专利名称：用于皮肤应用的至少一种维生素e成分和酪氨酸酶抑制剂协同相互作用的制作方法皮肤色素沉着是抗有害的紫外辐射的重要的保护机制。例如，在疾病或损伤的情况下，人的皮肤可改变颜色，造成更深的皮肤色调或颜色(色素沉着)。多数形式的色素沉着由体内过量产生的黑色素而引起，这个物质是颜色(色素)的原因。在体内，色素黑色素的形成发生在皮肤黑素细胞的黑素体内(Mason, H. S.，1949，J Biol Chem, 181, 803-12;Fitzpatrick,T.B.等，1950，Science, 112，223-5)。 这个过程由增色酶，例如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1/2 (TRP1/2)调节(Chen, & Chavin, W. 1966，Nature, 210，35-7)。具体地，这些酶促进了限制黑色素生物合成中两步反应的速率L-酪氨酸羟基化为3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)及其后来氧化成 多巴醌 (Korner, A. & Pawelek, J.，1982，Science, 217，1163-5)。因此酪氨酸酶活性的调节代表皮肤色素沉着的关键步骤(Kornerand Pawelek, 1982)。此外，由于皮肤色素沉着(黑素生成过程)是黑色素瘤病的标志，酪氨酸酶活性的控制可提供治疗患有这种类型癌症的患者的基础。例如与色素沉着相关的皮肤疾病难于治疗，尤其在深肤色的个体或其它皮肤相关疾病中。尽管有很多可用的有效的治疗方法，但是有与目前可用的药物相关的潜在的显著的副作用。用于治疗皮肤疾病的常用药物包含对苯二酚、羟基酚类化学品，它们抑制酶酪氨酸酶，因而减少DOPA向黑色素的转化。在这方面，其它一些可能的作用机制可包含黑素细胞的破坏、黑素体的降解，及DNA和RNA合成的抑制。目前正在研究和开发其它酚类制剂， 例如N-乙酰基-4-胱氨基苯酹(Nacety 1-4-cystaminylphenol) (NCAP)。还使用包括维甲酸、阿达帕林、局部用皮质留类、壬二酸、熊果苷、曲酸和甘草提取物的非酚类制剂治疗皮肤疾病。多数已知的治疗皮肤疾病的方法对患者具有严重的副作用。因此，本发明的目的为进一步探索治疗皮肤疾病的方法。发明内容—个方面，本发明提供了一种治疗皮肤疾病或预防皮肤疾病发生或改变皮肤色素沉着的方法。所述方法包括以药学有效量的组合物对患者给药，所述组合物包含至少一种维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的另外的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的成分。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，包含至少一种维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分选自由抗氧化剂、酪氨酸酶抑制剂、多酚、 维生素、抗酪氨酸酶RNA干扰剂、抗酪氨酸酶肽或它们的混合物组成的组中。再一方面，本发明提供了一种包含上面限定的药物组合物的药膏或乳脂。另一方面，本发明提供了一种产品，包含酰化3，4- 二氢-2，5，7，8-四甲基-2-(4，8，12-三甲基-11-三癸烯基)-2Η-1-苯并吡喃-6-醇，或由酰化3，4- 二氢-2，5，7，8-四甲基-2-(4, 8，12-三甲基-11-三癸烯基)_2Η_1_苯并吡喃_6_醇组成。

