一种降血脂药物组合物的制备方法及医疗用途【技术领域】。[0002]高血脂症主要是指由血清总胆固醇(TC)或三酰甘油(TG)水平过高和(或)血清高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平过低，而引起的一系列严重危害人体健康的疾病。随着人们生活水平的提高，生活方式的改变，人口老龄化的到来，患高血脂症的人群不断增长。研究表明，高血脂是导致动脉粥样硬化的元凶，而动脉硬化是导致心脑血管疾病(心绞痛、心肌梗塞、偏瘫)的罪魁祸首。由高血脂引发心脑血管疾病的发病率和死亡率在全球范围内呈现逐渐增高的趋势，目前，全世界每年有1500万人死于心脑血管疾病，远远高于癌症死亡人数。[0003]二脂酰甘油酰基转移酶(Diacylgycerol Acyltransferase, DGAT)参与脂肪代谢和脂类的沉积。编码该酶的基因有DGATl和DGAT2，前者属于乙酰辅酶A中胆固醇酰基转移酶(Acyl-CoA:cholester ol acyltransferase, ACAT)基因家族，后者属于另一个独立的基因家族。DGATl可以催化酰基化的辅酶A和二酰基甘油合成TG，而TG在体内过剩集聚可导致动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病。因此，通过寻找选择性作用于DGATl的抑制剂，降低血清中TG的形成，从而调节脂代谢紊乱，降低体重，成为越来越受关注的预防及治疗高血脂症的新途径。Zhao等[Zhao G, Souers AJ, Voorbach M,et al.Validation of diacyl glycerolacyltransferase I as a novel target forthe treatment of obesity and dyslipidemia using a potent and selective smallmolecule inhibitor.J Med Chem，2008，51: 380-3]报道针对 DGATl 化学合成的小分子化合物4a对鼠和人的DGATl有较强的抑制效果，IC5tl分别为24 nmol/L、7 nmol/L，口服化合物4a可使饮食诱导的肥胖小鼠体重减轻，肝脏TG明显减少，而不影响摄食量，且四周内体重未出现反弹。Birch 等[Birch AM, Birtles S, Buckett LK, et al.Discovery of a potent, selective, and orally efficacious pyrimidinooxazinylbicyclooctaneacetic acid diacylglycerol acyltransferase-1 inhibitor.J MedChem, 2009，52 (6): 1558-68]报道的口服有效DGATl抑制剂(15 nmol/L)对饮食诱导的肥胖小鼠也具有减肥作用。许多医药企业也针对DGATl开展临床前研究。[0004]2006年，辉瑞公司的DGATl抑制剂BAY74-4113已处于I期临床试验；2009年，诺华的DGATl抑制剂已进入II临床试验。DGATl已逐渐成为研究高血脂症、肥胖、脂代谢紊舌L、糖尿病等疾病的药物热点。目前还没有以DGATl为靶点的天然降血脂药物上市，这为我们从天然资源里寻找高效、高选择性地小分子DGATl抑制剂提供了机遇。[0005]本发明涉及的人参iPanax ginseng)属于五加科,主要生长在东亚,特别是寒冷地区，是亚洲常见药材，用于愈后恢复、增强体力、调节荷尔蒙、降低血糖和控制血压、控制肝指数和肝功能保健等。[0006]本发明涉及的刺五加{Radix Acanthopanacis Senticosl)五加科五加属，主要生长在山坡林中及路旁灌丛中；药圃常有栽培。分布于华中、华东、华南和西南。主要用于抗肿瘤、抗疲劳、降低全血粘度、防止动脉粥样硬化形成等作用。[0007]本发明涉及的人参，刺五加药物组合物，经多次药理实验研究发现，该组合物具有显著抑制DGATl活性及降血脂作用，经文献检索，未见用人参和刺五加活性成分制备降血脂药物的文献报道。


