复的各种不同程序。由SIR基因家族成员编码的蛋白质显示在250氨基酸核心结构域中有高度序列保守。此家族中已相当特征化的基因为酿酒酵母SIR2(S. cerevisiae SIR2)，其涉及含有指定酵母交配型、端粒位置效应及细胞老化的信息的沉默HM基因座。酵母Sir2蛋白质属于组蛋白脱こ酰基酶的家族。于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中的Sir2同系物，CobB,起到NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)-依赖性ADP-核糖基转移酶的作用。Sir2蛋白为使用NAD+作为协同底物的第III类脱こ酰基酶。不同于其它脱こ酰 基酶，这些中的许多涉及基因沉默，Sir2对第I类及第II类组蛋白脱こ酰基酶抑制剂，例如曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)不具敏感性。通过Sir2进行的こ酰基-赖氨酸的脱こ酰基化,与NAD+水解作用紧密结合，产生烟酰胺与新的こ酰基-ADP核糖化合物。Sir2的NAD+-依赖性脱こ酰基酶活性对于将其生物学作用与酵母中的细胞代谢作用结合这一功能而言是必需的。哺乳动物Sir2同系物具有NAD+-依赖性组蛋白脱こ酰基酶活性。生物化学的研究已显示，Sir2可容易地将组蛋白H3与H4的氨基末端尾部脱こ酰基化，导致形成1-0-こ酰基-ADP-核糖与烟酰胺。具有另外SIR2拷贝的菌株显示其rDNA沉默增加且寿命增长30%。最近已显示，秀丽隐杆线虫(C. elegans) SIR2同系物(sir-2. I)及果蝇(D. melanogaster) dSir2基因的另外拷贝会大大延长这些生物体的寿命。这暗示了，针对老化的SIR2-依赖性调节途径，其在演化早期已出现且已经是相当保守的(conserve)。现今，Sir2基因据相信已经演化以增强生物体的健康与抗应激反应,来增加其逆境存活(surviving adversity)的机会。在人中有7种Sir2-类基因(SIRT1-SI RT7)，它们共享Sir2保守催化结构域。SIRTl为具有与Sir2最高程度序列相似性的核蛋白。SIRTl通过脱こ酰化作用调节多重细胞靶物，包括肿瘤抑制基因P53、细胞信号传导因子NF-kB和F0X0转录因子。SIRT3为SIRTl的同系物，其在原核生物与真核生物中具保守性。SIRT3蛋白通过位于N-末端的独特结构域祀向至线粒体嵴(cristae)。SIRT3具有NAD+-依赖性蛋白质脱こ酰基酶活性，且被普遍地(upbiquitously)表达在，特别是在代谢活性的组织中。在转移至线粒体时，认为SIRT3被线粒体基质加工肽酶(MPP)裂解成更小的活性形式。已知摄热量限制(caloric restriction)有70年以上，以增进健康并延长哺乳动物的寿命。酵母(如后生动物)的寿命也通过类似摄热量限制(例如低葡萄糖)的介入来增长。发现缺乏SIR2基因的酵母与蝇类在经摄热量限制时都不再存活，这为SIR2基因介导此类限制热量的饮食有益健康功效提供了证据。而且，降低酵母葡萄糖-响应性cAMP(腺苷3’，5’ -单磷酸)-依赖性(PKA)途径活性的突变，会延长野生型细胞的寿命，但在突变型sir2菌株中则不会延长，这证明SIR2可能是摄热量限制途径的关键下游组分。另外，经过在小鼠中基因缺失或过度表达的研究(其中进行了 SIRTl蛋白和活性水平的研究)已经验证了在几种疾病模型中升高的SIRTl活性的有益效果，所述疾病模型包括涉及代谢性应激的那些(Haigis,M. C.,和Sinclair, D. (2010) Annu Rev Pathol5,253-259 ；Baur, J. A. (2010) Mech Aging Dev)。最近也在人中观察到该效果，其中在胰岛素-敏感的组织中降低的SIRTl表达与能量消耗的降低有关(Rutanen等，(2010)Diabetes)。因此，对于许多其中认为SIRTl起作用的疾病，预期治疗效果根据给药该酶的脱こ酰基酶活性的活化剂得到。在过去几年内，已经开发了 SIRTl激活化合物(STAC)，包括白藜芦醇和更特异的，化学上不同的分子(Milne等，(2007)Nature 450,712-716 ；Bemis 等，(2009) Bioorg Med Chem Lett 19，2350-2353 ;Vu 等，(2009) J. Med. Chem.)。