专利名称：治疗出血的组合物和方法治疗出血的组合物和方法出血，技术上称为失血，是从循环系统失去血液。出血可以发生在内部，其中血液从身体内部的血管漏出，或者发生在外部，其中血液通过固有的孔窍或通过皮肤破口漏出。 当身体内血管破裂或渗漏时，发生出血。它可以由身体创伤或非创伤原因例如动脉瘤破裂而引起。抗凝血疗法以及凝血障碍能够提高发生失血的风险。动脉瘤破裂可造成严重的内部出血，可导致休克乃至死亡。当前的治疗方案是手术修复动脉瘤(如有可能)、卧床休息和药物(例如止痛药和抗癫痫发作药物)以缓解相关症状。经历了动脉瘤破裂的所有人中大约一半在第一天或接下来三个月内死亡。大约百分之五十(50%)的幸存者常常留下终生残疾。因此，本技术领域需要控制出血和降低有害性后果的方法。发明概述本发明提供了治疗出血的方法，该方法包括诊断患者的一种或多种出血并向患者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含每体积约0. 1重量％和约45重量％之间的浓度的血管封闭性化合物。在用于局部施用的组合物中，血管封闭性化合物的浓度可以在以重量比体积计约0. 和约20%之间，并可以在每体积约1重量％至10重量％之间。对胃肠外施用而言，浓度可以在每体积约10重量％和约45重量％之间，并且在一些实施方案中可以在以重量比体积计约20至约40%之间。血管封闭性化合物可以包括具有亲水性质的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。除了血管封闭性化合物之外，组合物可以包括能够改变血流的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，活性剂包括以每体积约0. 1重量％和约20重量％之间的浓度存在的镁盐(Mg)。在一些实施方案中，活性剂包括以每体积约0. 1重量％和约10重量％之间的浓度存在的镁盐(Mg)。在一些实施方案中，活性剂包括以每体积约0. 5重量％和约5重量％之间的浓度存在的镁盐(Mg)。治疗有效量可以基于患者的体重计算。一般而言，准备施用的本组合物的治疗有效量可以根据患者的体重，利用每1千克患者体重约0. 05ml至20ml组合物的比率进行估算。如果出血持续，则可以施用重复剂量。当局部施用时，需要的剂量较低，在每千克患者体重约0. 05ml至约5ml组合物、每千克患者体重约0. Iml至约5ml组合物或每千克患者体重约0. Iml至约Iml组合物的范围内。当胃肠外施用时，需要的剂量较高，在每千克患者体重约0. 5ml至约20ml组合物、每千克患者体重约0. 5ml至约IOml组合物或每千克患者体重约Iml至约8ml组合物的范围内。所述至少一种治疗有效量的本发明组合物可以在血管封闭性化合物的一个半衰期内或不到一个半衰期时施用。各种实施方案的其他特征和优点将在下面的说明书中部分阐述，并且部分将从所述说明书中变得明了，或可以通过各种实施方案的实践而获悉。通过说明书和权利要求中具体指出的要素和组合，将认识和得到各种实施方案的目标和其它优点。部分程度上，所述实施方案的其它方面、特征、效益和优点将根据以下说明书、权利要求和附图而明白，在附图中图Ia-If表现了在损伤的时候施用时，生物素标记的PEG在一周时间内在出血部位内的聚积和潴留。图2a_2f表现了在损伤的时候以不同方式施用之后，生物素标记的PEG在出血部位内的聚积。图3a和北呈现了在施用各种PEG组合物之后，PEG在出血部位内聚积的数据。图4呈现了在施用盐水、PEG或含镁的PEG溶液之后，显示出血面积范围的数据。要理解，图不是按比例绘制的。此外，图中客体之间的关系可以不按比例，并实际上可以就尺寸而言具有逆相关性。图是用来对所显示的各客体的结构提供了解和清楚，一些特征可以被放大，以便绘出结构的具体特征。发明的详述为了本说明书和权利要求书的目的，除非另有陈述，表达成分的量的所有数值、材料的百分比或比例、反应条件、和用于说明书和权利要求书的其它数值，将被理解为在一切情况下均由术语“约”进行修饰。因此，除非有相反的表示，在下面说明书和权利要求书中提出的数值参数是近似值，它们可以根据寻求通过本发明得到的期望性质进行改变。最起码、 并且并非试图将本申请的等价原则限制在权利要求书的范围内，各数值参数应该至少根据所报告的有效数的数值并通过应用通常的四舍五入技术来解释。