专利名称:一种治疗老年性痴呆的中药组合物的制作方法图1A所示,在第1~6天的训练过程中,尽管各组PDAPP小鼠搜索平台的潜伏期之间存在差异,但是潜伏期均有明显的缩短。采用post hoc统计学分析结果显示,本发明中药组合物组在第4、5、6天的平均潜伏期均明显比对照组和脑复康组的平均潜伏期短(p值均小于0.05)。如第6天,本发明中药组合物组的平均潜伏期为25.41±2.53s,对照组为36.62±2.96s,脑复康组为36.89±3.04s。脑复康组的平均潜伏期与对照组之间没有明显的统计学差别(p>0.05)。这表明本发明中药组合物组PDAPPV717I转基因小鼠的学习与记忆能力得到明显的改善。比较非转基因小鼠各组的平均潜伏期发现,在第6天时,本发明中药组合物组在第6天的平均潜伏期明显比对照组(p<0.05)和脑复康组的平均潜伏期短(p<0.05)(图1B)。这表明本发明中药组合物对非转基因小鼠的学习与记忆能力也具有改善作用。通过分析各组PDAPP转基因小鼠和非转基因小鼠的平均潜伏期发现,只有本发明中药组合物组转基因小鼠与非转基因小鼠之间没有明显的差异(图2A),而对照组和脑复康组中转基因小鼠与非转基因小鼠之间均具有明显的差异(图2B和图2C)。表明,本发明中药组合物组PDAPP转基因小鼠的学习与记忆能力与非转基因小鼠相比没有显著性差异,这意味着本发明中药组合物组PDAPP转基因小鼠的学习与记忆能力得到明显的改善。2.1.2探索实验(Probe test)由于小鼠在搜索隐蔽平台过程中,可能有小鼠偶尔、无意识或随机的碰到平台后上台的,为了消除这种随机性,我们将平台从水池中拿走,让小鼠在水池内搜索平台60秒,观察小鼠在TQ象限中的搜索时间和经过平台位置次数,通过比较在TQ象限中搜索时间的百分比和经过平台的次数,评价小鼠空间学习和记忆能力。同时,考虑到小鼠可能由于在平台位置搜索不到平台而影响小鼠后面的行为,所以,我们统计了前30秒小鼠在TQ象限中的搜索时间和经过平台位置次数作为评价小鼠空间学习和记忆能力的指标。(1)小鼠在探索实验中TQ象限中搜索时间的百分比探索实验结果显示,在PDAPP小鼠,本发明中药组合物组小鼠的学习和记忆能力得到明显的改善,本发明中药组合物组小鼠的空间学习和记忆能力与脑复康组和对照组之间有明显的差异。如图3A所示,本发明中药组合物组小鼠30秒内在TQ象限中搜索时间的百分比明显高于脑复康组(p<0.05)和对照组(p<0.01)。本发明中药组合物组在TQ象限中搜索时间的百分比为43.1±4.4%,而脑复康组为35.2±3.6%,对照组29.9±3.7%。本发明中药组合物组与对照组和脑复康组之间均有明显的差异(p<0.05)。脑复康组和对照组之间均没有明显的差异(p>0.05)。而非转基因小鼠30秒内在TQ象限中搜索时间的百分比如图3B所示,本发明中药组合物组明显高于对照组(p<0.05)和脑复康组(p<0.05)。(2)小鼠在探索实验中经过平台位置的次数如图4A所示,本发明中药组合物组PDAPP小鼠在30秒搜索时间内平均经过平台位置的次数为(1.20±0.30),明显高于脑复康组(0.89±0.24)和对照组(0.65±0.21)。在非转基因小鼠中,如图4B所示,本发明中药组合物组小鼠经过平台位置的次数(1.98±0.4)也均明显高于脑复康组(1.60±0.28)和对照组(1.42±0.34)。2.1.3可见平台实验(visible platform)在做完“probe test”后,在平台的上方插一个标志杆,黑白相间,非常醒目,小鼠很容易发现。同时在标志杆的上方放一个白色小球,防止影像示踪系统对标志杆的识别而引起实验终止。可见平台水迷宫实验结果显示,第2天开始,本发明中药组合物组和脑复康组PDAPP小鼠的平均潜伏期明显短于对照组。如图5A所示,经可重复方差分析发现,本发明中药组合物组与脑复康组之间没有显著性差异(P值均小于0.05)。