当在这些疾病的基于细胞的和动物模型中测试吋，STAC产生与该酶的直接活化一致的效果(MiIne 等，(2007) Nature 450, 712-716 ;Feige 等，(2008) Cell Metab 8, 347-358 ;Funk 等，J Pharmacol Exp Ther ;Jin 等,(2009)Protein Sci 18，514-525 ;Liu 等,(2008)Nature 456，269-273 ;Smith 等，(2009)BMC Syst Biol 3，31 ;Yamazaki 等，(2009) Am J PhysiolEndocrinol Metab ;Yoshizaki 等，(2009)Mol Cell Biol 29,1363-1374)。在分子水平，关于这些化合物加速SIRTl-催化的脱こ酰基化的机理仍需大量探索。一个感兴趣的方面为根据肽底物的结构特征的活化。该SIRTl活化方面首先发现于2005，当时两篇文章报道白藜芦醇可以激活SIRTl-催化的Ac-Arg-His-Lys-LySAe-AMC的脱こ酰基化，但不是该肽的简单酰胺或酸(见Howitz 等，(2003) Nature 425，19ト 196 ;Borra 等，(2005) J. Biol. Chem. 280, 17187-17195 ；Kaeberlein 等，(2005) J. Biol. Chem. 280，17038-17045)。最近，白藜芦醇的结果得以确证(Beher 等,(2009)Chem BiolDrug Des),而且被 Pacholec 等进一步扩展(Pacholec等，(2010) J. Biol. Chem. 285,8340-8351)至包括三种之前报道的 STAC SRT1460, SRT1720和 SRT2183，其最初被 Milne 等((2007) Nature 450,712-716)公开(见图 I)。Pacholec等((2010)J. Biol. Chem. 285，8340-8351)使用几种こ酰基化的肽底物研究了 SIRTl的STAC-介导的活化，包括Milne等((2007) Nature 450,712-716)使用的TAMRA-标记的20mer (TAMRA-肽；该肽底物和其它肽底物的结构详见表3)，以及SIRTl的两种蛋白底物。该研究的主要观察为(i) TAMRA-标记物的存在对活化是必要的，因为用未修饰的肽或蛋白底物未观察到活化，(ii)SRT1460和SRT1720可以结合至TAMRA-肽上，以及(iii)SRT1460与SIRTl = TAMRA-肽复合物相互作用。这些观察使得该作者得出结论，通过STAC的SIRTl活化必须经过涉及活化剂与TAMRA-肽之间形成复合物的“间接”机理。尽管Pacholec等没有提出具体的机理假说，但SIRTl的活化假定来自该复合物的SIRTl-催化转化的有利动力学。该建议示于图2A中的原理图中，其被称为‘通过底物增强活化’。需要图2A的机理建议的彻底分析，以确定是否可以解释STAC-介导的SIRTl活化。本发明提供了沉默调节蛋白激活化合物的作用机理的更好理解，其证明了通过底物增强活化的间接机理不足以解释通过STAC活化SIRT1。尤其是，虽然图2A的机理建议需要STAC的活化有效性与其底物亲和カ之间存在联系，但是并不存在所述联系。另外，一些STAC显示出可以结合至游离的SIRT1。该结合并非受图2A的机理调节。最后，STAC活化SIRTl的数据集不能成功地符合图2A的机理的速率规律。总之，这些结果指出，通过底物增强活化的间接机理不足以解释通过STAC活化SIRT1。因此，需要更好地理解沉默调节蛋白激活化合物的作用机理，以更好地理解沉默调节蛋白功能并对新的活化剂化合物开发增强的筛选。概述本发明部分地基于发现沉默调节蛋白底物结构的独特特征，其确定了 SIRTl活化剂化合物(STAC)沉默调节蛋白酶活化的特征。尤其是，ー些STAC可以加速TAMRA-肽类似物(其不含TAMRA荧光基团(即，desTAMRA-肽)但含有其它大基团(例如生物素))，以及含有一些未标记的肽(仅包括天然氨基酸(例如，Ac-Arg-His-Lys-LysAc-Phe和Ac-Arg-His-Lys-Lysik-Trp),而不含其它肽(例如，Ac-Arg-His-Lys-Lysik-Ala))的脱こ酰基化。因此，本发明提供不含荧光基团的肽、多肽和蛋白底物，其包括“活化辅因子”部分，例如吲哚(Trp)或苯基(Phe)，或携帯活化辅因子的辅助蛋白，例如DBCl(乳腺癌缺失基因 I (deleted in breast cancer I))、HICl (癌症过度甲基化基因 I (hypermethylatedin cancer I))、AROS (SIRT1 的活性调节剂)或 CLOCK (Hirayma 等，(2007) Nature450:1086-90 ；Sassone-Corsi 等，(2008) Cell 134，329-340)，以及提供使用这些底物检测 激活沉默调节蛋白脱こ酰基酶(例如SIRT1)活性的化合物的有关方法。