在与非限制的实施例和附图结合的同时参考的详细说明考虑，本发明更易于理解，其中
图1说明了显示生育三烯酚(贝塔Τ3)、Y-生育三烯酚(ΥΤ3)、δ-生育三烯酚(ST3)、曲酸和α熊果 苷对Β16黑素瘤细胞的处理分别在高浓度下抑制Β16黑素瘤细胞活性的实验结果。在处理后24小时用MTT细胞活性分析确定在Β16黑素瘤细胞中，Α)分别的α生育三烯酚UT3)和β-生育三烯酚(βΤ3)，B)分别的Y-生育三烯酚UT3) 和δ -生育三烯酚(δ Τ3)，C)分别的曲酸和乳酸钠和D) α熊果苷的抗增殖作用。
图2说明在分别用Α) δ -生育二稀酌· ( δ Τ3)和Y _生育二稀酌· ( Y T 3) , B) β _生育三烯酚(βΤ3)、曲酸和α熊果苷处理的Β16黑素瘤细胞中细胞凋亡分子的免疫印迹结果。注意分别用生育三烯酚、Y-生育三烯酚、S-生育三烯酚、曲酸和α熊果苷对Β16 黑素瘤细胞的处理以随剂量变化的方式诱导临界的细胞凋亡分子(裂解的半胱天冬酶3和 PARP)ο
图3说明了显示在分别用α -生育酚(α TP)、α -生育三烯酚(α Τ3)、β -生育三烯酚(β Τ3)、δ -生育三烯酚(δ T 3)、Y -生育三烯酚(Y T 3)、乳酸钠和曲酸处理的Β16 黑素瘤细胞中的酪氨酸酶活性的实验结果。Α)在分别用δ-生育三烯酚和Y-生育三烯酚、乳酸钠、曲酸、α-生育酚(αΤΡ)对Β16黑素瘤细胞的处理后没有观察到酪氨酸酶mRNA 的变化。B)分别用α -生育酚(α TP)、α -生育三烯酚(α Τ3)、β -生育三烯酚(β Τ3))、Y-生育三烯酚(Y T 3)和δ -生育三烯酚(δ T 3)处理的Β16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的免疫印迹结果。用20μΜ的ΥΤ3和δ Τ3处理Β16黑素瘤细胞抑制了酪氨酸酶蛋白表达。注意δ T3是最有效的酪氨酸酶蛋白的抑制剂。
图4说明了显示在分别用棕榈富含生育三烯酚的部分(棕榈TRF)、棕榈TRF乙酸酯、曲酸和乳酸钠、Y -生育三烯酚U T 3)、δ -生育三烯酚(δ T 3)、Υ -生育三烯酚乙酸酯(Y Τ3乙酸酯)和δ-生育三烯酚乙酸酯(δ T 3乙酸酯)处理的Β16黑素瘤细胞中的酪氨酸酶活性的免疫印迹结果。Α)分别用20 μ M的棕榈TRF和棕榈TRF乙酸酯处理Β16细胞抑制了酪氨酸酶的蛋白表达。B)分别用20μ M的曲酸和乳酸钠处理Β16黑素瘤细胞没有抑制酪氨酸酶的蛋白表达。只有在分别用高很多的浓度的曲酸和乳酸钠处理时观察到酪氨酸酶的抑制。C)分别用20 μ M的Y T 3乙酸酯和δΤ3乙酸酯处理Β16黑素瘤细胞抑制了酪氨酸酶蛋白表达。
图5说明了显示用各种浓度的曲酸、乳酸钠、α-熊果苷和Y-生育三烯酚琥珀酸酯(Y Τ3琥珀酸酯)处理的Β16黑素瘤细胞中的酪氨酸酶活性的免疫印迹结果。Α)用多达100 μ M的曲酸和乳酸钠分别处理Β16细胞未抑制酪氨酸酶蛋白的表达。B)用多达 60 μ M的熊果苷和Y T 3琥珀酸酯分别处理Β16细胞未抑制酪氨酸酶蛋白的表达。C)只有在高很多的浓度(ImM)处理时观察到α熊果苷对酪氨酸酶的抑制。
