专利名称：偶联因子6抑制剂和活化剂及其用途的制作方法 经由花生四烯酸级联反应产生的前列腺素(PG)、凝血噁烷(TX)和白三烯(LT)那样的前列腺素类(激素)是维持生物体恒定性的必要的生理活性物质。作为前列腺素类(激素)一员的前列腺环素(PGI2)是在PGI2合成酶作用下由前列腺素H2(PGH2)生成的，而PGH2是在血管内皮细胞内经环加氧酶、PGH2合成酶催化由花生四烯酸生成的。已知该PGI2的药理作用有如下几个方面(1)PGI2与膜上的受体结合，通过使腺苷酸环化酶激活，生成cAMP，表现出血小板凝集抑制作用、血管扩张作用(中田等人著，药局501365-1373、1999)，(2)PGI2在由血管内皮损伤引起的血栓形成中起着重要的作用(Murata、T.et al.Nature 388678-682、1997)，(3)PGI2是引起炎症浮肿的主要的前列腺素类(激素)(Murata、T.etal.Nature 388678-682、1997)。因此，确定PGI2的生物合成途径和参与合成的酶(花生四烯酸级联反应)，PGI2的生理活性作用能够做到某种程度的判断。然而有关疾病中抑制PGI2生成的机制还不清楚。关于抑制PGI2的生成通过使用高血压自然发病大鼠(SHR)的实验表明，在SHR内存在内原性抑制PGI2生成的物质(Osanai、T.et al.Jpn.Circ.J.54、507-514、1990、Falardeau、P.et al.Prostaglandins、29、621-628、1985)。有关该内原性抑制PGI2生成的物质的研究虽然还不充分，但本发明人成功地从SHR的心脏中分离纯化出了抑制SHR肠膜平滑肌细胞分泌PGI2的因子。而且确定了它的结构，阐明了该因子为CF6(以后记为rCF6)，是输送H+的ATP合成酶的一个亚基(参考例1)。哺乳类的输送H+的ATP合成酶存在于线粒体内膜，至少由14个亚基组成。CF6是该酶的一个亚基，由76个氨基酸组成。CF6是以在N末端附加了含有线粒体移动序列的32个氨基酸的肽合成的(Higuchi、T.etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.178 793-799、1991)。到目前为止，本发明人确立了使通过因子Xa能够切出rCF6的嵌合蛋白质以大肠杆菌为宿主表达，然后从嵌合蛋白质中切出rCF6，进行纯化的方法(参考例2)。另外本发明人弄清楚了由CF6引起的抑制PGI2生成的作用点是抑制PLA2(参考例3)、特别是抑制cPLA2(参考例4)(Osanai、T.et al.J.Biol.Chem.273、31778-31783、1998)。然而作为细胞内的肽CF6与疾病的关系完全不清楚，CF6在体内对血管内皮作用的状态、即是否存在于血液中也不清楚。关于cPLA2的功能已经了解到(Bonventre JV、T.et al.Nature390622-625、1997)(1)cPLA2对作为花生四烯酸级联反应的炎症介体的前列腺素E2、白三烯B4、白三烯C4的产生是必需的，(2)缺失该酶的小鼠，中大脑动脉的瞬间结扎后的梗塞区域变小，脑的浮肿和神经欠落也减少。从这些功能可以推测到抑制cPLA2的药可以成为有效的炎症治疗药和脑梗塞等的治疗药，但还没有找到有效的治疗药、以及基于抑制CF6作用的抑制cPLA2的药的筛选方法。
因此，关于花生四烯酸级联反应中的PGI2的生物合成和生理作用、cPLA2的生理作用、以及PGI2和cPLA2与CF6的关系正逐渐被阐明。然而，与处于花生四烯酸级联反应末端的称之为PGI2因子和位于开头的cPLA2因子有关的疾病的起因的阐明还没有进展。
发明的公开本发明人已经清楚了大鼠和人血液中存在CF6，CF6是由血管内皮细胞产生的。还弄清楚了PGI2不足引起的高血压中，随着血压的上升，血中的rCF6浓度也随着增加，在该状态下，如果给予rCF6，血压会上升，而在rCF6浓度高的高血压状态下，抗rCF6抗体表现出降压作用。另外，获得了在人急性心肌梗塞时，血中CF6浓度上升，在人患病时血中CF6浓度也有变化的资料，直至本发明完成。
本发明涉及鉴于上述那样的实际状况，通过调节CF6的血中浓度，对于血液中的CF6量的变化引起的疾病、PGI2的过剩或不足的疾病，以及cPLA2作用亢进或减弱的疾病的预防药或治疗药，以及对于判断这些疾病的发病、进展的诊断方法和诊断助剂。
就是说，本发明可以提供以象CF6、促进CF6分泌的物质以及CF6激动剂那样的CF6活化剂为有效成分，或以象抑制CF6分泌的物质以及CF6拮抗剂那样的CF6抑制剂为有效成分的治疗药，该药可作为CF6浓度增加或减少，PGI2浓度增加或减少的疾病，或cPLA2作用亢进或减弱的疾病的预防药或治疗药。另外还提供血中CF6浓度的测定方法以及CF6浓度增加或减少的疾病的诊断方法和诊断助剂。
另外本发明提供作为上述疾病的预防药和治疗药的有效成分的促进CF6分泌的物质、抑制CF6分泌的物质、CF6的激动剂或CF6的拮抗剂。另外还提供用作血中CF6浓度的测定方法或诊断方法的试剂或诊断助剂的抗CF6抗体。另外本发明还涉及到含有编码CF6的载体，利用该载体转化的转化体和象CF6那样的肽的制造方法。本发明提供与CF6和CF6的部分多肽特异反应的抗体及其制造方法。
图2是用肠激酶处理含有表达的rCF6的嵌合蛋白质的溶液的C18-HPLC的洗脱曲线。
图3是粗纯化rCF6的C18-HPLC的洗脱曲线。
图4是用肠激酶处理含有表达的hCF6的嵌合蛋白质的溶液的C18-HPLC的洗脱曲线。
图5是粗纯化rCF6的C18-HPLC的洗脱曲线。
图6是用由rCF6诱导的免疫抗原免疫兔子制备的抗血清，以及用能够使抗体肽结合的琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的抗体的电泳凝胶结果。
图7是抗rCF6抗体对SHR(16周龄)血压的影响图。
图8是表示抗rCF6抗体对大鼠(SHR、WKY、16周龄)血压的影响图。
图9是表示抗rCF6抗体的提前注入对由缓激肽引起的大鼠(SHR16周龄)血压下降的影响图。


图10是表示抗rCF6抗体的提前注入对由缓激肽引起的大鼠(SHR SWY、16周龄)血压下降的影响图。
图11是表示rCF6对大鼠(SHR SWY、16周龄)血压的影响图。
图12是表示用Sephadex G-25对SHR心脏的开水提取液进行分级的曲线图。
图13是将上述图12的活性级分经HPLC分离得到的曲线图。
图14是将上述图13的活性级分经HPLC分离得到的曲线图。
图15是表示由大鼠大动脉的cDA文库构建含有N末端附加了因子Xa的识别序列的rCF6的蛋白质表达用的载体图。
图16是表示rCF6抑制PGI2生成的图。
图17是表示在缓激肽存在下rCF6抑制PGI2生成的图。
图18是表示rCF6对花生四烯酸从人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)游离的影响。
图19是表示rCF6对缓激肽引起的花生四烯酸从HUVEC游离的影响。
图20是表示各种PLA2抑制药和rCF6对花生四烯酸从HUVEC游离的影响。
图21是表示各种PLA2抑制药和rCF6对缓激肽引起的花生四烯酸从HUVEC游离的影响。
图22是表示rCF6对大鼠(SHR、WKY、16周龄)血压的影响图。
图23是表示健康人和急性心肌梗塞患者血中的hCF6浓度的比较图。
图24是表示急性心肌梗塞患者血中hCF6浓度的变化图。
图25是表示HUVEC培养液中hCF6浓度的变化图。