本发明还提供一些新的STAC化合物，其可激活不含荧光基团的活化底物。另外，本发明提供新的SIRTl活化剂化合物、其盐，以及有关的药物组合物。一方面，本发明提供检测在体外激活沉默调节蛋白脱こ酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性的化合物的方法。所述方法包括将所述沉默调节蛋白脱こ酰基酶与候选化合物和不含荧光基团的活化底物(例如所述沉默调节蛋白的こ酰基化的肽、多肽或蛋白底物)接触的步骤，然后检测在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱こ酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性的水平。然后将在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱こ酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性的水平与不存在候选化合物时沉默调节蛋白脱こ酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平进行比较。因此，与不存在候选化合物时沉默调节蛋白脱こ酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平相比，在候选化合物的存在下沉默调节蛋白脱こ酰基酶对不含荧光基团的活化底物的活性水平増加表示，所述化合物为沉默调节蛋白活化剂。在优选的实施方式中，所述不含荧光基团的こ酰基化的肽、多肽或蛋白在赖氨酸残基的ε氨基上被こ酰基化。在一些优选的实施方式中，用于本发明的方法的沉默调节蛋白脱こ酰基酶为SIRTl0在其它实施方式中，所述沉默调节蛋白脱こ酰基酶为SIRT2、SIRT3、SIRT4或SIRT5。在中，所述候选化合物为含有荧光基团的肽底物(例如，TAMRA-肽Ac-eekは*素)gqstsshskAcnie-STEGK(5ィ腿)ee-nh2)的 sirti 活化剂。在优选的实施方式中，在NAD+的存在下将所述沉默调节蛋白脱こ酰基酶与不含荧光基团的活化底物和候选化合物接触。在其它实施方式中，在可水解的NAD+类似物的存在下将所述沉默调节蛋白脱こ酰基酶与不含荧光基团的活化底物和候选化合物接触。在一些优选的实施方式中，通过测量不含荧光基团的活化底物脱こ酰基化的速率检测沉默调节蛋白脱こ酰基酶的活性水平。在其它实施方式中，通过测量NAD+水解速率检测沉默调节蛋白脱こ酰基酶的活性水平。在其它实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物为生物素化的多肽。在优选的实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物为こ酰基化的肽或多肽，其不含荧光基团TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)和AMC(7-氨基(amido)-4-甲基香豆素)。在中，所述不含荧光基团的活化底物为こ酰基化的desTAMRA-肽Ac-EEKは4GQSTSSHSKAeNleSTEGKEE-NH2。在其它实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物为こ酰基化的肽，其选自Ac-RHKKaT-NH2和Ac-RHKKAc;W-NH2。在其它实施方式中，用于上述的本发明方法的不含荧光基团的活化底物包括沉默调节蛋白的こ酰基化的肽、多肽或蛋白底物以及携帯活化辅因子的辅助蛋白或配体。例如，所述携带活化辅因子的辅助蛋白可为DBCl (乳腺癌缺失基因I)蛋白、HICl (癌症过度甲基化基因I)蛋白、AROS(SIRT1的活化调节剂)蛋白或CLOCK和/或BMAL蛋白。在中，所述こ酰基化的蛋白为组蛋白Hl、组蛋白 H3、组蛋白 H4、p53、p300、F0X0 UFOXO 3a、FOXO 4、p65、HIVTat、PGC-1 α、PCAF、MyoD、PPARy 或 Ku70。在本发明方法的一些实施方式中，所述化合物为不含荧光基团的活化底物的SIRTl脱こ酰基化的活化剂。在具体的实施方式中，所述不含荧光基团的活化底物的SIRTl脱こ酰基化的活化剂具有下式(XL)的结构·

本发明提供检测在体外激活沉默调节蛋白脱乙酰基酶对不含荧光基团的活化底物活性的化合物的方法和组合物。还提供式(I)至式(XXI)的沉默调节蛋白调节化合物以及相关化合物(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)，包括式(XL)、(XI)、(XII)和(XIII)的不含荧光基团的底物SIRT1活化剂化合物。