尽管本发明的广义范围提出的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中提出的数值则尽可能准确地报告。但是，任何数字值天生含有必定由它们的相应测试措施中发现的标准差造成的一定误差。另外，本文公开的所有范围应被理解为包涵其中含有的任何和所有子范围。例如，“1至10”的范围包括最小值1和最大值10(含)之间的任何和所有子范围，也就是说，最小值等于或大于1和最大值等于或小于10的任何和所有子范围，例如 5. 5 至 10。要注意，在本说明书和的权利要求书中使用时，不含数量的指示物形式包括其复数，除非明确且不含糊地限定为一个指示物。本发明提供了治疗出血的方法。这种方法包括诊断患者的一个或多个出血血管并向患者施用治疗有效量的包含血管封闭性化合物的组合物。术语“治疗”是指执行方案以图缓解疾病的体征或症状，所述方案可以包括向患者(人或其它)施用一种或多种药物。“治疗”不需要完全缓解体征或症状，不需要治愈，并特别包括对患者只具有边缘效应的方案。术语“治疗有效量”是指本组合物当施用于患者时足以产生改善患者病症的量。改善不意味着治愈，并可以包括患者的病症只有边缘变化。它还包含预防病症或者终止或延迟其发展的活性剂的量。治疗有效量可以根据患者的体重计算。一般而言，准备施用的本组合物的治疗有效量可以根据患者的体重，利用每1千克患者体重约0. 05ml至20ml组合物的比率进行估算。如果出血持续，则可以施用重复剂量。当局部施用时，需要的剂量较低，在每千克患者体重约0. 05ml至约5ml组合物、每千克患者体重约0. Iml至约5ml组合物或每千克患者体重约0. Iml至约Iml组合物的范围内。当胃肠外给药时，需要的剂量较高，在每千克患者体重约0. 5ml至约20ml组合物、每千克患者体重约0. 5ml至约IOml组合物或每千克患者体重约Iml至约8ml组合物的范围内。出血可以由机械损伤、电损伤、生物损伤或化学损伤引起。出血还可以起于变性病症例如动脉瘤形成。可以利用本技术领域已知和使用的任何诊断方法来鉴别一个或多个出血血管的存在。可能有出血风险的血管也可以通过寻找危险因素例如动脉瘤、腹部创伤、软组织、肌腱、韧带或骨创伤、或者肿瘤来鉴别。适当的诊断方法包括但是不限于验血、测血压、EKG、或医学显象检验例如X-射线、超声、CAT扫描或MRI。在本组合物中具有用作血管封闭性化合物用途的化合物可满足以下标准1)它们具有亲水性质；2)它们在出血部位处聚积并血管密封性能；和3)它们留在出血部位处历时至少1小时、并更优选至少M小时的时间。此外，对胃肠外施用而言，合适的血管封闭性化合物在血管完整时能够被迅速排泄掉。另外，血管封闭性药剂可具有在一定条件下密封或融合细胞膜的能力。对于本组合物而言，可以选择血管封闭性化合物的浓度，使得所述血管封闭性化合物造成膜密封效果，而不是主要的膜融合效果。例如，分子量在3350DA和8000DA之间的聚乙二醇(PEG)在每体积0. 1重量％至30重量％的浓度下显示出明显的细胞膜密封和减少出血性质，并在高于每体积45重量％的浓度下显示出明显的膜融合性质。因此，在一些实施方案中，血管封闭性化合物的浓度小于每体积45重量％。对于本申请而言，各种组合物将包含保留在出血部位处但是在血管完整的情况下可以迅速从体循环中排泄掉的血管封闭性化合物。血管封闭性化合物的全身清除率、或半衰期与所述化合物的分子量和亲水性质有关。一般说来，对于相同的分子量，亲水聚合物的半衰期比更疏水的聚合物的半衰期短。此外，亲水性聚合物的半衰期与它们的分子量有直接关系，分子量较高的聚合物具有较长的半衰期。能够大部分不改变地通过尿排泄的亲水聚合物具有的半衰期比在排泄之前需要一些转化的聚合物的半衰期短。例如，因为 24，000DA是肾小球过滤的截止值，比24，000DA更重的任何聚合物在它能够被排泄之前需要降解到一定程度，这延长了所述聚合物的半衰期。在一些实施方案中，血管封闭性化合物的半衰期小于2小时，更优选小于1小时。这样的化合物可以选自分子量小于24，000DA的具有亲水性质的聚合物。血管封闭性化合物可以选自亲水性或两亲性聚合物。术语“亲水性聚合物”在本文使用时是指展现出对水分子的亲合性或吸引力的任何大分子，并且其在线性和/或支化结构中包含多个相互连接的相同亚单位(“单体”)。亲水性聚合物组分可以是合成或天然存在的亲水性聚合物。