发明实施方式在本发明中，用作上述的预防药和治疗药的有效成分，或者用作血中CF6浓度的测定方法或血中CF6浓度变化引起的疾病的诊断方法的试剂或诊断助剂的大鼠和人CF6通过用肠激酶作为切出酶可以更有效地制造(与以前的方法(参考例2)相比)。肠激酶是识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列(序列3)，切断其末端肽键的酶。为了获得CF6，通过基因重组技术的常规方法可以得到在肠激酶识别序列的N末端含有保护肽，C末端含有CF6或其部分肽的嵌合蛋白质，通过肠激酶可以切出CF6。作为嵌合蛋白质可以使用例如由大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端139个氨基酸组成的肽(第76和122位的半胱氨酸取代为丝氨酸序列4)的C末端通过肠激酶的识别序列结合CF6后构成的肽。该嵌合蛋白由于在大肠杆菌中以不溶性级分大量蓄积，所以可以有效地表达、纯化。不溶的嵌合蛋白可溶解于尿素，然后用肠激酶作用，可以从嵌合蛋白中切出CF6。CF6可以经装有C18柱的HPLC纯化。表达载体的制作、宿主的转化对于本领域普通技术人员来说利用常规方法都可以进行(Maniatis等人编写的“分子克隆实验指南”(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989))。(部分多肽)本发明所谓的部分多肽是指由具有抑制由人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)生成PGI2作用的CF6的一部分构成的多肽。包括对构成CF6一部分的多肽缺失、附加以及取代一个乃至数个氨基酸的，以及经缺失、附加和取代联合作用被修饰的具有抑制由HUVEC生成PGI2作用的多肽。(CF6抗体的制造)在本发明中，用作上述的预防药或治疗药的有效成分，或者用作血中CF6浓度的测定方法或诊断方法的试剂或诊断助剂的针对CF6的免疫特异的抗体可以通过以下操作获得用CF6或其片段或其类似物，或表达它们的细胞作为免疫原，利用通常的实验方法使动物，最好是人以外的动物致敏，就获得抗CF6抗体。制备单克隆抗体时，可以利用提供的通过连续的细胞系培养产生抗体的杂交瘤法(Kohler、G.et al.Nature、256495-497、1975)。采用产生单链抗体的技术(美国专利第4946778号)可以产生抗CF6的单链抗体。另外使用具有产生人抗体系统的转基因鼠(Green LL.et al.Nat Genet、7、13-21、1994)可以使人型抗体表达。在本发明的详细说明中给出了制作多克隆抗体的例子(实施例2)合成在来自rCF6或hCF6的大约20个氨基酸构成的片段的N末端附加上半胱氨酸的肽，通过N末端的半胱氨酸与钥孔?血蓝素结合，然后以此作为抗原免疫兔子，可制造多克隆抗体。(CF6浓度的测定方法)另外本发明通过利用上述抗体，能够建立通过RIA法或ELISA法测定样品中CF6的方法(放射免疫分析北川p79-88、酶免疫分析p88-99、新生化实验讲座12、分子免疫学III、抗原、抗体、补体、日本生化学会编辑1992)。作为该例子在本发明书实施例2中给出了通过样品中的抗原抑制125I标记的抗原和抗体反应进行定量的拮抗抑制系统(RIA法)。(促进CF6分泌物质或抑制CF6分泌物质的筛选方法)本发明通过使用上述CF6浓度的测定方法，可以得到促进CF6分泌物质或抑制CF6分泌物质。具体来说，在分泌CF6的细胞，例如HUVEC培养液中，添加被检测物质，利用抗CF6抗体测定体系，例如上述的RIA法测定培养液中分泌的CF6量，可以获得使CF6量增加的促进CF6分泌的物质或使CF6量减少的抑制CF6分泌的物质(实施例7)。分泌CF6的细胞有望使用成为疾病起因的细胞。(CF6激动剂或CF6拮抗剂的筛选方法)本发明获得了用于找到CF6激动剂或CF6拮抗剂的筛选方法。
具体来说，在PGI2生成量被CF6抑制的细胞，例如在HUVEC或大鼠肠动脉的平滑肌细胞培养液中一起添加被检验物质和CF6，测定培养液中分泌的PGI2的稳定代谢物6-酮-PGF1α量，可以得到使6-酮-PGF1α量增加的CF6拮抗剂或使6-酮-PGF1α量减少的激动剂。而在有标记的花生四烯酸存在下，将被检验物质和CF6一起加到HUVEC培养液中，测定培养基中游离的花生四烯酸，也可以发现拮抗剂或激动剂。PGI2生成细胞或花生四烯酸游离有望使用成为疾病起因的细胞。(CF6结合受体的鉴定方法)本发明提供了CF6结合受体的鉴定方法。使用CF6，通过该领域内已知的标准的受体结合法可以鉴定CF6结合受体。这些方法包含配体结合和交联分析，但不限于这些方法。在这些方法中，CF6被放射性标记(例如，125I标记)、化学修饰(例如，生物素化)或融合入适于检测或纯化的肽序列、与HUVEC等细胞的膜级分一起温育。而被标记的CF6在用结合分析来鉴定与CF6的受体竞争性结合的CF6的激动剂和拮抗剂的方法中也可以利用。进行这样分析的标准方法在该领域内都是众所周知的。(疾病例子)在本发明中所谓的CF6过剩的疾病是指血中的CF6作用亢进的疾病，对于生物体来说是不希望的状态，但也未必是血中CF6浓度与健康人相比高的疾病，例如，PGI2不足引起的疾病或cPLA2作用减弱引起的疾病。例如血小板凝集亢进引起的疾病或由于抑制血管扩张引起的伴随着末梢循环障碍的疾病、心肌梗塞、心绞痛、心功能不全、肺高血压、高血压症、脑血管障碍、闭塞性动脉硬化症、动脉硬化、高脂血症、糖尿病、支气管病、胃溃疡、妊娠子痫、溶血性尿毒症综合症、血栓性血小板减少性紫斑病。
在本发明中所谓的CF6不足的疾病是指血中的CF6作用低下的疾病，对于生物体来说是不希望的状态，但也未必是血中的CF6浓度与健康人相比低的疾病，例如，PGI2过剩引起的疾病或cPLA2作用亢进引起的疾病。其病例有脑梗塞、急性胰腺炎、哮喘、ARDS、包含慢性关节风湿病在内的炎症。(提供治疗药)本发明可以提供象上述血中CF6量过剩或不足那样症状的治疗药。
CF6活性过剩时，例如通过给予抑制CF6对配体、底物、受体、酶等作用的有效量的拮抗剂、或抑制CF6分泌的物质，可以降低CF6活性。这些拮抗剂和抑制CF6分泌的物质可以通过上述的筛选方法获得。
另外为了治疗CF6不足的异常的病症，通过给促进CF6对配体、底物、受体、酶等作用的有效量的激动剂，或促进CF6分泌的物质，可以增强CF6活性。这些激动剂和促进CF6分泌的物质可以通过上述的筛选方法获得。(制剂的制造方法)将用本发明的筛选方法得到的促进CF6分泌的物质、抑制CF6分泌的物质、CF6激动剂或CF6拮抗剂作为药物组合物使用时，可以按照常规手段实施。例如，根据需要，可以作成加了包衣的片剂、胶囊、颗粒剂、细粒剂等固形剂，或溶解于或悬浮于水或水以外的药学上容许的溶液中作成的针剂、滴眼剂或滴鼻剂，或作成所谓的软膏、外敷软膏的外用剂使用。
这些制剂通过使用通常用的添加剂按照常规操作都可以制造。制造片剂、胶囊、颗粒剂、细粒剂等口服用的固形剂时，作为添加剂，例如，可以使用(1)乳糖、淀粉或结晶纤维素等赋形剂，(2)羟丙基纤维素或聚乙烯基吡咯烷酮那样的黏合剂，(3)淀粉、交联羧甲醚纤维素钠那样的崩解剂，(4)聚乙烯二醇或柠檬酸三乙酯那样的增塑剂，(5)硬脂酸镁和滑石那样的润滑剂，(6)羟丙基甲基纤维素、Eudragit包衣基剂，(7)白糖或甘露糖醇那样的矫味剂以及矫臭剂、着色剂等。
另外，制造针剂、滴眼剂或滴鼻剂时，作为添加剂可以使用(1)氯化钠、D-甘露糖醇、D-山梨糖醇等张化剂，(2)盐酸、柠檬酸等pH调整剂，(3)柠檬酸钠、醋酸钠、硼酸钠等缓冲剂，(4)盐酸普鲁卡因等无痛化剂以及稳定剂和表面活性剂。另外考虑有效成分的稳定性等，可以选择作成用时溶解或用时悬浮后使用的制剂或溶剂。
为了制造称之为软膏、外敷软膏等外用剂，可以添加(1)液体石蜡、凡士林、亲水软膏等基剂(2)吐温80、黄蓍胶等乳化剂，(3)苯甲酸钠、对羟基苯甲酸丙酯等保存剂，(4)盐酸普鲁卡因等无痛化剂以及稳定剂和表面活性剂。
