专利名称：一种用于肺癌诊断的分子信标复合物及其制备方法微小RNA(microRNA，miRNA)的检测方法很多。Northern杂交是检测miRNA在组织细胞中的表达水平的一种简便而可靠方法，可经凝胶电泳检测miRNA的分子大小经典的方法是Northern-blot，但需要总RNA量较多。基因芯片技术和实时荧光定量PCR被应用于miRNA的系统研究和定量检测，但步骤烦琐，成本较高，易受到逆转录效率的限制。荧光原位杂交(FISH)等方法是相对简化的方法，然而miRNAs原位检测系统相对较少，主要的原因是低拷贝、且片断较小。尽管通过采取碱基修饰的探针能显著提miRNA/cDNA杂交复合物熔链温度，miRNA/cDNA杂交复合物熔链温度过低，难于耐受复杂的漂洗等过程。更为重要的是，传统的miRNA检测方法难以实现完整细胞内miRNA的特异性检测。分子信标可确保反应不受其前体及基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的 miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级；样品消耗少，仅需1 IOng的总RNA ；适用范围广，总 RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测，尤其适用于活体细胞miRNA 的检测。现有技术中已有用于定量检测miR-155表达的分子信标。miRNA可能成为肿瘤早期诊断的生物新靶标。不同肿瘤具有不同的miRNA表达模式，通过miRNA表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计。组织中miRNA的异常表达能作为诊断肿瘤的标志物。microRNA的表达情况与包括I期肿瘤在内的肺腺癌的生存相关。研究发现，人miR-155 (hsa-miR-15Q高表达与预后不良有关；hsa-miR-155高表达是预后不良的因素。miR-155可作为肺癌的一种肿瘤标志物，用于肺癌的诊断与鉴别诊断。分子信标具有背景信号低，灵敏度高、特异识别性强、操作简单，不必与未反应的探针分离即可实时检测， 可用于活体分析等优点。在生物化学分析，生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用价值。目前已通过基因芯片筛选出肺癌miRNA表达谱并对其功能进行了鉴定，本发明选择与肺癌发生及预后相关的miR-155进行检测，但常规分子信标用于活细胞内mRNA的检测分析时，由于细胞内核酸酶对分子信标骨架的降解和破坏作用，常导致假阳性信号的产生。
本发明要解决的技术问题是提供一种能够抵御活细胞内核酸酶的降解作用，对活细胞内miR-155进行检测，从而实现对肺癌的诊断与鉴别诊断的分子信标的复合物。为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案一种用于肺癌诊断的分子信标复合物，包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，所述分子信标其序列为5’ -AlexadSS-CCAGCG-acc+Cct+Atca+Cgat+I^agcattaa-CGCTGG-BHQl-S，，其中 CCAGCG为5’端茎状序列，CGCTGG为3’端茎状序列，发光基团为Alexa488，萃灭基团为 BHQl，acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa为环状序列，其中环状序列中用大写表示的碱基是进行锁核酸修饰处理后的碱基；所述磁性纳米微球包括磁性纳米颗粒以及在包被磁性纳米颗粒表面的壳聚糖。根据成熟microRNA的序列信息来设计分子信标，分子信标的具体设计依据网站 (www. molecular-beacons, org)中分子信标的设计原则来进行，环状探针结构设计原则为 长度在15 30个碱基之间；与目标miRNA能互补配对。茎状序列结构设计原则探针序列的长度为5 7个碱基；GC含量一般在70 80%之间；融链温度比检测温度要7 10°C;G 碱基不能连接发光基团。发光基团与萃灭基团的选择发光基团能被相应的萃灭基团所萃灭，两个基团有一高的信号背景比0.0以上)。根据以上原则本发明为抵御活细胞内核酸酶的降解作用，本发明对设计好的分子信标中的部分碱基进行锁核酸修饰。锁核酸(Locked nucleic acid, LNA)是一种新型的核苷酸衍生物，其结构中β-D-呋喃核糖的2’ _0，4’ -C 位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥这一刚性的缩合结构，改变了核苷酸的几何和立体性质，减小了核糖结构的柔韧性，从而显著地提高了它的稳定性，该构象不仅显著提高了核酸的抗酶切能力，而且提高了杂交亲和性。LNA修饰的碱基数目不应超过6个，否则与miRNA 结合速度较慢。本发明将人miR-155分子信标中的4个碱基进行了 LNA修饰，上述分子信标环状序列中的大写字母即做了 LNA修饰。为了提高分子信标定量检测的灵敏度和稳定性，采用磁性纳米微球来提取和纯化本发明所述的分子信标。磁性纳米微球提取DNA的原理是在磁性纳米颗粒表面包被富含正电荷化学基团的高分子材料(如壳聚糖)，制备成带正电荷的磁性纳米微球。把磁性纳米微球加入到DNA提取液中，在偏酸性(PH6. 5)的缓冲液中，溶液中的DNA能吸附在带正电荷纳米微球上。采用磁性纳米微球做为分子信标的载体，提取相应DNA，可以去除许多影响 PCR扩增的杂质，提高PCR扩增的稳定性。此外，一定量的磁性纳米微球可以吸附一定量的 DNA,有助于获得相对恒量的模板DNA，提高荧光分子信标探针定量检测的准确性。磁性纳米颗粒(MNPs)形成以磁性材料为中心，可包被生物分子的核壳结构，不但具备良好的磁导向性，也具有良好的生物相容性，可与多种功能分子结合，在活细胞和活体组织成像方面得到广泛应用。但未经修饰的纳米颗粒对活细胞有金属毒性，故要对纳米颗粒进行表面修饰。壳聚糖是一种氨基多糖，由几丁质经脱乙酰化后得到，具有良好的生物相容性，能抵抗活体生物降解而被用于表面修饰。壳聚糖可定向固定分子信标增加固定量，又具有生物可降解性易于释放分子信标。同时壳聚糖具有低免疫原性和可降解性能，对细胞无毒副作用。进一步，所述磁性纳米颗粒是Fe53O4磁性纳米颗粒。Fe3O4磁性纳米颗粒便于核磁共振(MRI)显像，分子信标便于荧光显微镜显像，该纳米技术具有双重显像功能。进一步，所述磁性纳米微球是表面经聚乙二醇处理的磁性纳米微球。壳聚糖的分子链上含丰富的羟基和氨基可被进一步化学修饰，聚乙二醇(PEG)修饰壳聚糖后的纳米颗粒有很好的长循环稳定性，可逃避吞噬系统吞噬，能提高体内和体外4的生物相容性。
本发明公开了一种用于肺癌诊断的分子信标复合物，包括磁性纳米微球以及吸附在磁性纳米微球上的分子信标，acc+Cct+Atca+Cgat+Tagcattaa为环状序列，其中环状序列中用大写表示的碱基是进行锁核酸修饰处理后的碱基；所述磁性纳米微球包括磁性纳米颗粒以及在包被磁性纳米颗粒表面的壳聚糖。本发明克服了现有技术中分子信标在活体细胞检测时易产生假阳性信号的缺陷，本发明分子信标复合物能够抵御活细胞内核酸酶的降解作用，对活细胞内miR-155进行检测，从而实现对肺癌的诊断与鉴别诊断。