专利名称：一种人乳头瘤病毒型原位杂交检测试剂盒及其方法宫颈癌是第二大女性恶性肿瘤，世界范围内每年大约有50万左右的新发病例，我国的患病率及病死率约占世界的1/3，其发病以每年2% 3%的速度增长随着宫颈癌病因学的研究发展，其防治方法也在不断地提高和发展。各国的实践均证明普查可以降低宫颈浸润癌的发生和死亡，原因在于宫颈癌有一系列的前驱病变，它的发生、发展是由量变到质变、渐变到突变，通常是由子宫颈不典型增生(轻一中一重)一原位癌一早期浸润癌一浸润癌的连续发展过程。这些前驱病变可存在多年，而且子宫颈具有有利的解剖学基础，易于暴露，便于观察、触诊及取材，如能在前驱病变阶段被确诊，即可进行进一步治疗或监测。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果好得多，据报道宫颈浸润癌的五年生存率是 67 %，宫颈早期癌是90 %，而宫颈原位癌则几乎达100 %。因此通过普查可以达到早诊早治，降低宫颈浸润癌的发病率和死亡率。研究显示，人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)的直接和主要病因。宫颈癌患者的HPV检出率可达99. 17%，其归因危险百分比达90%以上。HPV有100多种亚型，其中与泌尿生殖道感染相关的有40余种。根据其对生殖系统的致癌性可分为低危型和高危型，前者主要引起尖锐湿疣等良性病变，后者常引起宫颈癌等恶性病变。生殖道感染HPV最常见的型别即16，18，6，11型。HPV6和11型经常感染外阴、肛门、阴道等部位，属于低危型别，湿疣或宫颈上皮内低度病变妇女中多常见， 与宫颈浸润癌无明显关联；而16和18型则属于高危型别，来自世界各国的宫颈癌组织标本的研究发现，HPV16和18型感染率最高，在检出的所有型别中，HPV16占50%，HPV18占 14%,HPV45占8%，HPV31占5%，其它型别的HPV占23%。HPV的型别与宫颈癌的病理类型有关，在宫颈鳞状上皮细胞癌中HPV16占主要地位(51%的鳞状上皮细胞癌标本)，而在宫颈腺状上皮细胞癌(56%腺状上皮细胞癌标本)和宫颈腺鳞细胞癌(39%腺鳞细胞癌标本)中HPV18占主要地位。有些HPV型别有地理位置的差异，但HPV16、18型感染很普遍， 没有明显的地区差异。因此对宫颈组织的病理学检测以及对HPV16，18型其进行检测，对于临床诊断、癌变预防与治疗具有重要意义。1.病理学检测自1941年Papanicolaou发现采取阴道及宫颈脱落细胞制成涂片，经染色可观察细胞的变异，世界各国都将该法(巴氏涂片)作为宫颈癌筛查的一种手段引入临床，并被许多国家作为常规筛查项目。虽然从未有一种随机化前瞻性研究证明巴氏涂片可以降低宫颈癌发病率，许多国家和地区的调查资料显示，自引入巴氏涂片，筛查人群宫颈浸润癌的发病率降低了 70% -90%，而未筛查人群的发病水平变化不大。1998年，Markovics发表了关于宫颈脱落上皮酸性磷酸酶检测的结果和进展，并研究出了一个新的CAP-PAP染色法。该方法能将巴氏染色结果中的异常子宫颈细胞内的酸性磷酸酶明显着色，可作为天然的子宫颈鳞状细胞异型增生的生物标记物。2003年， Markovic发表了 1000例宫颈细胞染色的结果，测试了 CAP-PAP的灵敏度为81%，特异性为 97%，与传统巴氏染色相比较显著地提高了阳性检出率(ρ <0.05)。由此得出结论是CAP 染色的能增加巴氏染色的敏感性，使细胞检验员筛查标本时能显著提高检阳性/异常标本检出率和减少假阴性率。在次基础上，我们进一步改良了该方法的配方和操作技术，使之能更方便和廉价地运用于液基薄层细胞沉降法制片染色中。2. HPV 的检测2. ISouthern印迹杂交或斑点杂交法该方法是将HPV-DNA从临床标本中直接分离出来，通过Southern印迹或斑点杂交进行检测。但检测不能达到临床所需的灵敏度，且操作繁琐，费时耗力，不适合于大通量临床样品的筛查，目前较少使用。 2. 2HPV-DNA 直接捕获法杂交捕获(HC，Hybride Capture systems，DigeneCorp，US)采用分子杂交 + 化学发光+信号放大原理，此系统应用两组不同的混合RNA探针(即所谓的鸡尾酒探针)，一组含有HPV6、11、42、43和44型5种低危型探针，而另一组则含有HPV16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59和68型13种高危型探针。