制备的针剂以适合各种剂型的形式包装。例如可以采用瓶包装、分包、PTP包装、安培瓶、管式瓶的包装形式。这样制作的制剂可以给药于例如哺乳动物(大鼠、兔子、山羊、猪、牛、猫、狗、猴、人等)。给药量因适应症、症状或给药途径等而有所差异，但一般来说对于成年人(60kg)，每天0.01mg～300mg，优选大约0.1mg～100mg。对于其它动物，可以按照每60kg给药量换算后给药。(诊断方法)另外本发明通过测定采集的血样中的CF6浓度，可以提供CF6浓度增加或减少引起的疾病的诊断方法。CF6的浓度如上所述可以通过使用抗体的RIA法或ELISA法测定。(CF6基因或mRNA)根据本发明可以使用CF6基因或mRNA作为对CF6的过少表达、过剩表达、局部存在的变化、或由于这些变化引起的疾病的诊断药或诊断助剂。
CF6基因中存在变异的个体可以通过各种方法在DNA水平上检测。供诊断用的核酸可以从检测对象的细胞、例如血液、尿、唾液、组织活检或解剖材料获得。基因组DNA可以直接使用，或在分析前经PCR或其它的扩增方法扩增后再用。mRNA或cDNA也可以采用同样的方法来使用。通过与正常基因型比较，扩增产物大小的变化可以检测出缺失和插入。点突变可以通过使扩增的DNA与含有DNA碱基序列的CF6DNA杂化来鉴定。完全配对的序列经RNase消化，或者由于融解温度的不同，可以与误配对的双螺旋区别开。DNA序列的差异可以通过与变性物质一起或单独电泳时的DNA片段在凝胶中的迁移率的变化，或通过直接确定DNA序列来检测。序列在特异位置的变化通过核酸酶保护分析、例如通过Rnase和S1保护或化学裂解法也可以搞清楚。或者，构建含有CF6碱基序列或其片段的寡核苷酸探针的阵列(array)，例如可以进行遗传变异效果的筛选。阵列法是众所周知的方法，适用的范围很广，利用该方法可以研究包括基因表达、遗传连锁和遗传变化在内的分子生物学中的种种问题。
实施例以下通过实施例具体地说明本发明，但这是本发明的实施方式的例子，本发明并不限定于这些例子。而实施例中的术语、缩略号等只要没有特别说明，都是来自在该技术领域中通常使用的术语。本发明作为材料使用的质粒、大肠杆菌以及各个实施例中通用的基本实验操作是作为参考给出的。另外为了确认、说明成为本发明的基础的以前的技术以及本发明的附带技术给出了参考例。
质粒pG97S4DhCT[G]是通过大肠杆菌乳糖操纵子的启动子能够表达嵌合蛋白的质粒，该嵌合蛋白是通过β-半乳糖苷酶的N末端到第97号氨基酸序列构成的肽(序列5中第76位的半胱氨酸被丝氨酸取代，而第40、41、71和75位谷氨酸被取代为天冬氨酸，称之为βGal-97S4D)中Glu-Phe-Glu序列结合了hCT[G](降血钙素的第32位的氨基酸的C末端附加了甘氨酸的肽)形成的嵌合蛋白质。通过这样的质粒转化的转化株可以通过四环素耐药性选择。如果将读码框合并使编码目的肽的DNA区以EcoRI-SalI DNA片段导入的话，可以表达与βGal-97S4D构成的嵌合蛋白质。另外含有该质粒的大肠杆菌W3110株命名为EscherichiacoliSBM33，保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为微工研寄第3503号(FERMBP-3503)，于1991年8月8日保藏。
质粒pGP#19RI是将编码pG97S4DhCT[G]的βGal-97S4D/hCT[G]嵌合蛋白的基因取代为编码βGal-139S(序列4)/hProPTH嵌合蛋白的基因的质粒。如果将读码框合并使编码目的肽的DNA区以EcoRI-SalI DNA片段导入的话，可以表达与βGal-139S构成的嵌合蛋白质。在编码质粒pGP#19(特开平9-296000；图4)的保护肽βGal-139S和hProPTH的结合部分的DNA部分中插入EcoRI部位，可以作成质粒pGP#19RI。
质粒pCRII可以以与通过使用TaqDNA聚合酶的PCR法扩增的DNA片段能够直接连接的形式从Invitrogen(公司)购入。由质粒pCRII转化的转化株可以通过氨卞青霉素耐药性选择。
(大肠杆菌与培养基)大肠杆菌JM109株从东洋纺(株)购入，用于质粒的制备和嵌合蛋白质的表达。培养基中使用了LB培养基(0.5％(w/v)酵母提取液)、1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)NaCl、SB培养基(2％(w/v)酵母提取液、1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(v/v)甘油、1.2％(w/v)K2HPO4、0.3％(w/v)KH2PO4)。
(基本实验操作)在实施例中没有具体给出时，实验操作按照以下方法进行。DNA碱基序列通过双脱氧法/DNA序列仪373(Applied Biosystems Inc.)确定。用限制性内切酶切DNA使用购入单位指定的3～10倍量的酶，酶切反应一小时。质粒构造的解析使用0.5～1μg DNA于20μL反应液中进行，而DNA的制备是使用3～10μg DNA于50～100μL的反应液中进行。反应温度、反应缓冲液等条件按照购入单位的指定条件。得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，解析或制备。
琼脂糖凝胶电泳样品通过在反应液中加入含有1/5容量的色素液(0.25％(w/v)溴[代苯]酚蓝的15％(w/v)Ficoll水溶液)制备的。琼脂糖凝胶电泳中使用了TAE缓冲液(10mMTris、20mMEDTA·Na、pH6.8)。在质粒结构解析、以及DNA片段制备中使用Mupid-2(CosmoBio(株))于100伏特下进行了1小时电泳。凝胶在溴乙啶水溶液(0.5μg/ml)中染色20分钟后，通过紫外线照射检测DNA带。琼脂糖浓度与分级的DNA片段的大小相对应，使用1.0、1.5、2.0％(w/v)。琼脂糖凝胶中的DNA使用SUPREC-01(宝酒造(株))从凝胶中提取。DNA溶液用酚处理后，进行乙醇沉淀。连接反应使用0.05～1μg的DNA片段，利用TAKARA连接试剂盒(宝酒造(株))进行。
大肠杆菌的转化法用氯化钙法进行(JM109株用的是购买的感受态细胞)，转化株通过耐药性(氨卞青霉素或四环素)选择。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照Laemmli方法进行(Laemmli et al.Nature227、680-685、1970)。即，在样品中加入1/4容量的4×SDS样品缓冲液(375mMTris盐酸(pH6.8)、30％(v/v)甘油、7％(w/v)SDS、15％(v/v)2-巯基乙醇、0.1％(w/v)溴酚蓝)，于95℃加热5分钟。将10μL样品加到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(55mm×85mm×1mm)或Tefco(株))上，电流20mA，电泳80分钟。电泳后，用染色液(10％(v/v)醋酸、40％(v/v)甲醇、0.25％(w/v)考马斯亮蓝R250)对凝胶进行染色。利用装有C18柱的HPLC进行肽的解析和纯化，使用连接YMC-ODS-A302(d4.6mm×150mm)柱、YMC-ODS-A323((d10mm×250mm)株(以上为YMC(株)))、InertsilODS-2 C18(d4.6mm×250mm)(GL科学(株))柱的HPLC(岛津制作所(株)LC10A)，用A液(0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)、B液(0.092％(v/v)TFA/80％(v/v)乙腈、或0.092％(v/v)TFA/60％(v/v)乙腈)的浓度梯度展开(流速为1mL/分或2.5mL/分)，计算于210nm吸光度测定的峰的面积。