图6说明了显示分别用δ-生育三烯酚(δ Τ3)、Y-生育三烯酚U T 3)、乳酸钠、曲酸、α -生育酚(α TP)和棕榈富含生育三烯酚的部分(棕榈TRF)处理超过24小时和 48小时的Β16黑素瘤细胞中的酪氨酸活性的免疫印迹结果。在48小时的培养周期后，在 Β16细胞中Y Τ3和δ T 3对酪氨酸酶的抑制增强。相反地，在48小时后，乳酸钠和曲酸的抗酪氨酸酶活性减小。值得注意的是，与Y Τ3和δ T 3相比，20 μ M的棕榈TRF具有更低的抗酪氨酸酶活性，而a TP对酪氨酸酶的抑制没有影响。
图7Α说明了分别用20 μ M的棕榈富含生育三烯酚的部分(棕榈TRF)、20 μ M的Y-生育三烯酚(Y -Τ3)和20 μ M的δ -生育三烯酚(δ -Τ3)处理后，在第4天和第15天测量的Β16黑素瘤细胞的随时间变化的酪氨酸酶活性。柱形图，3次检验测量的平均值；条， 标准方差。
图7Β说明了分别用20 μ M的Υ -生育三烯酚U Τ3)、20 μ M的δ -生育三烯酚 (δ -Τ3)、20 μ M的a-生育酚(a TP)、3. 5mM的曲酸和4. 5mM的乳酸钠处理后，在第5天和第9天测量的B16黑素瘤细胞的随时间变化的酪氨酸酶活性。注意Y T3在第9天显著地抑制了酪氨酸酶的活性。
图7C说明了分别用20 μ M的Υ -生育三烯酚U Τ3)、20 μ M的δ -生育三烯酚 (δ -Τ3)、20 μ M的a-生育酚(a TP)、3. 5mM的曲酸和4. 5mM的乳酸钠处理后，在第5天和第9天测量的B16黑素瘤细胞的随时间变化的黑色素合成的抑制。注意直到第9天YT3 显著地抑制了黑色素含量。
图8A说明了分别用20 μ M的Υ -生育三烯酚U Τ3)、20 μ M的δ -生育三烯酚 (δ -Τ3)、20 μ M的富含生育酚部分92%(Τ92)、3· 5mM的曲酸和4. 5mM的乳酸钠和ImM熊果苷处理后，在第5天测量的B16黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性。
图8B说明了分别用20 μ M的Υ -生育三烯酚U Τ3)、20 μ M的δ -生育三烯酚 (δ -Τ3)、20 μ M的富含生育酚部分92%(Τ92)、3· 5mM的曲酸和4. 5mM的乳酸钠和ImM熊果苷处理后，在第5天测量的B16黑素瘤细胞的黑色素含量。
图9说明了分别用Y -生育三烯酚U T3)、δ -生育三烯酚(δ -Τ3)、α -生育三烯酚(α-Τ3)、富含生育酚部分92%(Τ92)、曲酸和乳酸钠处理后，Β16黑素瘤细胞中抗色素沉着的效力。继代培养Β16细胞，用ΥΤ3和δΤ3、α TP、富含生育三烯酚部分92%、曲酸和乳酸钠处理，然后收获。给细胞颗粒照相。应注意到，用20μΜ的ΥΤ3和δΤ3、Τ92，和 3. 5mM的曲酸处理Β16细胞导致更少的细胞色素沉着。相反地，20 μ M的α ΤΡ、曲酸和乳酸钠产生具有与对照相当的色素沉着水平的细胞颗粒。
图10说明了分别用α -生育酚(α TP)、Y -生育三烯酚U Τ3)、δ -生育三烯酚 (S-T3)、富含生育酚部分92%(Τ92)和熊果苷处理后，Β16黑素瘤细胞中抗色素沉着的效力。继代培养Β16细胞，用ΥΤ3和δΤ3、αΤΡ、富含生育三烯酚部分92% (Τ92)和α熊果苷处理，然后收获。给细胞颗粒照相。注意到，用20μΜ的ΥΤ3和δΤ3、Τ92和ImM的α 熊果苷处理Β16细胞导致更少的细胞色素沉着。相反地，20μΜ的αΤΡ、α熊果苷产生具有与对照相当的色素沉着水平的细胞颗粒。
图11说明了在裸鼠中抗色素沉着效力和肿瘤的缩小，其中将预处理的Β16黑素瘤细胞异体移植到裸鼠的侧腹。将用20 μ M的Υ -生育三烯酚(Y T 3)预处理I周的5X IO5 的Β16细胞异体移植到裸鼠的侧腹。然后，以50mg/kg/天的剂量补充YT3两周。在两周的处理结束时拍摄实体瘤的照片。
