一种马钱子总生物碱的制备方法及其制药用途【技术领域】，具体涉及一种中药材马钱子总生物碱的制备方法及其制药用途，该制药用途主要应用于治疗风湿痹症。[0002]马钱子，又名苦实、番木鳘，为马钱科植物马钱子(Strychnos nux-vomica L.)或云南长籽马钱(Strychnos Pierriana A.ff.Hill)的干燥成熟种子,始载于《本草纲目》,在《中国药典》的历版中都有记载。马钱子具有通络止痛、散结消肿功能，中医主治风湿顽痹、麻木瘫痪、跌扑损伤、痈疽肿痛等；常在“风湿马钱片”、“舒筋丸”、“疏络养肝丸”、“伤科七味片”、“九转回生丹”等中成药中使用。传统中医学认为，由于马钱子味苦、有大毒，因此一般需要炮制后入药，以降低其毒性。[0003]众所周知，总生物碱是马钱子中最主要的有效部位，约占马钱子总量的2~5%。近十年的中医学研究表明，马钱子总生物碱中至少含有16种生物碱成分，其中主要成分为番木鳘碱(士的宁，strychnine)和马钱子碱(布鲁生，brucine),约占总生物碱总量的70~80%。马钱子碱作为药效成分，具有很强的镇痛抗炎等药理活性，而现有研究认为士的宁的这些药理活性相对较低，但却有强烈的中枢神经毒性。其毒性机制通常表现为:士的宁能对整个中枢神经系统引起兴奋作用，通常作用于脊髓，兴奋其反射功能，引起感觉器官敏感，调节大脑皮层兴奋性和抑制性过程，提高横纹肌、平滑肌和心肌的张力，终致强直性惊厥、呼吸麻痹而至致死(过振华、马红梅、张伯礼，《马钱子药理毒理研究回顾及安全性研究展望》，中西医结合学报，2008，6(6):645-649)。此外，黄韶清等学者经动物实验模型发现，小鼠分别灌胃士的宁和马钱子碱，其半数致死量LD50为3.27mg/kg和233mg/kg，小鼠分别腹腔注射士的宁和马钱子碱，其半数致死量LD50为1.53mg/kg和69mg/kg (黄韶清、周玉淑、刘仁树，《现代急性中毒诊治疗学》，北京:人民军医出版社，2002:354)，更是进一步佐证了过振华等学者提出的“士的宁毒性巨大，不适合临床应用”观点。综上，目前学术界的观点通常认为，鉴于士的宁毒性巨大，必须想方设法去除士的宁来降低马钱子总生物碱的毒性，以确保临床用药的安全性。[0004] 南京中医药大学的蔡宝昌等人在目前学术界的通识上作了微调，认为全部去除士的宁虽然能够实现，但是成本高、其它生物碱成分损失也大，难以实现规模工业化生产；并且他们通过进一步实验研究发现，若能去除总生物碱中的部分士的宁，则既能降低其毒性，又能基本保留其原有的药理活性，更具有可行性和应用前景。如在其授权的中国发明专利(专利号为ZL201010107295.4，申请日为2010.02.08，发明名称为一种提取纯化马钱子总生物碱的方法及其在制药中的应用)中，公开了一种除去马钱子总生物碱中部分士的宁而得到纯化马钱子总生物碱的方法，该技术方案采用不同浓度的乙醇进行提取、纯化，以制得士的宁含量较低的马钱子总生物碱纯化品，然而，该技术方案的缺陷之处在于:①采用醇提方式，提取效率低，产物得率较低。②现有的治疗风湿痹症模式，依旧未脱离目前学术界的理论通识，即士的宁仍作为毒性成分对待，在制备马钱子总生物碱纯化品中仍然简单地以全部去除或部分去除士的宁的思路去提取、纯化。
[0005]为解决现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种马钱子总生物碱的制备方法，以及将该方法制得的马钱子总生物碱应用于治疗风湿痹症的药物中，尤其是治疗类风湿性关节炎的药物中。[0006]本发明采取如下技术方案:
[0007]—种马钱子总生物碱的制备方法，其按如下步骤进行:
[0008](I)将中药材马钱子粉碎、过10~40目筛，制得粗粉；
[0009](2)称取粗粉100g~200g，用醇酸溶液1000mL~2000mL加热回流提取、离心、除
去沉淀，减压回收醇酸溶液，得到浓缩液；
[0010](3)加pH调节剂，将步骤(2)浓缩液的pH值调至9~14后，用苯或二氯甲烷或乙酸乙酯3000mL~4000mL萃取，减压回收溶剂，减压干燥(温度优选65°C~80°C )，得到马钱子总生物碱粉末；[0011](4)将步骤(3)所得的马钱子总生物碱粉末溶于混酸溶液，离心，取上清液；
[0012](5)继续加pH调节剂，将步骤(4)上清液的pH值调至10~13后，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，减压干燥(温度优选65°C~80°C)，得到纯化马钱子总生物碱。
[0013]本发明的发明人经长期实验研究，发现了一个迥异于与目前学术界通识的现象:马钱子总生物碱被应用于治疗风湿痹症时，总生物碱中的士的宁和马钱子碱都属于有效成分。士的宁作为药效成分能够协同马钱子碱治疗风湿痹症，尤其是在治疗类风湿性关节炎上表现出明显的协同增效作用；此外，当马钱子碱与士的宁为特定质量比时，士的宁还表现出了一定的促渗作用，能够促进马钱子碱的经皮渗透，提高药物的生物利用度。
[0014]基于上述颠覆了传统医学理论的研究发现，本发明独辟蹊径，提供了一种马钱子总生物碱的制备方法，通过该方法制得的马钱子总生物碱中含有具有特定质量比的马钱子碱和士的宁，且能够专用于治疗风湿痹症，解决了采用现有技术方案产物得率低、治疗风湿痹症药效差的技术缺陷。