DNA低聚物用Greiner Japan或Lifetech Oriental(株)合成。
PGI2生成抑制活性通过测定从取自SHR肠膜动脉的平滑肌细胞或人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)分泌到上清的PGI2的稳定代谢物(6-酮-PGF1α)进行评价。即取自SHR肠膜动脉的平滑肌细胞在含有10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)进行继代培养，一直培养到汇合那样的状态。HUVEC在含有2％(v/v)胎牛血清、10ng/ml EGF、5ng/ml bFGF、1μg/ml氢皮质酮、10μg/ml肝素的合成培养基(HuMediaKurabo(株))中增殖。将SHR肠膜动脉的平滑肌细胞或HUVEC在添加了测定样品的DMEM培养基中温育30分钟，测定培养期间分泌到上清的6-酮-PGF1α量。
在用75mg/kg氯胺酮和15mg/kg盐酸甲苯噻嗪麻醉的大鼠的大动脉直接插入导管，直接通过血液测定血压。即将用含有20U/ml肝素的生理盐水充满的2根聚乙烯导管插入左颈动脉和左大腿静脉，将插入左颈动脉的导管连接到与多功能记录仪连动的压力检测器(Carrier AmplofierAP-601G；日本光电(株))上。样品用200μL的生理盐水溶解后由大静脉给药。
各种仪器、试剂等的使用方法参照各自附带的使用说明书。另外有关基因操作的基本操作参考Maniatis等人编写的“分子克隆实验指南”(ColdSpring Harbor Laboratory Press1989)。[实施例1]利用嵌合蛋白表达法制备CF6-1
以下给出了使用肠激酶作为切出酶从嵌合蛋白切出CF6的制造方法的具体例子。(rCF6和hCF6 cDNA的制备)rCF6 cDNA是通过以大鼠肝脏cDNA(快速克隆cDNA文库、克隆技术(株))为模板，rCF6-01(序列6)和rCF6-02(序列7)为引物的PCR法得到的。即在耐热性DNA聚合酶中使用KOD(东洋纺(株))，对由大鼠肝脏cDNA文库1μL、10×反应缓冲液5μL、2mMdNTP混合液7.5μL、rCF6-01 0.5μL和rCF6-02 0.5μL、灭菌水35μL构成的反应液进行30循环的反应，每循环为96℃30秒，56℃1分钟，74℃40秒，可以得到rCF6cDNA。同样hCF6 cDNA通过以人肾脏cDNA(快速克隆cDNA文库、克隆技术(株))为模板，hCF6-01(序列8)和hCF6-02(序列9)为引物的PCR法得到。反应条件按照大鼠的实验进行。序列6 5’-ATGACTGTTCAGAGGATCTTCAG-3’序列7 5’-GTCGACTCAGGACTGGGGTTTGTCGAG-3’序列8 5’-ATGATTCTTCAGAGGCTCTTCAG-3’序列9 5’-GTCGACTCAGGCCTGGGGTTTTTCGATG-3’得到的rCF6和hCF6 cDNA经1.5％(w/v)琼脂糖凝胶电泳后，用SUPREC-01(宝酒造(株))回收，作为制作通过肠激酶可切出rCF6或hCF6的嵌合蛋白基因的模板。(附加了肠激酶识别序列的rCF6和hCF6 cDNA的制备)为了制作利用肠激酶可切出rCF6或hCF6的嵌合蛋白基因，合成了在编码rCF6或hCF6的N末端的基因的5’端带有编码Asp-Asp-Asp-Asp-Lys基因序列和限制性内切酶Eco RI识别序列的DNA聚合物(rCF6E；序列10和hCF6E；序列11)。序列105′-GAATTCGACGATGACGATAAGAATAAGGAACTTGATCCTGTACAG-3′序列115′-GAATTCGACGATGACGATAAGAATAAGGAACTTGATCCTATACAGA-3′序列10的DNA序列通过以rCF6 cDNA为模板，rCF6E(序列10)和rCF6-02(序列7)为引物的PCR法导入的。在PCR的耐热性DNA聚合酶中使用了Taq DNA聚合酶(Phamacia)。即rCF6 cDNA 1μL、10×反应缓冲液5μL、1.25mMdNTP混合液8μL、rCF6-010.5μL、rCF6-020.5μL、灭菌水25μL构成的反应液进行8次循环的反应，每次循环为96℃1分钟，60℃ 1分钟，74℃30秒，可以得到5’端带有肠激酶识别序列和限制性内切酶Eco RI识别序列的rCF6 cDNA。扩增的DNA片段在pCRII进行克隆(pCRrCF6EK)，确认碱基序列。同样序列11的DNA序列可以通过以hCF6 cDNA为模板，hCF6E(序列11)和hCF6-02(序列9)为引物的PCR法导入。反应条件按照大鼠实验进行。扩增的DNA片段在pCRII进行克隆(pCRhCF6EK)，确认碱基序列。(嵌合蛋白表达载体的构建)用限制性内切酶Eco RI和Sal I切pCRrCF6EK和pCRhCF6EK，得到由0.3kb构成的Eco RI-Sal I DNA片段rCF6EK和hCF6EK。这些DNA片段带有编码含有N末端附加了Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的肠激酶识别序列的rCF6或hCF6蛋白质的DNA碱基序列，其上游有限制性内切酶Eco RI位点，而下游有限制性内切酶Sal I位点。质粒pGP#19 RI用限制性内切酶Eco RI和Sal I切后，可制备含有载体部分的大约3.5kb DNA片段。将该片段与rCF6EK或hCF6EK连接，可分别得到pG139SrCF6EK和pG139ShCF6EK(图1)。(嵌合蛋白表达和纯化)用pG139SrCF6EK或pG139ShCF6EK转化大肠杆菌JM109菌株，得到JM109[pG139SrCF6EK]和JM109[pG139ShCF6EK]。JM109[pG139SrCF6EK]和JM109[pG139ShCF6EK]用3L发酵罐于含有10μg/mL四环素的SB培养基中37℃下进行通气搅拌培养。8小时后，添加IPTG使之终浓度达到1mM，再培养过夜。培养液3L于6000rpm、4℃条件下离心10分钟(20PR-52D；日立制作所(株))，回收菌体。将该菌体悬浮于含有0.5％(w/v)TritonX-100的Tris盐酸(pH7.0)、1mMEDTA中，通过超声波破碎菌体后，于6000rpm、4℃条件下离心15分钟(20PR-52D；日立制作所(株))，在沉淀级分中以包涵体形式回收嵌合蛋白。再反复进行3次沉淀级分的溶解、离心操作，可得到粗纯化的嵌合蛋白。hCF6嵌合蛋白也同样制备。(从嵌合蛋白中切出hCF6和rCF6并纯化)从嵌合蛋白中切出hCF6和rCF6的方法中有使用因子Xa作为切出酶的方法(参考例2)。然而在该方法中，为了将嵌合蛋白变成可溶性后再使因子Xa作用，需要2M以上的尿素。这样的尿素浓度使因子Xa的活性下降到1/10。因此需要嵌合蛋白的1/60那样的大量的因子Xa。另外尿素存在下的因子Xa的底物特异性降低，从嵌合蛋白切出rCF6的效率也大约降低到8％。