图12说明了在裸鼠中抗色素沉着效力和肿瘤的缩小，其中将预处理的Β16黑素瘤细胞异体移植到裸鼠的侧腹。将分别用20 μ M的δ -生育三烯酚(δ T 3)和棕榈富含生育三烯酚部分92%(Τ92)预处理I周的5Χ IO5的Β16细胞移植到裸鼠的侧腹。然后，以50mg/ kg/天的剂量分别补充δ Τ3和Τ92两周。在两周的处理结束时拍摄实体瘤的照片。
图13说明分别用Y -生育三烯酚(Y Τ3)、δ -生育三烯酚(δ Τ3)和棕榈富含生育三烯酚部分(棕榈TRF)处理的裸鼠的肿瘤大小。在实验的开始和结束时测量肿瘤大小 。
图14说明了在人体试验中检验的棕榈富含生育三烯酚部分(TRF)的降低色素沉着的性质。用含2%的棕榈TRF的Kose Prime乳脂处理受试者I个月的前后，拍摄受试者脸上老人斑。对照受试者未显示老人斑的改善(n=13)。
图15A说明了在用棕榈富含生育三烯酚部分92%(T92)、Y -生育三烯酚(Y T 3)、 δ -生育三烯酚(δ T 3)和Τ92乙酸酯(T92Ac)预处理，然后暴露于UV 10分钟(短波和长波UV)的Β16黑素瘤细胞中，UV对Β16黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性的影响。柱形图，3次检验测量的平均值；条，标准方差。
图15Β说明了在用棕榈富含生育三烯酚部分92%(Τ92)、Y -生育三烯酚(Y T 3)、 δ -生育三烯酚(δ T 3)和Τ92乙酸酯(T92Ac)预处理，然后暴露于UV 10分钟(短波和长波UV)的Β16黑素瘤细胞中，UV对黑色素含量的影响。柱形图，3次检验测的平均值；条，标准方差。注意到，ΥΤ3、δ Τ3和Τ92显著地抑制黑色素的含量。柱形图，3次检验测的平均值；条，标准方差。
图16Α说明了显示在不同的时间段内Β16黑素瘤细胞活性的实验结果。暴露于UV 超过60分钟诱导Β16细胞的凋亡。
图16Β说明了在暴露于UV 10分钟、60分钟和12小时后在Β16黑素瘤细胞中细胞凋亡分子的免疫印迹结果。注意到，Β16黑素瘤细胞暴露于UV 12小时诱导临界的细胞凋亡分子(裂解的半胱天冬酶3和PARP)。
图16C至E说明了用Y -生育三烯酚(Y Τ3)、δ -生育三烯酚(δ T 3)、棕榈富含生育三烯酚部分92% (棕榈TRF)和棕榈富含生育三烯酚部分乙酸酯(棕榈TRF乙酸酯)处理的Β16细胞暴露于UV I分钟、10分钟、30分钟和60分钟后酪氨酸酶蛋白表达的效果。YT 3、δΤ3和棕榈TRF显著地抑制了暴露于UV的Β16细胞中的酪氨酸酶蛋白表达。
图17Α说明了与单独使用一种制剂相比，用棕榈富含生育三烯酚部分92% (棕榈 TRF)和曲酸处理的Β16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性和黑色素含量的协同效应。用20 μ M 的棕榈富含生育三烯酚部分92%(棕榈TRF)，及O. 05%的乳酸钠(4. 5mM)或曲酸(3. 5mM)中的一种处理B16细胞24小时。共处理后对酪氨酸酶活性和黑色素含量的抑制显著大于单独用任一种处理的细胞。
图17B说明了与单独使用一种制剂相比，显示用Y-生育三烯酚U T3)，及曲酸或乳酸钠处理的B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的协同效应的免疫印迹结果。根据这个结果，5μ M的Υ Τ3与ImM的乳酸钠或曲酸的共处理对酪氨酸酶蛋白抑制的增强。