[0015]优选的技术方案中，醇酸溶液为pH值3.0~6.0的CV6的烷烃醇溶液(如乙醇、丙醇、丁醇等烷烃醇溶液)；萃取溶剂为苯、二氯甲烷或乙酸乙酯；pH调节剂为碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠中的一种或几种；酸性溶液为硫酸、盐酸、磷酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸中的任意两种或两种以上的混合。
[0016]优选的技术方案中，步骤(1)所得的粗粉中，马钱子碱与士的宁的质量比为1:2~1:2.5。
[0017]优选的技术方案中，步骤(5)所得的纯化马钱子总生物碱中，马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.1~1:1.5ο
[0018]优选的技术方案中，醇酸溶液为pH值3.0~6.0的乙醇溶液。
[0019]更优选的技术方案中，乙醇溶液的浓度为30~90%，加热回流的次数为2~4次，每次加热回流时间为1.0~3.0h。
[0020]优选的技术方案中，萃取溶剂为二氯甲烷。
[0021]优选的技术方案中，混酸溶液为硫酸、盐酸、磷酸、硝酸中任意两种的混合。[0022]优选的技术方案中，pH调节剂为氢氧化钠。
[0023]由于马钱子总生物碱在醇酸溶液中时，部分转换为盐的形式，可以溶解在水中；而部分生物碱则未改变形态，可以最初的形态溶解在醇中，因此，在本发明中采用醇酸溶液，能够增大提取效率，使得马钱子总生物碱的产率得以提高。
[0024]此外，由于马钱子碱和士的宁质量比不同，所形成的盐的溶解度也各不相同，且差别较大，因此，在本发明中采用混酸溶液，通过调整混酸溶液的PH值以及控制物料的投料量，可以得到马钱子碱和士的宁的质量比为1:0.1~1: 1.5的纯化马钱子总生物碱；透皮实验表明，在该特定质量比下，马钱子总生物碱的药物透过性能好，生物利用度显著提高。
[0025]本发明还提供了一种采用如前所述方法制得的纯化马钱子总生物碱在治疗风湿痹症中的应用，尤其是在治疗类风湿性关节炎中的应用。细胞药效实验表明，采用本发明制得的马钱子总生物碱中具有关节炎滑膜细胞的增殖抑制作用。中国专利号为ZL201010107295.4的发明专利采用乙醇溶液对马钱子药材进行提取，本发明基于马钱子生物碱理化性质和溶解性能考虑提取溶剂改用醇酸溶液，明显增大药材提取率。为减低毒性，中国专利号为ZL201010107295.4的发明专利采用醇沉法除去部分士的宁。但是，药效实验证明:有毒成分士的宁在治疗类风湿性关节炎时也为有效成分。因此，依据马钱子碱、士的宁在混酸中的溶解差异，本发明制得含有马钱子碱士的宁不同比例的马钱子总生物碱，且研究表明其在抑制滑膜细胞增殖方面具有更加优异的效果。因此，在保障安全的前提下，本发明制得的马钱子总生物碱在治疗风湿性关节炎方面可以表现出更好的疗效。
[0026]本发明具有如下优点:本发明提供了一种马钱子总生物碱的制备方法，具备规模工业化生产的应用前景；通过醇酸溶液提取、混酸溶液纯化的方式，大大增加了提取效率，提高了产物得率，且纯化后的马钱子总生物碱经测定，纯度在90~95% ;利用本发明方法制得的马钱子总生物碱纯化品，能快速增加主药成分的透皮速率，提高生物利用度，且毒性降低，细胞增殖的抑制作用增强，治疗风湿痹症的效果显著。

[0027]下面结合具体实施例对本发明作进行详细说明，但本发明的保护范围不囿于如下实施例公开的范围。
[0028]实施例1:马钱子总生物碱的制备方法，其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.1:
[0029](I)称取马钱子，粉碎，过筛(10目)，制得粗粉，称取150g粗粉，粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2 ;
[0030](2)用pH为3.0的浓度40%的乙醇加热回流提取，时间3h，共2次，每次均加液1500mL，离心，除去沉淀，合并2次滤液，减压回收乙醇，得到浓缩液1000mL ；
[0031](3)加入氢氧化钠，调节pH至14.0，用4000mL 二氯甲烷分7次萃取，减压回收溶剂，真空干燥，精密称重，得到马钱子总生物碱粉末，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2 ;
[0032](4)用由0.05mol/L硫酸和1.0mol/L盐酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末，调pH至2.0，离心，取上清；
[0033] (5)加入氢氧化钠，调节pH至10.0，将该溶液用二氯甲烷萃取，减压回收溶剂，减压干燥(65°C)，得到纯化马钱子总生物碱，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.1 ;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为90%。
[0034]实施例2:马钱子总生物碱的制备，其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.4:
[0035](I)称取马钱子，粉碎，过筛(20目)，制得粗粉，称取150g粗粉，粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2.1 ;
[0036](2)用pH为6.0的浓度为50%的乙醇加热回流提取，时间lh，共3次，每次均加液2000mL，离心，除去沉淀，合并3次滤液，减压回收乙醇，得到浓缩液1000mL ；
[0037](3)加入氢氧化钠，调节pH至12.0，用4000mL 二氯甲烷分6次萃取，减压回收溶剂，真空干燥，精密称重，得到马钱子总生物碱粉末，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2.1 ;
[0038](4)用由0.lmol/L磷酸和0.5mol/L盐酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末，调pH至2.0，离心，取上清；
[0039](5)加入氢氧化钠，调节pH至13.0，将该溶液用二氯甲烷萃取，减压回收溶剂，减压干燥(65°C)，得到纯化马钱子总生物碱，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.4 ;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为93%。
[0040]实施例3:马钱子总生物碱的制备，其中马钱子碱与士的宁的质量比为1: 1.0:
[0041](I)称取马钱子，粉碎，过筛(40目)，制得粗粉，称取100g粗粉，粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2.2 ;
[0042](2)用pH为5.0的浓度为30%的乙醇加热回流提取，时间lh，共3次，每次均加液1200mL，离心，除去沉淀，合并3次滤液，减压回收乙醇，得到浓缩液1000mL ；
[0043](3)加入氢氧化钠，调节pH至12.0，用4000mL 二氯甲烷分5次萃取，减压回收溶剂，真空干燥，精密称重，得到马钱子总生物碱粉末，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2.2 ;
[0044](4)用由0.25mol/L硫酸和0.5mol/L磷酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末，调pH至2.0，离心，取上清；
[0045](5)加入氢氧化钠,调节pH至12.0,将该溶液用乙酸乙酯萃取,减压回收溶剂,减压干燥(65°C)，得到纯化马钱子总生物碱，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1: 1.0 ;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为95%。
[0046]实施例4:马钱子总生物碱的制备，其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:1.5:
[0047](I)称取马钱子，粉碎，过筛(10目)，制得粗粉，称取100g粗粉，粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2.5 ;
[0048](2)用pH为4.0的浓度为90%的乙醇加热回流提取，时间2h，共4次，每次均加液1200mL，离心，除去沉淀，合并4次滤液，减压回收乙醇，得到浓缩液1000mL ；
[0049](3)加入碳酸氢钠，调节pH至9.0，用4000mL苯分5次萃取，减压回收溶剂，真空干燥，精密称重，得到马钱子总生物碱粉末，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2.5 ;
[0050](4)用由0.3mol/L硝酸和0.2mol/L盐酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末，调pH至2.0，离心，取上清；
[0051](5)加入氢氧化钠,调节pH至12.0,将该溶液用乙酸乙酯萃取,减压回收溶剂,减压干燥(65°C)，得到纯化马钱子总生物碱，用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:1.5 ;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为90%。
[0052]实施例5:马钱子碱的透皮性能研究一透皮渗透实验
[0053]以大鼠皮肤为试验研究对象，对马钱子碱与士的宁不同质量比时对马钱子碱的经皮渗透进行评价:
[0054]1.实验材料
[0055]1.1样品:称取用实施例1、2、3、4制得的马钱子总生物碱、马钱子碱对照品适量，用含20%乙醇的PBS (pH=7.5)溶解，得到经皮给药用试药，如表1。
[0056]表1含不同马钱子碱与士的宁质量比的经皮给药试液
[0057]