利用一种非同位素信号放大系统并基于 HPV-DNA杂交到溶液中标记RNA探针的方法，结合后的DNA-RNA杂交体被微孔板所捕获并被随后所加的特异性单克隆抗体和化学发光底物所检测。该法为目前唯一以商品化试剂盒提供的检测方法，且有足够的科学证据支持其应用于临床的检测系统，并得到美国FDA认证， 已成为许多国家的标准方法被广泛应用于临床研究中。但此方法也有一些不足。最近，Pol jka等采用PCR-RFLP法对HC进行了方法学评价。结果发现，两法的诊断符合率为89.7%，HC漏检率为10.3%。此外，HC的检测下限约为5000个基因组HPV-DNA，且只能进行分组鉴定而不能进行个体基因分型，两组混合探针间存在的交叉反应也影响其检测的准确性。由于HPV感染的状态要求对特定基因型HPV进行鉴定，故该法不能用于诸如具体分型、型特异性疫苗或型特异性药物的研究和疗效观察。杂交捕获方法虽然成熟，但灵敏度不高且有较高的漏诊率。由于HPV载量对于疾病的预测和疗效的观察是一个很有价值的指标，加之很难建立起一种足够灵敏的、总的 HPV-DNA定量分析方法。因此，HPV的基因分型将在正确选择型特异的定量方法中起着重要的作用。
本发明目的是提供一种高灵敏度，可信度和直观的人乳头瘤病毒(HPV16、18型) 原位杂交检测试剂盒及其方法。本发明的技术方案为提供一种人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，所述试剂盒包括玻片、杂交液、原位杂交试剂，所述杂交液包括标记物标记的杂交探针，所述杂交探针序列如 SEQ ID NO 9 到 SEQ ID NO 12 所示。优选的，上述试剂盒中所述玻片为在玻片处理液中进行了浸泡的玻片，浸泡时间大于12小时，所述玻片处理液以DEPC水为溶剂配制，所述玻片处理液各组分质量浓度为 多聚赖氨酸5-15%、黄油5-15%、聚乙烯5-15%0优选的，上述试剂盒中所述原位杂交试剂包括杂交增强液，显色底物，还包括碱性磷酸酶标记的地高辛抗体或辣根过氧化物酶标记的抗地高辛Fab片段，所述杂交增强液各组分为质量浓度45%去离子甲酰胺、质量浓度10%硫酸葡聚糖、lOOug/mL鲑鱼精DNA、 4XSSC、5XDenhardts 溶液、50mM Tris-HCl 溶液。优选的，上述试剂盒中的原位杂交试剂还包括显色增强液，所述显色增强液为质量浓度为10%的甲酰胺。原位杂交试剂所述标记物可以为为放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶、地高辛或纳米材料。本发明的另一技术方案为提供一种人乳头瘤病毒原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、制备特异性探针设计引物并PCR扩增所述的HPV病毒核酸，以地高辛进行标记，制备特异性检测HPV的探针，所述引物序列如SEQ ID NO :1到SEQ ID NO :8所示，所述探针序列如SEQ ID NO 9到SEQ ID NO 12所示；检测样本的制备对玻片进行预处理，将玻片在玻片处理液中进行浸泡，浸泡时间大于12小时，所述玻片处理液以DEPC水为溶剂配制，所述玻片处理液各组分质量浓度为 多聚赖氨酸5-15%、黄油5-15%、聚乙烯5-15%，然后制作样本的切片或液基薄层细胞涂片；b、原位杂交检测将上述地高辛标记的探针与制备好的样本涂片或切片进行原位杂交，所述地高辛标记的探针与样本的目的片段结合；C、信号放大与检测上述步骤b中的探针进一步结合辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段，通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶显色系统进行信号放大检测。优选的，上述方法中所述步骤b杂交检测具体为S10、杂交预处理甩干步骤a所述切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加蛋白酶K工作液，孵育5分钟，将切片放入杂交增强液，微波加热30分钟，冷却，蒸馏水洗涤1分钟，小心擦干组织周围液体。