图17C说明了与单独使用一种制剂相比，显示用δ-生育三烯酚(δ Τ3)，及曲酸或乳酸钠处理的Β16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的协同效应的免疫印迹结果。根据这个结果，5μ M的δ Τ3与ImM的乳酸钠或曲酸的共处理导致对酪氨酸酶蛋白抑制的增强。
图18Α至18C说明了显示了与单独使用任一个制剂相比，当用Y-生育三烯酚 (Y T 3) (10 μ Μ)和α熊果苷(50 μ Μ)(图18Α)共处理，或用对苯二酚(20 μ Μ)处理(图 18Β)处理，或用L-谷胱甘肽(10 μ Μ)(图18C)处理时，Β16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的协同效应的免疫印迹结果。
图18D说明了显示与未转染的Β16细胞相比，用mi434-5P microRNA转染并用 Y-生育三烯酚(Y T3)处理的B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的免疫印迹结果。
图18E说明了显示与单独用任一种制剂相比，当用Y-生育三烯酚UT3) (10 μ Μ)和维甲酸(2ηΜ)共处理时，Β16黑素瘤细胞中酪氨酸酶表达的免疫印迹结果。

本发明的第一个方面涉及一种通过以药学有效量的组合物对患者 给药，治疗皮肤疾病或预防皮肤疾病发生或改变皮肤色素沉着的方法，包所述组合物包含至少一种维生素 E成分和至少一种与维生素E不同具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。
已经证明包含至少一种维生素成分，如Y -生育三烯酚(Y T 3)、δ -生育三烯酚 (δ T 3)或富含生育三烯酚部分(TRF)的组合物，例如，通过防止酪氨酸酶蛋白的持续活化抑制了诸如Β16黑素瘤细胞的细胞中持续的黑色素合成。还已经证明本发明涉及的维生素 E成分，例如Y-生育三烯酚(Y Τ3)或δ-生育三烯酚(δ T 3)，与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分具有协同效应，所述附加成分例如但不限于乳酸钠、曲酸或维甲酸。这些发现得到了从这里提及的实验结果观测到的体外与体内数据的支持。本发明该方面的普遍原理可在图17和图18中证明，图17和图18是基于这样的实施例，其中与只使用一种成分相比，包含至少一种维生素E成分，例如Y-生育三烯酚(Y T 3)、δ -生育三烯酚(δ T 3)，和与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分，例如乳酸钠、曲酸、α熊果苷、对苯二酚、L-谷胱甘肽或mi434-5P microRNA分子，的组合物呈现出显著的酪氨酸酶蛋白抑制。
这里使用的术语“治疗”或“处理”旨在涉及提供药学有效量的组合物，所述组合物包括至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分，所述组合物能充分起到防止虚弱和/或不健康状态的发展的预防作用；和/或提供充足量的所述组合物或其药物给受试者或患者，以减轻或消除疾病状态/ 紊乱，和/或疾病状态/紊乱的症状，和虚弱和/或不健康状态。
“预防皮肤疾病发生”是指预防或阻碍皮肤疾病发生的作用。在目前情况下，给药此处提到的组合物具有使皮肤疾病不能在患者或动物体内发展的效力。预防不同于“治疗” 在于此处提到的组合物将用于治疗在患者或动物体内已经存在的皮肤疾病，或换句话说， 治疗已经患皮肤疾病的患者或动物身体。