在非转基因小鼠,如图5B所示,第2天开始,本发明中药组合物组小鼠的平均潜伏期与对照组之间具有明显的差异(P>0.05)。通过这几种水迷宫实验检测发现,本发明中药组合物治疗组PDAPP转基因小鼠与其它各组小鼠相比,其学习和记忆能力得到明显地改善。本发明中药组合物处理的非转基因小鼠与其它组相比,其学习和记忆能力也得到明显地改善。由此表明,本发明中药组合物对老年性痴呆不仅具有治疗作用,而且对正常人的学习和记忆能力具有明显的改善作用的。2.2 PDAPP小鼠脑组织内β淀粉样蛋白免疫组织化学染色为了进一步研究PDAPP转基因小鼠脑组织内β淀粉样蛋白的沉积情况,利用Aβ特异性单克隆抗体3D6做免疫组织化学染色。在对照组PDAPP小鼠脑组织的大脑皮质和海马区域(如图6)均可以看到有明显的β淀粉样蛋白沉积区域,大量成熟的老年斑。本发明中药组合物组小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积区域明显减少,虽然有的小鼠也可以看到老年斑,但是老年斑的直径明显比对照组小,看不到大的老年斑。而脑复康组小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积情况与对照组之间没有发现明显的差异。我们利用NIH image J图像灰度扫描定量分析软件(httprsb.info.nih.gov/nih-image)分析各组PDAPP小鼠脑组织内β淀粉样蛋白沉积区域的百分比。结果显示,本发明中药组合物组小鼠脑组织大脑皮质和海马区域β淀粉样蛋白的平均值明显低于对照组脑复康组(P<0.05)。2.3 PDAPP小鼠脑组织刚果红组织学染色在对照组和脑复康组PDAPP小鼠脑组织的大脑皮质和海马区域(如图7)均可以看到有大量明显的嗜刚果红神经细胞。本发明中药组合物组小鼠脑组织的大脑皮质和海马区域嗜刚果红神经细胞数目明显减少。2.4 PDAPP小鼠脑组织内星形胶质细胞增生状况的免疫组织化学染色如图8所示,对照组和脑复康组PDAPP小鼠脑组织大脑皮质均可见到大量明显的GFAP阳性星形胶质细胞增生,而本发明中药组合物组PDAPP小鼠脑组织内仅有非常弱GFAP阳性星形胶质细胞增生。本发明中药组合物能够降低PDAPP转基因小鼠脑组织内Aβ淀粉样蛋白的含量,降低脑组织内炎症反应,保护神经元细胞,明显改善小鼠的认知和记忆功能。同时,对非转基因老龄小鼠的认知和记忆功能也具有改善作用。实验例3本发明中药组合物对神经元保护作用的研究。为了进一步证实本发明中药组合物对神经元的保护作用,采用MTT实验检测本发明中药组合物对Aβ42介导的对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的神经毒性作用是否有保护作用。结果显示,本发明中药组合物能够部分中和Aβ42介导的对SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的神经毒性作用。如图9所示,本发明中药组合物在某一特定稀释度时,能够部分防止Aβ42的神经毒性作用(76.2%的细胞存活率),与Aβ42组和脑复康组相比较具有明显的差异,而脑复康组与Aβ42组比较无明显差异。实验例4本发明中药组合物毒理学研究因无法定出LD50,根据《新药评审办法》有关规定进行最大耐受量测定。选择19-22克的SPF级ICR小鼠20只,雌雄各半。将612克发明中药组合物经北京同仁堂崇文门药店煎制,浓缩为200ml药液。动物禁食4小时后,一次性灌胃受试物1ml。即刻观察动物反应,连续观察7天;逐日记录小鼠的毒性反应及死亡情况。结果显示小鼠灌胃给药153g生煎药/kg体重,是成人临床用量(1.7g生药/kg体重)的90倍,实验中动物外观、活动、食欲正常,无异常分泌物及大小便异常。未见毒性反应及因毒性死亡的动物。第八天处死动物进行尸检,肉眼观察未发现病变器官。病理组织学检查发现无病理学变化。实验例5发明中药组合物的临床研究。为进一步探讨发明中药组合物防治AD的疗效和作用机制,本发明人进行本发明中药组合物治疗老年痴呆的临床研究,现将研究结果报道如下。