通过使用肠激酶作为切出酶改善了CF6的切出效率。首先，将粗纯化的rCF6嵌合蛋白4mg溶解于10M尿素溶液1.75mL中，通过离心除去不溶物。向上清中添加10×EK缓冲液(200mM Tris盐酸(pH8.0)、500mMNaCl、20mMCaCl2)0.5mL、30U(大约3.4μg，约相当于底物的1200分之一的量)的肠激酶(Stratagene(株))，用蒸馏水将总体积调到5mL。22℃反应过夜后，将反应液加到SepPak18(Waters(株))，使肽吸附。吸附的肽用含有0.1％(v/v)TFA的80％(v/v)的乙腈溶液洗脱。洗脱液冷冻干燥后，溶解于0.1％(v/v)TFA，将溶解后的1/10量通过连有YMC-ODS-A-323(d4.6mm×150mm)柱的HPLC分离，加样后大约14.2分钟洗脱出的峰作为rCF6级分收集(图2)。同样的操作重复10次，收集该洗脱级分作为粗纯化rCF6。
粗纯化rCF6级分冷冻干燥后溶解于0.1％TFA，通过连有YMC-ODS-A-323的HPLC纯化(图3、％B40-43/18分；流速2.5ml/分)。将大约14.2分钟洗脱出的峰收集后冷冻干燥，作为rCF6标准品。通过质量分析仪MALDI-TOFMS(VoyagerElite；日本Perseptive(株))分析，rCF6标准品是单一峰，分子量大致与理论值一致，另外通过使用氨基酸序列分析仪(PPSQ-10；岛津制作所(株))分析，N末端10个氨基酸与rCF6的一样，通过这些事实可以确认rCF6的结构。
象rCF6那样从嵌合蛋白中切出并纯化hCF6。hCF6在最初的HPLC中大约在18.0分钟洗脱出来(图4)。再次层析大约在10.5分钟洗脱出来(图5，洗脱梯度为％B45-48/18分钟)。其结构象rCF6那样确认。
从400mg的嵌合蛋白可分别得到大约210μg hCF6和290μg rCF6，切出效率大约分别为15％和20％，与用因子Xa作切出酶相比(回收率8％)，提高了2～2.5倍。[实施例2]大鼠血中CF6的测定(兔抗大鼠CF6抗体(抗rCF6抗体)的制作)由在rCF6(序列2)的C末端的19个氨基酸的N末端附加了半胱氨酸的共计20个氨基酸构成的肽(CFPTFNFEDPKFEVLDKPQSC-rCF6(58-76)序列12)通过Fmoc固相法合成，经使用C18柱的HPLC纯化。通过合成肽的N末端的半胱氨酸结合于钥孔?血蓝素(KLH)，制作免疫用抗原。
用两只新西兰白种兔，初次将用完全佐剂(CFA)乳化的抗原在兔子背部皮下4个地方免疫后，在2周、6周、8周后用不完全佐剂(IFA)乳化的抗原进行同样的免疫。采集动物的全血，得到抗血清。抗血清的抗体效价通过将抗原固定化的ELISA测定。免疫前的兔子血清的抗体效价在50以下，免疫的兔子的血清的抗体效价分别是59，600和81，400。将抗血清加到结合了6mg抗原肽的琼脂糖凝胶亲和柱(6ml)上，洗净后，用低pH洗脱，纯化抗体(图6)。纯化的抗体浓缩后，对含有0.1％(w/v)NaN3的PBS溶液透析后，使用之前保存在-80℃下。(rCF6浓度测定方法的建立)rCF6(序列2)的C末端19个氨基酸的N末端附加了酪氨酸的共计20氨基酸的肽(YFPTFNFEDPKFEVLDKPQSY-rCF6(58-76)(序列13))通过Fmoc固相法合成，经使用C18柱的HPLC纯化。Y-rCF6(58-76)的放射性碘标记(125I标记)利用乳酸过氧化物酶法进行，125I标记的Y-rCF6(58-76)经使用C18柱的HPLC纯化后，添加最终浓度为0.1％(w/v)的牛血清白蛋白，使用之前保存在-80℃下。
使用通过样品中的抗原抑制125I标记的抗原和抗体的反应进行定量的拮抗抑制体系作为反应体系。即将含有0.25～32ng的rCF6的样品100μL和rCF6抗体(稀释2500倍)100μL混合，反应12小时后，向反应液中添加125I标记的Y-rCF6(58-76)100μL，再反应过夜。然后添加用含有200μg/mL的兔IgG 100μL和10％(w/v)聚乙二醇6000的RIA缓冲液稀释60倍的羊抗兔IgG血清(日本抗体研究所)1mL，放置1小时。经3000rpm、30分钟离心后，除去上清，用γ计数器测定125I。所有的反应都是在4℃下进行。结果在0.25～16ng/μL的范围，观察到沉淀中放射活性与用量的依赖关系。于是建立了样品中rCF6浓度的测定方法。(大鼠血液中rCF6的测定)使用上述的测定方法，测定4周龄的雄性高血压自然发病大鼠(SHR)和正常血压大鼠(WKY)、以及16周龄的SHR和WKY的血液中rCF6。
每组都是5只大鼠，用含有1/10用量的1％(w/v)EDTA·2Na溶液的注射器采血。得到的血液经冷却离心，提取血浆。血浆在测定之前一直保存在-80℃下。在该血浆0.8ml中添加2N盐酸0.2ml后，于4℃下放置10分钟。然后于4℃、10000rpm条件下离心30分钟，其上清加到SepPakC18柱，用0.1％(v/v)TFA 5ml洗3次。用含有0.1％(v/v)TFA的60％(v/v)乙腈溶液2ml洗脱柱子，于真空条件下除去溶剂，溶解于0.2～0.4ml的RIA缓冲液中，作成RIA用样品。供使用前面制备的抗rCF6抗体的上述测定方法用。
各组大鼠血浆中的rCF6的测定结果表明无论哪一组中血浆中的rCF6都在200pg/mL以上。4周龄的SHR和WKY的血浆中rCF6浓度没有差别，如都是16周龄，SHR的血浆中的rCF6浓度显示出明显的增加，比WKY的浓度高(p＜0.05)(表1)。
因此表明在大鼠血液中存在rCF6。而在PGI2不足的自然高血压模型(SHR)中能够确认血中rCF6浓度随着周龄增加即高血压的发病而增加。即起因于PGI2不足的高血压的发病和rCF6的血液浓度之间存在相关性。
表1血浆中rCF6浓度(pg/ml)

平均(利用HPLC制备RIA用样品中与抗rCF6抗体反应的级分的分子)抗rCF6抗体是以rCF6的第58位到76位的片段作为抗原制备的。因此，在用上述RIA体系评价的CF6量中也包含含有来自rCF6 C末端片段的肽的量。用HPLC对RIA样品进行分级，研究各个级分与抗rCF6抗体的反应性。
使RIA样品吸附在SepPak18上，用含有0.1％(v/v)TFA的60％(v/v)的乙腈溶液洗脱。洗脱出的样品冷冻干燥后，溶解于0.1％(v/v)TFA，用连有InertsilODS-2C18(d4.6mm×250mm)柱(GL科学(株))的HPLC分离、分级(用含有0.1％(v/v)TFA的20％(v/v)的乙腈溶液洗5分钟以上，用20-60％乙腈直线梯度/30分洗脱)。可以确认在使用抗rCF6抗体的上述测定体系中抗体反应性在90％以上的级分在与rCF6同一级分中洗脱出来。
即表明血液中的抗rCF6抗体反应性分子的90％以上不是含有来自rCF6C末端片段的肽，而是rCF6。[实施例3]兔抗hCF6抗体(抗hCF6抗体)的制作和hCF6测定体系的建立在免疫用抗原中使用由在hCF6(序列6)的N末端10～27个氨基酸的N端附加了半胱氨酸的共计19个氨基酸构成的肽和KLH的结合物，象[实施例2]那样操作，得到针对hCF6的抗血清。免疫后得到的兔血清的抗体效价分别为123,000和121,300。抗hCF6抗体象[实施例2]那样纯化。hCF6的测定体系除了使用hCF6作为标准品以外，与rCF6测定体系一样制作在125I标记的肽中含有由hCF6(序列2)的N末端10～27氨基酸构成的肽(LFVDKIREYKSKRQTSGGhCF6(10-27)；序列15)。[实施例4]抗hCF6抗体对大鼠血压的影响(抗rCF6抗体对大鼠血压的影响)将16周龄的SHR和WKY麻醉后，由大腿静脉注入抗hCF6抗体(0.3、1.0、3.0μg/kg)，直接通过来自颈动脉的血测定动脉血压。结果发现，对于SHR，由于注入抗hCF6抗体使得平均动脉血压下降，其下降程度依赖于抗体的用量(图7和图8)。而对于WKY，注入抗hCF6抗体并没有引起有意义的血压变动(图8)。另外注入非特异的兔抗体(IgG10μg/kg)，对SHR和WKY的动脉血压都没有影响。(抗hCF6抗体前注入对缓激肽引起的大鼠血压降低的影响)研究抗hCF6抗体对缓激肽引起的大鼠血压降低的影响。将16周龄的SHR和同周龄的WKY麻醉后，由大腿静脉累积注入缓激肽(0.3、1.0、3.0μg/kg)，直接通过来自颈动脉的血测定动脉血压。然后由大腿静脉注入抗hCF6抗体(3.0μg/kg)后，同样注入缓激肽，观察血压反应。