天然存在的亲水剂包括但是不限于，蛋白质例如胶原蛋白和其衍生物、纤连蛋白、 白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白，其中特别优选胶原蛋白；羧化多糖例如多聚甘露糖醛酸和多聚半乳糖醛酸；胺化多糖，特别是糖胺聚糖，例如透明质酸、壳多糖、硫酸软骨素 A、B或C、硫酸角蛋白、硫酸角质和肝素；甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和活化多糖例如葡聚糖和淀粉衍生物。有用的合成亲水性化合物包括但是不限于聚烯化氧，特别是聚乙二醇和聚(氧化乙烯)_聚(氧化丙烯)共聚物，包括嵌段和无规共聚物；多元醇，例如甘油、聚甘油(特别是高度支化的聚甘油)、聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甘油酯、聚丙烯酸甘油酯、聚丙烯酸聚乙二醇酯、聚烷基P恶唑啉、磷酸胆碱聚合物、聚甲基丙烯酸钠和钾、聚丙烯酸钠和钾、聚甲基丙烯酸和聚丙烯酸、被一种或多种聚烯化氧取代的丙二醇和1，3_丙二醇例如单_、二-和三-聚氧乙基化甘油、单-和二 -聚氧乙基化丙二醇以及单-和二 -聚氧乙基化1，3_丙二醇；聚氧乙基化山梨糖醇，聚氧乙基化葡萄糖；丙烯酸聚合物及其类似物和共聚物，例如聚丙烯酸本身、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基烷基亚砜甲基丙烯酸酯、聚甲基烷基亚砜丙烯酸酯和前述任何的共聚物，和/或其他的丙烯酸酯物类例如丙烯酸氨乙酯和单-2-(丙烯酰氧基)_乙基-琥珀酸酯；聚马来酸；聚丙烯酰胺例如聚丙烯酰胺本身、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和聚N-异丙基-丙烯酰胺；聚烯醇，例如聚乙烯醇；聚N-乙烯基内酰胺，例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚N-乙烯基己内酰胺和其共聚物；聚P恶唑啉，包括聚甲基P恶唑啉和聚乙基P恶唑啉；和聚乙烯胺。术语“两亲性聚合物”在本文使用时是指电荷具有局部量子变化、从而产生极性亚结构和非极性亚结构的任何大分子。极性亚结构表现出对其它极性分子结构例如水分子的亲合性或吸引力(亲水性)，而非极性亚结构展现出对非极性分子例如脂质、油、油脂、脂肪等的亲合性或吸引力(亲脂性)。合适的两亲性聚合物包括但是不限于，泊洛沙姆P-188、聚醚酯共聚物例如聚乙二醇和聚对苯二甲酸丁二酯共聚物、聚乙二醇和聚氧化丙烯共聚物、 聚乙二醇和聚丙二醇嵌段共聚物。两亲性聚合物还包括被称为Jeffamine 的聚醚胺家族。 这些聚醚胺包含连于聚醚骨架末端的伯氨基，所述聚醚骨架典型是基于氧化丙烯(PO)、氧化乙烯(EO)或其混合物。Jeffamine 家族包括单胺、二胺、三胺和仲胺。Jeffamine 可以从总部在德克萨斯州Woodlands的Huntsman Corporation获得。一般说来，本组合物中血管封闭性化合物的浓度可以介于以重量比体积计约 0. 和约45%之间，即约0. 1克至约45克血管封闭性化合物比100ml溶液。在用于局部施用的组合物中，血管封闭性化合物的浓度优选在以重量比体积计约0. 和约20%之间，并更优选在每体积约1重量％至10重量％之间。在为胃肠外施用制备的组合物中，浓度可以在每体积10重量％和约45重量％之间或以重量比体积计约20%至约40%之间。在一些实施方案中，血管封闭剂可以包含聚乙二醇。在本组合物中用作血管封闭性化合物的PEG的分子量在约1000DA和24，000DA之间是适当的，更优选在约1000DA至 8000DA之间，最优选在约2，000DA和约4，000DA之间。不同分子量的PEG可以得自，例如， Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA。除了血管封闭性化合物之外，本组合物可以包括一种或多种活性剂。术语“活性剂”在本文使用时是指具有改变血流活性和/或改善血管封闭性化合物作用的化学元素或化合物。在一些实施方案中，活性剂可以缓解与出血病症有关的体征或症状。合适的活性剂可以选自血流调节剂，例如镁、钾、氧化氮、促肾上腺皮质激素释放激素、甲状旁腺激素、 缓激肽分子和衍生的片段。本组合物中这种活性剂的浓度可以介于每体积约0. 1重量％至约20重量％之间，更优选每体积0. 1重量％和10重量％之间。在一些实施方案中，本组合物包含血管封闭性化合物和至少一种活性剂，其中血管封闭性化合物和所述至少一种活性剂之间的相互作用主要是离子性质的。例如，虽然亲水聚合物PEG作为一个整体来看是非离子性的，但PEG链上醚氧上的孤对电子赋予该聚合物以阴离子特征并可以与具有血流调节活性的金属离子例如镁结合。在一种实施方案中，活性剂包括镁化合物。各种镁盐可以提供镁化合物的来源。 合适的镁盐包括但是不限于，硫酸镁、碳酸镁、氯化镁、氧化镁和氢氧化镁。这些化合物可以容易地从例如Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.，USA商购得到。本组合物还可以包括选自诸如下列大类的其他成分，例如疾病调节剂、神经递质、神经肽和神经元受体调节剂、抗炎和免疫调节剂、抗氧化剂、抗凋亡剂；促智和生长剂、脂质形成和运输调节剂、血流和血管形成调节剂、镇痛剂、留体抗炎药例如皮质类固醇、非留体抗炎药例如水杨酸盐、C0X-2抑制剂、 TNFa抑制剂、阿片制剂和拟吗啡剂等等。除了血管封闭性化合物和活性剂之外，本组合物可以包括一种或多种可药用的载体。本组合物可以包括赋形剂例如溶剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、表面活性剂、增稠剂、缓冲剂、抗微生物剂等等。许多不同的可药用载体和赋形剂是已知的并被公开在例如 Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences (Remington 药物学)，Lippincott Williams Wilkins ；21 版(2005 年 5 月 1 日)中。作为非限制性实例，可以使用序号为11/418，153和11/418，152的美国专利申请中公开的组合物，所述申请在此以其全文引为参考。在一些实施方案中，本组合物可被制备成液体溶液、适合在注射之前溶解于液体中的固体形式。本组合物可通过胃肠外施用，优选通过静脉内施用。已经发现，因为静脉内施用提供了更直接并因此更快速地进入体循环，所以静脉内施用相对于其它施用模式例如腹膜内注射可以产生血管封闭剂在出血部位处的更高聚积。或者，本组合物可以局部递送到血管破裂部位，并且在一些情况下，可以通过装置例如泵或脉动装置辅助递送。如上所述，优选用作血管封闭性化合物的化合物聚积在出血部位并被迅速从全身的其余部位清除。因为这样的聚合物可能具有短的体内半衰期，它们需要迅速向患者施用。 更具体地说，适宜在血管封闭性化合物的一个半衰期内或不到一个半衰期时向患者施用一定剂量的本组合物。例如，分子量在IOOODa和6000Da之间的PEG的半衰期约30分钟至90 分钟，因此适宜在90分钟内、更优选在60分钟内施用包含这样的PEk的一定剂量的本组合物。现在已经一般性描述了本发明，通过下面参考以下实施例可以更容易地理解本发明，除非有指明，否则提供所述实施例作为说明，并不意图限制本发明。实施例方法和试验麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠，并以俯卧位放置在立体定位架上。执行T9/10椎板切除术，并将动物用俄亥俄州立大学(Ohio State University)的撞击器以1. 5mm的位移撞伤。受伤之后不久，通过在10-30分钟时段内静脉内输注施用5_7mL/kg的盐水、含 0. 8%镁的盐水、含0. 8%镁的20%或30% PEG 3；350、含PEG-生物素或镁的PEG3000-生物素制剂。动物以输注之间的时间间隔为6小时接受1至5次输注。输注小瓶的内容物对执行输注和分析二者的研究人员来说是未知的。在输注之后的不同时间点，我们提取组织并加工用于组织学评价(图1-2)、生物分析学分析(图幻或功能分析(图4)。对于图1和2呈现的组织分析而言，在指示的时间点获得脊髓，以20 μ m的厚度横切并利用比色ABC试剂盒进行处理，所述处理包括与亲和素-过氧化物酶复合物和过氧化物酶底物DAB反应，导致在生物素分子(在此称为PEG-生物素)所在之处产生褐色。对于图3呈现的生物分析学分析而言，收集含有或不含出血部位的组织。大鼠血浆中PEG的组织浓度使用验证过的高效液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)法以正离子电喷射离子化模式进行测量。离心组织勻浆之后，得自各样品的上清液级分通过蒸发进行浓缩， 并在分析之前用流动相A复溶。样品使用Thermo Hypersil ODS柱，用HPLC/MS/MS分析法进行分析。PEG的峰面积和校准标准品的理论浓度除原点以外拟合成In-二次函数。以下方法描述了受伤部位处出血程度的功能分析或评价。在损伤后72小时，动物被断头处死，收集以围绕出血部位为中心的15mm脊髓片段并冷冻，和以20 μ m厚度低温切片。每个脊髓选择11个切片供分析损伤的中心、向嘴侧和向尾侧400 μ m、800 μ m、 160(^111、观0(^111和320(^111的切片。载玻片被滑动覆盖，使用莱卡(Leica)光学显微镜在切物镜下得到脊髓的彩色图像。在灰度图像上捕获红色线道(表示出血到该组织中)，所有图像的强度阈值设置在230，以保持始终一致。除硬膜和在下面淤积的血液以外的脊髓以绿色圈起。表现的红色和圈出的绿色的重叠信号使用Sigma kan工具条中Image项下的 Overlay Math功能，用蓝色加亮，并测量蓝色信号的总面积作为出血程度。结果(1)在单次胃肠外施用之后，PEG聚积并优先保留在出血部位处。参考图1，胃肠外施用生物素标记的PEG溶液之后组织学DAB染色指出，生物素标记的PEG优先聚积在出血部位处，在损伤部位上方或下方的脊髓区域没有可见的聚积。在施用之后2小时内可以在出血部位处检测到PEG(图la)，PEG信号在施用之后的M小时内增强(图lb)，并在施用后7天大部分消失(图Ic)。在用盐水处理的动物的脊髓中不存在非特异性DAB染色(图ld-f)。(2)参考图2，通过施用模式影响出血部位处的PEG聚积，组织学DAB染色指出，相对于单次腹膜内注射生物素标记的PEG溶液(图2b-c)，单次静脉内注射生物素标记的PEG 之后M小时达到明显更高的聚积和潴留(图加-f)。但是，在静脉内注射或腹膜内注射生物素标记的PEG溶液之后2小时，出血部位处见到的生物素标记的PEG信号没有明显差异 (图加禾口 2d)。03)20%和30% PEG溶液的组合物在单次或重复静脉内输注之后，引起出血部位处的PEG聚积类似。 利用HPLC/MS/MS分析法对PEG脊髓组织水平的定量评价指出，在一次静脉内输注含镁的20% PEG 3350溶液之后，PEG优先聚积在出血部位处，输注后3小时，相对于未受损伤部位处的PEG组织水平315ng/ml，出血部位见到的PEG组织水平是936ng/ml。每次输注之间的间隔6小时、五次输注含镁的20% PEG 3350溶液之后，在最后一次输注之后3 小时，相对于未受损伤部位处的PEG组织水平595ng/ml，出血部位处的PEG组织水平达到 4025ng/mL·同样，在单次静脉内施用含镁的30% PEG 3350溶液之后，在输注后3小时，相对于未受损伤部位处的PEG组织水平519ng/ml，出血部位见到的PEG组织水平是1430ng/ ml。每次输注之间的间隔6小时、五次输注含镁的30% PEG 3350溶液之后，在最后一次输注之后3小时，相对于未受损伤部位处的PEG组织水平526ng/ml，出血部位处的PEG组织水平达到 3891ng/ml。 静脉内施用PEG减少了损伤部位的出血程度。向PEG制剂添加镁还降低了出血信号。定量形态学分析覆盖损伤部位中心3. 2mm2面积内的出血信号。大鼠中SCI之后进行盐水处理导致在0. 79mm2面积大小中检测到出血。在静脉内施用PEG溶液之后，出血面积的范围减少到0. 47mm2,并在静脉内施用含镁的PEG溶液之后进一步减少到0. 25mm2。虽然本文的发明已经参考具体实施方案进行了描述，但要理解，这些实施方案只说明本发明的原理和应用。因此要理解，在不背离由权利要求书限定的本发明精神和范围的情况下，对说明性实施方案可以做出许多修改并可以设计其它安排。


本发明提供了治疗出血的方法，包括诊断患者的一个或多个出血或可能出血的血管，并向患者施用治疗有效量的包含浓度约0.1％和约45％之间的血管封闭性化合物的组合物。血管封闭性化合物可以包含具有亲水性质的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。所述组合物还可以包含一种或多种活性剂，例如具有与血管封闭剂形成离子键的潜力的血流调节剂。