AD的临床诊断按照美国精神疾病诊断和统计手册第IV版修订版和美国精神病学及语言障碍和卒中-阿尔茨海默病及相关疾病国家研究所的标准执行(American Psychiatric Association.Diagnostic andstatistical manual of mental disorders,4thed.WashingtonAmericanPsychiatric Association Press.1994.and Mckhann G,Drachman D,Foistein M et al.Clinical diagnosis of Alzheimer’s diseaseReport of theNINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of the Department ofHealth and Human Service Task Force on Alzheimer’s disease.Neurology1984;34939-44.)。在排除患有严重的神经系统疾病、内分泌疾病、严重代谢疾病、严重肝肾和心肺疾病、重度痴呆及临床不能配合者等后,通过病史和简易精神状态检查表(MMSE)和日常生活功能活动量表调查(ADL)筛查出53例AD患者(所有AD患者MMSE测评均低于25分)。随机分为本发明中药组合物组33例,脑复康对照组20例。本发明中药组合物组服用发明中药组合物每天3次,每次50ml;脑复康对照组服用脑复康片(由东医集团东北制药总厂生产,批号200006066,每片含吡拉西坦0.4g)每次4片,每日3次,3月为1疗程。在观察期间,予适当对症处理,如有感染者予抗感染治疗,但停用其他益智药及扩血管药物。采用简易精神状态检查表(MMSE)和日常生活自理能力量表(ADL)积分的变化进行疗效评估。经SPSS软件进行统计分析,治疗前后及两组之间采用t检验。
表3中药组合物组和脑复康组治疗前后MMSE、ADL积分比较(X±s)MMSE积分 ADL积分中药组合物组 治疗前15.03±2.67 59.7±7.71(n=33)治疗后19.01±2.39*#53.60±7.51*#脑复康组 治疗前15.51±2.12 58.1±6.19(n=20)治疗后16.71±2.91 56.91±7.23*P<0.01,与治疗前相比较;#P<0.01,与脑复康组比较结果如3表所示,两组治疗前MMSE、ADL积分基线无明显差异(P>0.05),治疗后本发明中药组合物组的MMSE平均积分较治疗前有明显提高(P<0.01),但是脑复康组的MMSE平均积分较治疗前无显著性改变(P>0.05)。治疗后本发明中药组合物组的MMSE平均积分也明显高于脑复康组的MMSE平均积分(P<0.05)。同样,治疗后本发明中药组合物组的ADL平均积分较治疗前有明显降低(P<0.01),而脑复康组的ADL平均积分较治疗前无明显改变。
上述数据表明本发明中药组合物能够明显地改善AD病人的智能障碍,提高AD病人的生活能力;而脑复康的作用虽然不明显,但是对AD病人智能障碍的进一步发展有一定的抑制作用。
本发明提供一种预防和/或治疗中药组合物按照重量份计算包括熟地5~40,制何首乌5~35,枸杞子5~35,淫羊藿5~35,仙茅5~35,石菖蒲5~35,远志3~20。本发明还涉及该中药组合物的水、醇提取物。
一种治疗老年性痴呆的中药组合物制作方法
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