[0008]本发明提供以人参和刺五加醇提活性成分为降血脂药物组合物及其制备方法，其目的是用于治疗高血脂症、动脉粥样硬化、肥胖症及并发症疾病。
[0009]本发明的另一个目的是提供如上限定的药物组合物在生产用于二脂酰甘油酰基转移酶I(DGATl)抑制剂中的应用。
[0010]本发明公开的以人参和刺五加醇提物为活性成分的降血糖药物组合物，主要由以下药物按质量份数比制成:人参醇提物:刺五加醇提物=4:6至6:4。
[0011]本发明所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤:
将人参加1-2倍量的50%乙醇浸泡I小时，利用超声波提取1-3小时，抽滤并收集滤液；滤液用旋转蒸发仪浓缩，收集浓缩液，放凉，加入2-3倍量水并搅拌，常温静置24小时，析出沉淀，过滤或离心取沉淀，沉淀物置于表面皿中加热，除去乙醇和水，直至无醇味，即得人参醇提物；将人参醇提物经过150 μ m反相色谱，用以甲醇/水(V/V，0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱，收集的分离组分利用反相薄层层析检测，成份相同的分离组分合并、浓缩后得到10个分离组分(Fl-FlO)。将F2组分再经HP-20大孔色谱，用以甲醇/水(V/V，0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱，收集甲醇/水(V/V，3:7)的分离组分、浓缩后得到人参活性组分。
[0012]将刺五加加1-2倍的75%乙醇浸泡I小时，利用超声波提取1-3小时，抽滤并收集滤液；滤液用旋转蒸发仪浓缩，收集浓缩液，放凉，加入2-3倍量水并搅拌，常温静置24小时，析出沉淀，过滤或离心取沉淀，沉淀物置于表面皿中加热，除去乙醇和水，直至无醇味，即得刺五加醇提物；将刺五加醇提物溶于1.0-0.6 L水中，成混悬液后用3.0-2.0 L正己烷萃取，收集水层萃取液、减压浓缩成浸膏。水层浸膏再利用HP-20大孔色谱，用以甲醇/水(V/V, 0:10-10:0)为流动相进行梯度洗脱，收集甲醇/水(V/V，4:6)的分离组分、浓缩后得到刺五加活性组分。
[0013]药理学研究表明，本发明的药物组合物的两种基本活性成分具有明显地协同抑制DGATl活性和降血脂作用，药理作用显著优于单独的人参或刺五加的降血脂作用。
[0014]本发明所述的降血脂药物组合物可在预防及治疗高血脂症、动脉粥样硬化、肥胖症及其并发症药物中应用。
[0015]将人参活性组分和刺五加活性组分按比例混合后，加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药剂型。
[0016]以下试验例表明本发明药物组合物的药理活性:试验例I
本发明药物组合物抑制DGATl活性试验
实验方法=DGATl抑制剂的体外检测使用表达在昆虫细胞膜的人类DGATl作为酶源。将sf9细胞用包含人类DGATl编码序列的重组杆状病毒进行感染,48小时后采集。细胞通过超声溶解法溶解，并在4°C条件下，在40%蔗糖溶液中以28000 rpm转速离心分离I小时，得到所述隔膜。收集，清洗细胞间的隔膜碎片并在液氮中储存。
[0017]DGATI活性检测通过修正的科尔曼(CoIeman)所描述的方法进行(methodsinEnzymologyl992, 209, 98-102)。反应体系中包含，10 μ mol/L样品，上述方法得到的
0.4 μ g膜蛋白质,5 mmol/L MgCli^P 1.2 mmol/L 57?~1，2-二酰基甘油-丙三醇,用蒸懼水调整总检测体积至200 μ L，在试管中培养。通过在上述体系中加入100 μ mol/L 14C标记的甘油酰基-辅酶A(0.05 μ Ci)进行反应，并于25°C条件下进行温和短暂的震荡。30min后通过加入1.5 mL 2-丙醇:庚烷:水(80:20:2)终止反应。反应停止后加入1.0 mL庚烷和0.5 mL碳酸盐緩冲液(0.1 mol/L, pH 9.5)，将放射性三酰甘油产物分离到有机相中，并用2.0 mL的碱性乙醇溶液(乙醇:0.5 N NaOH: H20=50:10:40)洗涤一次。用液体
闪烁照相法检测上层庚烷层的放射性来量化DGATl活性。实验结果如下: