一种防治鱼类温和气单胞菌病的鱼药及其应用的制作方法[0004]本发明的目的是发明一种防治鱼类温和气单胞菌病的药物组合物，既能抑制致病菌的增长，又能提高鱼体免疫力，同时有效解决耐药性的问题。[0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:[0006]一种防治鱼类温和气单胞菌病的药物组合物，包括如下重量配比的原料配制而成:恩诺沙星1-2份，没食子酸10-12份；进一步，由如下重量配比的原料配制而成:恩诺沙星1份，没食子酸10份；进一步，还包括制药上可接受的辅料；进一步，所述制剂为散剂。[0007]本发明还公开一种制备防治鱼类温和气单胞菌病的药物组合物的方法，其特征在于:含有适量的没食子酸，适量的恩诺沙星，以及药物学可接受载体(适量的酸、碱)，所述适量的酸、碱使其混合以后的药物组合PH值为6-8 ;所述酸是柠檬酸；所述碱是碳酸氢钠。[0008]一种药物组合物的制备方法，包括如下步骤:[0009](I)包括如下重量配比的原料药配置而成:恩诺沙星1份，没食子酸10份；[0010](2)将上述药物与适量的酸、碱混合均匀制成散剂，使其混合物溶解后的pH值为6-8。
[0011]采用上述技术方法，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于:
[0012]1、通过在没食子酸和恩诺沙星药物组合中加入酸和碱，并控制药物组合物的pH值为6-8。既适合没食子酸和恩诺沙星的溶解，又能提高药物吸收。另外pH值在6-8范围以内，药物组合偏中性,不会对鱼体造成刺激。
[0013]2、通过体外药效学试验验证，单一的没食子酸和恩诺沙星及其两种药物以不同比例混合液，对细菌性鱼病的致病菌均有杀菌效果。而且发现，当单一的没食子酸和恩诺沙星及其两种药物以不同比例混合后的浓度达到一定值后(lmg/g)，对致病菌的抑制率已达到
100% ο
[0014]3、通过体内治疗细菌性鱼病实验证实:没食子酸和恩诺沙星药物组合不但具有治疗细菌性鱼病的肯定效果，而且在达到治疗效果的同时，具有抗耐药性的作用，预防了细菌性鱼病的再次感染。
[0015]4、通过体内治疗温和气单胞菌药物引起的细菌性鱼病实验证实:a、没食子酸和恩诺沙星药物组合在产生有效治疗效果的基础上，具明显的增强鱼免疫功能，提高鱼免疫能力的突出优点，对预防细菌性鱼病的复发或感染可产生积极的作用。b、没食子酸和恩诺沙星药物组合提高的鱼免疫能力可以继续发挥其他治疗作用。C、实际应用中没有发现其有明显副作用，可以应用到各个生长时期的鱼，这正是没食子酸和恩诺沙星药物组合的优势所在。



[0016]图1.没食子酸对鲤鱼头肾巨噬细胞内ROS的影响。
[0017]注:与空白对照组(0μg/mL)比较，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01。

[0018]药物的制备
[0019](I)采用如下重量配比的原料配制而成:恩诺沙星1份，没食子酸10份
[0020](2)配制方法为将上述药物与适量的酸、碱混合均匀制成散剂，使其混合物溶解后的pH值为为6-8。
[0021]实施例中，所涉及的部分材料来源如下:
[0022]温和气单胞菌:中国工业微生物菌种保藏中心；LB培养基和Agar-LB培养基:北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；恩诺沙星，没食子酸:中国药品生物制品检定所；鲤鱼:吉林省水产科学研究院
[0023]实施例一:温和气单胞菌菌悬液的制备
[0024]挑取适量菌种原液接种于LB液体培养基中，28°C培养18h，用接种环蘸取菌液在琼脂平板上划线培养24h，挑取单个菌落接种于LB培养基中培养18h。取出后用酶标仪测定A600nm确定菌液浓度，用LB培养基稀释到菌液终浓度为106CFU/mL，置于4°C保存备用。另取适量菌悬液加入冻存液放入_80°C进行冻存，以备后续复苏后使用。
[0025]实施例二:联合抑菌试验
[0026]采用棋盘交叉法，根据中药单体和抗生素对温和气单胞菌的单用试验结果，考察没食子酸与恩诺沙星的联合抑菌效果，以2MIC开始进行二倍梯度稀释。联合抑菌试验中，96孔板每孔加入相应的受试药物各100 μ L，再加入10 μ LI X 106CFU/mL的新鲜菌液，混匀，小心将96孔板放入28°C恒温培养箱中培养24h，观察每孔中菌的生长情况。其中每次联合试验均设单药对照。
[0027]联合抑菌试验结果显示，没食子酸和恩诺沙星联合作用时的MIC分别为15.6 μ g/mL 和 0.01 μ g/mL。
[0028]实施例三:没食子酸和恩诺沙星药物组合体内治疗试验[0029]分组:选择健康无病的鲤鱼140条，随机分为7个大组。A组(空白组);B组(阳性对照组)；C组(没食子酸组)；D组(恩诺沙星组)；E组(联合低剂量组)；F组(联合中剂量组)；G组(联合高剂量组)。A组不染菌，用一定量的生理盐水灌胃；B组注射感染后用等量的生理盐水灌胃；C组注射感染后用一定量的没食子酸灌胃；D组注射感染后用一定量的恩诺沙星灌胃；E组，F组，G组注射感染后分别用不同剂量的没食子酸和恩诺沙星灌胃。用IO8CFU/mL的温和气单胞菌菌液分别进行腹腔注射染菌，每尾腹腔注射0.5mL相应菌液，攻毒组(温和气单胞菌组)感染10尾鲤鱼。每组按照相应剂量，在注射染菌后2小时灌胃给药，连续给药7天。从接种病菌时起，连续观察7天，记录各组鱼的发病死亡情况，统计存活率。
[0030]治疗试验结果如表1:
[0031]表1不同剂量药物治疗鲤鱼温和气单胞菌病试验
[0032]