结果表明注入缓激肽引起SHR和WKY血压降低都依赖于缓激肽用量(图9-1和图10)。而就SHR来说，注入抗hCF6抗体可使缓激肽引起的血压下降进一步增强(图9-2和图10)，但对WKY来说，没有影响(图10)。
因此抗hCF6抗体只是在rCF6浓度上升的高血压状态下表现出降压作用，表明CF6的抑制对由血液中CF6过剩引起的疾病的症状的改善是有效的。[实施例5]rCF6注入对大鼠血压的影响研究rCF6对大鼠血压的影响。将15周龄的SHR或WKY麻醉后，由大腿静脉注入rCF6(0.3、1.0、3.0μg/kg)，直接通过来自颈动脉的血测定动脉血压。SHR和WKY由于rCF6注入引起的平均动脉压上升都依赖于用量，但其对SHR的作用比WKY更显著(图11、图22)。
在血中CF6浓度高的SHR中能看到CF6的效果显著，表明SHR处于对CF6的作用更易感性的状态。
如果与实施例4中的抗rCF6抗体引起SHR血压的下降作用的结果相加，CF6拮抗剂和CF6分泌抑制药有可能成为血液中CF6过剩状态的疾病中的某些高血压根治的治疗药。即，表明抑制血中CF6浓度作为血中CF6浓度异常的疾病的治疗方法是有效的。[实施例6]正常人和急性心肌梗塞患者的血浆中的hCF6用含有1/10用量的1％(w/v)EDTA·2Na溶液的注射器从健康人(6名)和急性心肌梗塞患者(18名)的静脉采血。急性心肌梗塞患者都是冠状动脉形成术(PTCA)的成功例子，分别在发病日、2、3、5、7、14天采血。得到的血液经冷却离心，提取血浆。血浆在测定之前一直保存在-80℃下。
hCF6测定用样品用以下方法从血浆中制备。即在该血浆0.8ml中添加2N盐酸0.2ml后，于4℃下放置10分钟。然后于4℃、10000rpm条件下离心30分钟，其上清加到SepPakC18柱，用0.1％(v/v)TFA 5ml洗3次。用含有0.1％(v/v)TFA的60％(v/v)乙腈溶液2ml洗脱柱子，于真空条件下除去溶剂，溶解于0.2～0.4ml的RIA缓冲液中，作成RIA用样品。
hCF6浓度的测定以重组hCF6作为标准，使用抗hCF6抗体用与[实施例3]的rCF6测定方法同样的方法进行。
在健康人的血浆中，检测出的CF6浓度为15.2＋0.5ng/ml(平均浓度＋标准误差)，可以确认作为线粒体内膜蛋白质的CF6不仅在大鼠，而且在人的血液中也存在(图23)。而急性心肌梗塞患者血浆中CF6浓度的峰值是在发病日或第2天出现，其血浆中CF6浓度高达22.1＋1.3ng/ml(图23)。发病日或第2天的血浆中CF6浓度分别是20.2＋1.4ng/ml和17.7＋1.5ng/ml，与第14天的13.7＋0.7ng/ml相比，表现出有意义的高值(图24；Fisher的PLSDp＜0.001和p＝0.01)。第7天和第14天的血浆中CF6浓度分别是13.7＋0.6ng/ml和13.7＋0.7ng/ml，低到健康人的水平以下。
由于急性心肌梗塞患者表现出血浆中CF6浓度上升，所以对于急性心肌梗塞等伴随CF6浓度的变化的疾病，CF6浓度的测定作为诊断方法是有用的。[实施例7]CF6向HUVEC培养上清液中的释放用不含胎牛血清的199培养基培养(直径10cm，培替培养皿)汇合态的HUVEC，分别于24小时、48小时、72小时后取上清样(各点n＝4)，测定hCF6量。用实施例6记载的方法处理培养上清，测定hCF6浓度。培养上清中的CF6浓度随时间培养延长而增加，很明显从HUVEC释放出hCF6(图25)。
因此，将候补物质添加到本实验的HUVEC培养液中，通过使用将分泌到培养液中的CF6量与对照比较的方法可以得到促进CF6分泌的物质或抑制CF6分泌的物质。[参考例1]前列腺环素生成抑制因子的鉴定前列腺环素生成抑制因子通过以下给出的方法鉴定为CF6。以醋酸为萃取液从187只SHR(16～20周龄)的心脏(152g、于沸水中放置10分钟)提取肽。提取物经Sephadex G-25(1.5×30cm)分级(流速3ml/分；图12)，每一级分0.5ml。活性级分(19-21)用接有InertsilODS-2 C18(d4.6mm×250mm)(GL科学(株))的HPLC分离、纯化(用含有0.1％(v/v)TFA的20％(v/v)乙腈溶液洗5分钟后，用20-60％(v/v)乙腈的直线梯度/分洗脱、流速为1mL/分，图13)。通过测定从取自SHR肠膜动脉的平滑肌细胞分泌到上清的6-酮-PGF1α，进行活性评价。纯化的肽(图14)通过使用氨基酸序列分析仪(PPSQ-10；岛津制作所(株))分析，确定从N末端开始的39个氨基酸序列(NKELDPVQKLFLDKIREYKAKRLASGGPVDTGPEYQQEV；序列2中的1～39氨基酸；序列16)，用连有YMC-ODS-A302(d4.6mm×150mm)的HPLC纯化AsnN分解后的片段，确定了DRELFKLKQMYGKGEM(序列2中的40～55氨基酸；序列17)、DKFPTFNFE(序列2中的56～64氨基酸；序列18)、DPKFEVL(序列2中的65～71氨基酸；序列19)、DKPQS(序列2中的72～76氨基酸；序列20)序列。这些序列与作为大鼠质子输送性的ATP合成酶的亚基的rCF6(序列2)序列完全一致。[参考例2]利用嵌合蛋白表达法进行CF6的制备-2以下给出了使用因子Xa作为从嵌合蛋白切出rCF6的酶制造rCF6(序列2)的方法。
(rCF6 DNA的制备)
通过PCR可以得到含有编码在N末端附加了因子Xa识别序列的Ile GluGly Lys序列(序列21)的rCF6蛋白质的DNA片段。作为模板使用在100℃下处理1分钟的大鼠大动脉cDNA文库(克隆技术(株))，作为引物使用CF03(序列22)和CF04(序列23)。
DNA片段在pCRII克隆(pCRIIrCF6Xa)后，确定碱基序列，确认其结构。序列225’-GATCGAGGGACGTAATAAGGAACTTGATCCT-3’序列235’-GTCGACTTAGGACTGGGGTTTGTCGA-3’(表达载体的构建)用限制性内切酶Eco RI和Sal I切pCRIIrCF6Xa，得到由0.3kb构成的Eco RI-Sal I DNA片段。该DNA片段含有编码在rCF6的N末端附加了Glu-Phe-Gly-Leu-Ile-Glu-Gly-Lys序列(序列24)的蛋白质的DNA碱基序列，其上游有限制性内切酶Eco RI位点，而下游有限制性内切酶Sal I位点。而Glu-Phe-Gly-Leu-Ile-Glu-Gly-Lys序列是在来自质粒pCRII DNA的Glu-Phe-Gly-Leu序列的C末端结合了因子Xa识别序列Ile-Glu-Gly-Lys后形成的序列。质粒pG97S4DhCT[G]用限制性内切酶EcoRI和Sal I切后，可制备含有载体部分的大约3.5kb DNA片段。将该片段与由0.3kb构成的Eco RI-Sal I DNA片段连接，可得到pG97SDrCH6Xa(图15)。(rCF6嵌合蛋白表达和纯化)使用pG97SDrCH6Xa转化大肠杆菌JM109菌株，得到JM109[pG97SDrCH6Xa]。将JM109[pG97SDrCH6Xa]接种于含有10μg/mL四环素的LB培养基中37℃下培养6小时。将最终浊度(OD660nm)达到0.1那样的培养液接种于含有10μg/mL四环素和5mM IPTG的SB培养基中于37℃下培养16小时。
培养液于6000rpm、4℃条件下离心10分钟(20PR-52D；日立制作所(株))，回收菌体。将该菌体悬浮于含有1mMEDTA·Na的Tris盐酸(pH8.0)中，用弗氏(细胞)压碎器破碎菌体(10,000psi；2次)。
菌体破碎液于8000rpm、4℃条件下离心20分钟(05PR-22D；日立制作所(株))，将沉淀悬浮于含有0.5％(w/w)TritonX-100的20mM Tris盐酸(pH8.0)30ml，于3000rpm、4℃条件下离心15分钟，回收沉淀。对该操作重复4次，作为粗纯化嵌合蛋白。(从嵌合蛋白中切出hCF6和rCF6并纯化)从嵌合蛋白中切出rCF6，在3mg/ml粗纯化嵌合蛋白浓度中使用50μg/mL因子Xa，于含有2M尿素的50mM Tris盐酸(pH8.0)、100mMNaCl、1mMCaCl2溶液中，于37℃下反应4小时。反应液吸附于SepPak18柱后，用0.1％(v/v)三氟乙酸洗，用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的80％(v/v)的乙腈溶液洗脱，回收肽。洗脱液冷冻干燥后，溶解于0.1％(v/v)TFA，rCF6通过连有YMC-ODS-A-302柱的HPLC纯化(％B35-50/30分；14.5分洗脱出)。RCF6的结构象实施例1那样确认。
但是，由于从本方法中的嵌合蛋白切出rCF6的切出效率大约低至8％，实施体内实验等需要大量的CF6，所以需要更有效的CF6的制造方法。[参考例3]CF6对前列腺环素生成的抑制将HUVEC在含有参考例2制备的1、10、100nM的rCF6的DMEM中于37℃下培养30分钟，研究CF6对PGI2生成的抑制作用。PGI2的生成是以分泌到培养基中的PGI2的稳定代谢物6-酮-PGF1α量为指标的。结果表明，CF6抑制PGI2生成依赖于其用量(图16)。在有1μM缓激肽存在下也进行了同样的实验，了解到CF6抑制由于缓激肽引起的PGI2生成上升依赖于CF6用量(图17)。
另外虽然10nM的CF6抑制2μg/ml的伊屋诺霉素引起的PGI2生成量的上升，但不能抑制从细胞外添加的10ng/ml的花生四烯酸和10ng/mlPGH2引起的PGI2生成量的上升。
PGI2是以磷脂为起始物质合成的。即通过PLA2从磷脂切出的花生四烯酸经环氧激酶作用转换为PGH2，再经PGI2合成酶转换合成的。伊屋诺霉素使该反应中的PLA2活化，即促进从磷脂中切出花生四烯酸。
因此，从CF6的作用不抑制从花生四烯酸或从花生四烯酸级联反应下游产物的PGH2生成PGI2，而是抑制由于PLA2活化造成的PGI2生成的现象表明CF6的PGI2生成抑制作用是PLA2作用的抑制。[参考例4]CF6抑制花生四烯酸游离的作用从参考例3可看出CF6抑制PGI2生成的作用是来自于对PLA2的抑制。使花生四烯酸从脂肪酸释放的PLA2根据结构和化学上的性质大致分为Ca2+依赖性细胞质型PLA2(cPLA2)、Ca2+依赖性分泌型PLA2(sPLA2)、Ca2+非依赖性PLA2(iPLA2)三种。使用各种抑制剂对CF6抑制哪种PLA2进行了研究。
在有[3H]标记的花生四烯酸存在下对HUVEC培养24小时后，将培养基换成DMEM，在有1、10、100nM的CF6存在下于37℃下培养30分钟，研究培养液中游离的[3H]标记的花生四烯酸。结果表明CF6抑制[3H]标记的花生四烯酸游离依赖于其用量(图18)。另外在有1μM的缓激肽存在下进行同样的实验，了解到CF6抑制缓激肽引起[3H]标记的花生四烯酸释放的促进作用依赖于其用量(图19)。
另外，研究了在1μM的缓激肽存在或不存在下cPLA2抑制剂(40μMAACOCF3；花生四烯酸3氟甲基酮)、sPLA2抑制剂(1μM OPC；油酰羟乙基磷酰胆碱)、或iPLA2抑制剂(1μM BEL；溴烯醇胆碱)抑制从HUVEC释放花生四烯酸的作用。结果表明，在HUVEC的实验中只有cPLA2抑制剂抑制花生四烯酸释放，即参与从HUVEC释放花生四烯酸的PLA2是cPLA2(图20、21)。
cPLA2对含有花生四烯酸的磷脂表现出很高的特异性，通过μM级的Ca2+浓度可有选择地使花生四烯酸释放。从cPLA2过剩表达鼠和cPLA2缺失鼠的实验表明cPLA2不仅在起始阶段的花生四烯酸的代谢中，而且在炎症反应中重要的花生四烯酸的后续阶段的代谢中也是很重要的，人们期待cPLA2的抑制表现出很强的炎症反应(Uozumi N.、et al 390618-622、1997)。
本发明可以提供CF6特异的抗体，与该因子有关的病症的诊断方法。另外本发明提供由于CF6活性抑制而不能使正常血压下降的高血压等疾病的治疗方法。另外基于本发明的诊断方法，本发明也提供血液中的CF6增加或减少病症的治疗方法。
<110>SUNTORY LIMITED<120>偶联因子6的抑制剂和激活剂和抗原<130>YCT-515<140>PCT/JP00/5210<141>2000-08-03<150>JPA264687/99<151>1999-09-17<160>24<210>1<211>76<212>PRT<213>Human<400>1Asn Lys Glu Leu Asp Pro Ile Gln Lys Leu15 10Phe Val Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ser15 20Lys Arg Gln Thr Ser Gly Gly Pro Val Asp25 30Ala Ser Ser Glu Tyr Gln Gln Glu Leu Glu35 40Arg Glu Leu Phe Lys Leu Lys Gln Met Phe45 50Gly Asn Ala Asp Met Asn Thr Phe Pro Thr
55 60Phe Lys Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val65 70Leu Glu Lys Pro Gln Ala75<210>2<211>76<212>PRT<213>Rat<400>2Asn Lys Glu Leu Asp Pro Val Gln Lys Leu15 10Phe Leu Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ala15 20Lys Arg Leu Ala Ser Gly Gly Pro Val Asp25 30Thr Gly Pro Glu Tyr Gln Gln Glu Val Asp35 40Arg Glu Leu Phe Lys Leu Lys Gln Met Tyr45 50Gly Lys Gly Glu Met Asp Lys Phe Pro Thr55 60Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val65 70Leu Asp Lys Pro Gln Ser75<210>3<211>5<212>PRT<213>Unknown<220><221><222><223>肠激酶识别部位<400>3Asp Asp Asp Asp Lys<210>4<211>139<212>PRT<213>E.coli<400>4Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp1 510 15Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro20 25 30Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser35 40 45Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro50 55 60Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro Glu65 70 75 80Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp85 90 95Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro
100 105 110Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Ser Tyr Ser Leu Thr Phe Asn115 120 125Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr130 135<210>5<211>97<212>PRT<213>E.coli<400>5Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp1 5 10 15Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro20 25 30Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser35 40 45Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro50 55 60Ala Pro Glu Ala Val Pro Asp Ser Leu Leu Asp Ser Asp Leu Pro Glu65 70 75 80Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp85 90 95Ala<210>6<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>6atgactgttc agaggatctt cag<210>7<211>27<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>7gtcgactcag gactggggtt tgtcgag<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>8atgattcttc agaggctctt cag<210>9<211>28<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>9gtcgactcag gcctggggtt tttcgatg<210>10<211>45<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>编码肠激酶识别部位和Eco RI识别部位的基因<400>10gaattcgacg atgacgataa gaataaggaa cttgatcctg tacag<210>11<211>46<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>编码肠激酶识别部位和Eco RI识别部位的基因<400>11gaattcgacg atgacgataa gaataaggaa cttgatccta tacaga<210>12<211>20<212>PRT<213>rat<400>12Cys Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5 10 15Asp Lys Pro Gln Ser20<210>12<211>20<212>PRT<213>rat<400>12Cys Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5 10 15Asp Lys Pro Gln Ser20<210>13<211>20<212>PRT<213>rat<400>13Tyr Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5 10 15Asp Lys Pro Gln Ser20<210>14<211>19<212>PRT<213>human<400>14Cys Leu Phe Val Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ser Lys Arg Gln1 5 10 15Thr Ser Gly Gly<210>15<211>18<212>PRT<213>human<400>15Leu Phe Val Asp Lys Ile Arg Glu Tyr Lys Ser Lys Arg Gln Thr1 5 10 15Ser Gly Gly<210>16<211>39<212>PRT<213>rat<400>16Asn Lys Glu Leu Asp Pro Val Gln Lys Leu Phe Leu Asp Lys Ile1 5 10 15Arg Glu Tyr Lys Ala Lys Arg Leu Ala Ser Gly Gly Pro Val Asp20 25 30Thr Gly Pro Glu Tyr Gln Gln Glu Val35<210>17<211>16<212>PRT<213>rat<400>17Asp Arg Glu Leu Phe Lys Leu Lys Gln Met Tyr Gly Lys Gly Glu1 5 10 15Met<210>18<211> 9<212>PRT<213>rat<400>18Asp Lys Phe Pro Thr Phe Asn Phe Glu1 5<210>19<211> 7<212>PRT<213>rat<400> 19Asp Pro Lys Phe Glu Val Leu1 5<210>20<211>5<212>PRT<213>rat<400>20Asp Lys Pro Gln Ser1 5<210>21<211>4<212>PRT<213>人工合成序列<220><221><222><223>因子Xa识别部位<400>21Ile Glu Gly Lys<210>22<211>31<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>22gatcgagggacgtaataaggaacttgatcct<210>23<211>26<212>DNA<213>人工合成序列<220><221><222><223>PCR方法中用的引物<400>23gtcgacttaggactggggtttgtcga<210>24<211>8<212>PRT<213>人工合成序列<220><221><222><223>含有肽的因子Xa识别部位<400>24Glu Phe Gly Leu Ile Glu Gly Lys1

提供作为存在于线粒体内的输送质子的ATP合成酶的亚基的偶联因子6有无在血液中存在以及其浓度的测定方法。另外阐明了血液中的偶联因子6浓度和疾病的关系,以及偶联因子6作用的抑制与疾病治疗效果的关系,提供该疾病的诊断、治疗技术。本发明提供含有编码偶联因子6或其片段的DNA的载体、用该载体转化的转化体以及偶联因子6和其片段的制造方法。另外,本发明提供对偶联因子6特异反应的抗体和其制造方法,以及偶联因子6的测定方法。另外,本发明提供有关疾病的发病、进展和血液中的偶联因子6量之间关系的见解,以及显示由于抑制偶联因子6而使症状改善的效果,血液中的偶联因子6量或前列腺环素生成/cPLA2抑制活性变化引起的各种疾病的诊断和治疗手段。