专利名称：一种高产白囊耙齿菌诱变菌株及培育方法白囊耙齿菌(ZrpM Iacteus Fr.)是木材腐朽真菌的一种，属于非褶菌目，多孔菌科，耙齿菌属，别名白囊孔。白囊耙齿菌的发酵提取物具有抗菌、消炎、利尿作用，用于治疗因免疫功能失调而引起的慢性肾小球肾炎，为“益肾康胶囊”的原料。目前，临床主要用于治疗因肾小球肾炎所导致的尿少、浮肿、腰痛、血压升高等症，能明显消除或减少慢性病人的尿蛋白、红细胞，是极具市场潜力的抗肾炎药物。它的主要生物活性物质是多糖、多肽和皂甙。白囊耙齿菌的多糖具有免疫调节作用，具体功能是通过双向免疫调节，提高巨噬细胞的吞噬能力，灭杀致病因素；促进细胞因子的产生，增强体液免疫反应，隔离致病因素。
本发明的目的是提供一株白囊耙齿菌诱变菌株，为一种新的菌株，其有菌丝体干重及效成分腺苷、多糖和虫草酸的产量和原始菌株相比具有显著提高。本发明公开了上述菌的培育方法。本发明还提供了白囊耙齿菌诱变菌株多糖提取的最佳工艺条件。本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明公开的白囊耙齿菌诱变菌株，命名为白囊耙齿菌ILNlO Urpex IacteusFr. ILN10)，该诱变菌株已于2011年4月观日保藏《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为 CCTCC NO =M 2011146，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属于，属于非褶菌目，多孔菌科，耙齿菌属。本发明所述的高产白囊耙齿菌诱变菌株ILN10，其有以下方法诱变选育而制得，以白囊耙齿菌为出发菌株，采用高压诱变处理技术，选育出高产的白囊耙齿菌高产突变菌株 ILNlO0白囊耙齿菌诱变菌株ILNlO的特征为菌丝体干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明显提高，其中菌丝体干重较原出发菌株提高了 25.00 %，腺苷含量提高了 17.07%，甘露醇含量提高了 45. 60%，多糖含量提高了 139. 25%。该白囊耙齿菌诱变株ILNlO菌丝生长快速，菌丝体为白色，可进行快速液体深层培养，该菌株的液体深层发酵特征如下(1) 一级斜面菌种斜面培养基葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8_12 g/L,KH2PO4 0. 1-0.5 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5 g/L，维生素 B1 0. 05-0. 1 g/L，琼脂 18 g/L。斜面菌种培养温度^±l°C，4-5天菌丝长满斜面，放冰箱(2-4°C)保存备用。(2) 二级摇瓶菌种
种子培养基葡萄糖18-22 g/L，蛋白胨8-12 g/L，酵母浸粉8_12 g/L，KH2PO4 0.1-0.5 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5 g/L，维生素 B1 0. 05-0. 1 g/L。种子培养方法将斜面母种接入液体种子培养基，在^±rc，120-160 r/min的摇床培养6 d。(3)摇瓶发酵培养
将种子液按5%接种量接入液体发酵培养基(乳糖26-27 g/L，酵母浸粉23- g/L, (MM)2SO4 :0. 30-0. 35 g/L, KH2PO4 :0. 4-0. 5 g/L,MgSO4 :0. 4-0. 5 g/L, VB1 :0. 01-0. 15 g/L) 中进行液体发酵，发酵培养基装液量为250mL的摇瓶装IOOmL,培养温度^TC,摇床转速为 150rpm,培养5 d后收获菌丝体。(4) IOOL发酵罐放大培养
将种子液按7 %接种量接入60L液体发酵培养基中，于IOOL发酵罐中进行液体深层发酵培养，26°C，200 r/min，通气量4 L/min，初始pH为5. 0，培养40 h。本发明培养白囊耙齿菌诱变株的培养基，其特征在于是由以下原料按重量份数比制成的蛋白胨 4. 1466 g/L，酵母浸粉 2.0426 g/L，葡萄糖 5.0954 g/L,MgSO4 0. 1652 g/ L 和 VBl 0.0280 g/L。本发明的积极效果在于诱变的白囊耙齿菌诱变株经10次以上传代培养不退化， 具有遗传稳定性。


图1为原出发菌株与株突变株的有效成分比较；
图2为乳糖浓度和酵母浸粉浓度对D值影响的响应面和等高线图。

技术领域：
本发明所述获得高产白囊耙齿菌诱变菌株的诱变方法为亚硝基胍诱变。1)将白囊耙齿菌菌株，以3%接种量接种至产孢培养基中，产孢培养基的培养为 蛋白胨 4. 1466 g/L，酵母浸粉 2.0426 g/L，葡萄糖 5.0954 g/L，MgS04 0. 1652 g/L和VBl 0.0280 g/L。恒温摇床中150rpm培养4天，无菌脱脂棉过滤，得到孢子悬液；
2)在无菌条件下将步骤1)中得到的孢子悬液ImL装入铝箔聚丙烯袋中，封口。在温度^°C、压力200M Pa条件下处理30min后，取孢子悬液于无菌蒸馏水中逐级稀释，涂布至种子培养基平板培养3-4天后，将菌株于96孔板保存；
3)将培养好的突变株用接种针逐个接种至种子培养基中进行活化，于恒温摇床中150rpm培养4天，测定菌丝体干重、腺苷、多糖和甘露醇含量，以筛选高产突变株。采用 HPLC法测定菌丝体中腺苷含量；采用蒽铜一硫酸法测定总糖含量；利用分光光度法测定甘露醇含量。共得到4株高产菌株分别命名为ILNlO、ILN16、ILN19和ILN23，其中ILNlO的干重、腺苷、多糖和甘露醇含量均高于出发菌株，这四株突变株与出发菌株的有效成分比较见图1。选取ILNlO为高产突变株，命名为白囊耙齿菌/印权hetem，该诱变菌株已于2011 年5月5日保藏《中国典型培养物保藏中心》，保藏号为CCTCC NO =M 2011146，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属于非褶菌目，多孔菌科，耙齿菌属。
实施例2、白囊耙齿菌诱变株ILNlO与出发菌株比较及遗传稳定性考察
1)将原出发菌株与诱变菌株ILNlO分别再种子培养基(葡萄糖17-25 g/L，蛋白胨 8-15 g/L，酵母浸粉 8-15 g/L, KH2PO4 0. 1-0. 5 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5 g/L，维生素 B1 0.05-0.1 g/L)中，于^°C，150rpm，培养5 d进行发酵培养，白囊耙齿菌诱变菌株菌丝体干重、腺苷、甘露醇及多糖的含量均有明显提高，其中，菌体体干重达6. 40 g/L，较原出发菌提高了 25.00 %;腺苷含量可达0.0348 g/L，较原出发菌提高了 17.07% ；甘露醇含量可达0.1275 g/L，较原出发菌提高了 45. 6%;多糖含量可达1.0792 g/L，较原出发菌提高了 139. 25%。 表1原出发菌株与诱变菌株ILNlO有效成分含量比较


本发明公开了一种白囊耙齿菌诱变菌株及其培育方法，该菌株(CCTCC NO:M2011146)是通过化学诱变筛选分离得到的，其菌丝体干重较原出发菌株提高了25.00%，腺苷含量提高了17.07%，甘露醇含量提高了45.60%，多糖含量提高了139.25%。本发明的白囊耙齿菌诱变菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性。本发明还公开了白囊耙齿菌诱变菌株的最适发酵培养基。