通常，认为“皮肤疾病”是指任何症状、紊乱或疾病，例如癌和与皮肤、皮毛、毛发、 指甲、口和生殖膜和腺相关的表面和老化疾病。皮肤病症可表现为可见的损伤的形式、发生前损伤、疼痛、接触敏感、发炎、炎症等形式。皮肤病症包括但不限于皮肤和毛囊皮脂腺单位或角质生成过程的疾病。例如，皮肤病症可为上皮或真皮，或位于表皮、真皮、皮下层的毛囊皮脂腺单位内部或周围，或它们组合的疾病。皮肤病症的实例包含但不限于痤疮、秃头症、 牛皮癣、皮脂溢、向内生毛和须部假性毛囊炎、色素沉着的皮肤、皮肤感染、扁平苔癣、小棘状苔藓及脱发性毛囊炎、口周黑子炎症、红斑痤疮、化脓性汗腺炎、蜂窝组织炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮等。
一些实施方式中，可用这里说明的组合物预防或治疗的皮肤病症的类型例如可包括表皮疾病。表皮疾病可例如包括由增加的黑色素引起的皮肤暗沉、皮肤色素沉着过度、皮肤炎症、皮肤普通痤疮、伤口愈合、皮肤光老化、皮肤皱纹、吸烟者的黑变病、黑斑病、黑棘皮病、库兴氏病、爱迪生氏病、黑线、汞中毒，仅举几例。
“改变皮肤的色素沉着”是指皮肤天然颜色(色素)的变化。可指皮肤的色素沉着水平或量的下降。在一些实施方式中，给药这里提到的组合物可减少黑色的实际皮肤损伤， 或例如可预防或阻止皮肤暗区的扩大。实际的皮肤损伤可为，例如由年龄、过量的太阳暴露或引起皮肤暗区的疾病或紊乱。这些疾病可包括，例如这里提及的皮肤疾病的任一种。在其它实施方式中，给药这里提到的组合物可减小察觉到的黑色的皮肤损伤。这意味着皮肤损伤可被个人感知，因此他的或他的皮肤阴影是深色的，其不易定具有实际的皮肤损伤而只是(为了美容)期望减轻皮肤阴影。
如此处所述，为了治疗皮肤疾病或防止皮肤疾病发生或改变皮肤色素沉着的治疗，使 用包含至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和 /或抗黑素生成活性的附加成分的组合物。维生素E由两种主要成分组成-生育酚(T)和生育三烯酚(T3)。生育三烯酚(T3)主要发现于棕榈油中。与生育酚一起，他们为所有活细胞提供抗氧化活性的重要来源。这个普通的抗氧化属性反应了生育三烯酚和生育酚的化学结构的相似性，生育三烯酚和生育酚仅区别于它们结构的侧链(生育三烯酚包含法呢基 (farnesyl)或生育酚包含饱和的植基侧链)。来自色原烷醇环上羟基的普通氢原子起到清除链增长过氧化自由基的作用。基于甲基在其色原烷醇环上的位置，生育酚和生育三烯酚可分成4种同分异构形式阿尔法U)、贝塔(β)、伽玛(Y)和德尔塔(δ)。
存在不同的生育酚的生育三烯酚同型异构体(参考通式I和通式II)。生育酚由分别源自尿黑酸(HGA)和植基二磷酸的色原烷醇环和15碳链组成。另一方面，生育三烯酚与生育酚在结构上的区别在于在碳链中存在3个反式双键。通式I和通式II和下面的说明提供了关于已知的生育酚(T)和生育三烯酚(Τ3)异构体的概述。


本申请涉及通过以药学有效量的组合物对患者给药治疗皮肤疾病或预防皮肤疾病发生，或改变皮肤色素沉着的方法，所述组合物包含至少一种维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含至少一种所述维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。