S20、杂交S21、每张切片滴加杂交液，并加盖玻片；S22、变性将切片放置杂交加热器上，95°C变性5分钟；S23、切片放入含30%湿盒增效液的湿盒中，37°C下孵育4_16小时；S24、PBS缓冲液48°C预温浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS缓冲液继续浸泡5分钟；S25、振荡容器48°C PBS缓冲液洗涤15分钟；优选的，上述方法中所述步骤c信号放大与检测具体为S10、取经原位杂交后的组织切片，滴加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗地高辛Fab片段，37°C，水湿盒中孵育30分钟；37°C PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；S20、滴加试剂酶稀释液，所述试剂酶稀释液为质量浓度为50%甘油、50mM KCl, 37°C水湿盒中孵育20分钟；37°C PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；S30、滴加试剂C，所述试剂C为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶溶液，37°C水湿盒中孵育30分钟；37°C下PBS缓冲液浸泡6分钟，振荡容器；S40、滴加底物DAB/H2A或BCIP/NBT底物，避光显色，显微镜下观察15_30分钟，当显色为蓝黑色时终止显色。优选的，上述方法中所述PCR扩增的样本来自宫颈拭子、刮取物、液体悬浮物、冻存材料、石蜡包埋组织。本发明的有益效果为本发明通过对玻片的特殊处理，解决了原位杂交检测样本必须为石蜡切片或冰冻切片的局限性，利用进行液基薄层细胞检测的涂片也可进行原位杂交检测而不会发生细胞脱落，大大减轻了患者取样的痛苦。在原位杂交检测过程中，引入了杂交增强液及显色增效液，提高了检测结果的信噪比，结果易于判读。图1 采用引物:16F1和16R1制备探针的PCR扩增产物电泳图；图2 采用引物16F2和16R2制备探针的PCR扩增产物电泳图；图3 采用引物18F1和18R1制备探针的PCR扩增产物电泳图；图4 采用引物18F2和18R2制备探针的PCR扩增产物电泳图；图5 =HPV阳性样本检测结果图；图6 =HPV阳性样本检测结果图；图7 =HPV阳性样本检测结果图。

设计上述探针的扩增引物，由专业的合成公司如hvitrogen公司。探针通过所设计的引物经PCR方法进行制备，并在PCR过程中进行标记物标记。所述标记物可以为为放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶、地高辛或纳米材料。将标记的探针与制备好的样本涂片或切片进行原位杂交，通过杂交液及杂交增强液的盐离子与样本中的目的片段结合，通过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶显色系统进行信号放大检测。实施例1本发明试剂盒组成本发明提供的液基薄层细胞的原位杂交(人乳头瘤病毒16、18型)检测试剂盒由玻片、杂交液、原位杂交试剂三部分组成。所述杂交液包括Dig-探针(地高辛标记的特异性杂交探针)。HPV16U8型特异性的Dig-探针通过4对引物PCR制备，分别为HPV16、18L1区及 E6区。引物序列如表1。表

本发明涉及生物技术检测领域，目的是提供一种高灵敏度，可信度和直观的人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒及其方法。本发明一个技术方案为提供一种人乳头瘤病毒原位杂交检测试剂盒，所述试剂盒包括玻片、杂交液、原位杂交试剂，所述杂交液包括标记物标记的杂交探针，所述杂交探针序列如SEQ ID NO9到SEQ ID NO12所示。本发明的有益效果为本发明通过对玻片的特殊处理，解决了原位杂交检测样本必须为石蜡切片或冰冻切片的局限性，在原位杂交检测过程中，引入了杂交增强液及显色增效液，提高了检测结果的信噪比，结果易于判读。