专利名称：一种高效降解粪便的复合微生物菌剂及其制备方法与应用的制作方法随着养殖业集约化程度的提高和生产规模的不断扩大，畜禽数量飞速增加导致粪便的排放量也随之提高，大量的畜禽粪便不经处理就排放到环境中，不仅污染了环境，而且也会导致病原菌的扩散，严重危害了畜禽和人类的健康。畜禽粪便中含有丰富的粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、矿物质及氮、磷、钾等营养成分，是生产质优有机肥的廉价原料。传统的堆肥技术存在肥效低、有害微生物杀灭不彻底、发酵时间长、环境污染严重等现象。利用微生物发酵技术，通过往粪便中添加有益微生物菌可以对粪便进行杀菌、除臭、降解等一系列无害化处理，从而制得优质生物有机肥。中国专利文献CN 102093975A (申请号201010584414. 5)公开了ー种快速降解有机废弃物的复合菌剂及应用，所述的复合菌剂，由功能菌剂和特征菌剂按照体积比为2 4 I的比例复混制备而成的液态菌剂，应用于城市固体废弃物和禽畜粪便处理，以及污泥减量的技术领域。该复合菌剂可以增强堆体中总微生物区系和木质纤维素降解菌的活性，可以处理污水，但对于禽畜粪便类处理速度和效果并不理想。
本发明针对现有技术的不足，提供一种高效降解粪便的复合微生物菌剂及其制备方法与应用。一种高效降解粪便的复合微生物菌剂，其特征在干，是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC10088、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) CICC20515、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium) CICCl20611、嗜热脂肪地芽抱杆菌(GeobacillusstearothermophiIus) CICC22975、米曲霉(Asperqillus oryzae) CICC41474、长柄木霉(Trichoderma viride)ACCC30150、嗜热侧抱霉(Thermophilic sporotrichum)ACCC30346>细黄链霉菌(Streptomyces microflavus) CICC11006经固体发酵制得。根据本发明优选的，上述复合微生物菌剂每克含有是由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) CICC10088 活菌数 IO8 101° 个、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) CICC20515活菌数IO8 IOici个、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)CICC120611活菌数IO7 IO9个、嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)CICC22975 活菌数 IO7 IO9个、米曲霉(Asperqillus oryzae) CICC41474 抱子数 IO7 IO9 个、长柄木霉(Trichodermaviride) ACCC30150 抱子数 IO7 IO9 个、嗜热侧抱霉(Thermophilic sporotrichum)ACCC30346 抱子数 IO7 IO9 个、细黄链霉菌(Streptomyces microf lavus )CICC11006 抱子数IO7 IO9个。所述枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis) CICC10088、腊状芽抱杆菌(Bacilluscereus) CICC20515、巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium) CICC120611、米曲霉(Asperqillus oryzae) CICC41474、细黄链霉菌(Streptomyces microf lavus) CICC11006、嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)CICC22975均购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心；所述长柄木霉(Trichodermaviride) ACCC30150、嗜热侧抱霉(Sporotrichumthermophilic) ACCC30346均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。上述复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤 (I)将枯草芽孢杆菌CICC10088接种于LB液体培养基，在30 37°C条件下液体培养18 24h，然后按l(T20wt%的接种量接种于固体培养基A中，在30 37°C培养3 5天，制得含有枯草芽孢杆菌CICC10088活菌数8 15 X IO9个/g的固体菌剂A ；(2)将蜡状芽孢杆菌CICC20515接种于LB液体培养基，在30 37°C条件下液体培养18 24h，然后按l(T20wt%的接种量将蜡状芽孢杆菌接种于固体培养基B中，在30 37°C培养3飞天，制得含有蜡状芽孢杆菌CICC20515活菌数8 15 X IO9个/g的固体菌剂B ；(3)将巨大芽孢杆菌CICC120611接种于LB液体培养基，在30 37°C条件下液体培养18 24h，然后按l(T20wt%的接种量将巨大芽孢杆菌接种于固体培养基C中，在30 37°C培养3飞天，制得含有巨大芽孢杆菌CICC120611活菌数I 10X IO9个/g的固体菌剂C ;(4)将嗜热脂肪地芽孢杆菌CICC22975接种于LB液体培养基，在55 60°C条件下液体培养18 24h，然后按l(T20wt%的接种量将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种于固体培养基D中，在55 60°C培养3 5天，制得含有嗜热脂肪地芽孢杆菌CICC22975活菌数I 10X IO9个/g的固体菌剂D ;(5)将米曲霉CICC41474接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养48 72h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将米曲霉接种于固体培养基E中，在25 30°C培养5 7天，制得含有米曲霉CICC41474孢子数I 3X IO9个/g的固体菌剂E ;(6)将长柄木霉ACCC30150接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养48 72h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将长柄木霉接种于固体培养基F中，在25 30°C培养5 7天，制得含有长柄木霉ACCC30150孢子数I 3X IO9个/g的固体菌剂F ;(7)将细黄链霉菌CICC11006接种于PDA固体培养基，在25 30°C条件下固体培养48 72h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将细黄链霉菌接种于固体培养基G中，在25 30°C培养5 7天，制得含有细黄链霉菌CICC11006孢子数0.5 I. 5 X IO9个/g的固体菌剂G ;(8)将嗜热侧孢霉ACCC30346接种于PDA固体培养基，在40 45°C条件下固体培养48 72h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按l(T20wt%的接种量将嗜热侧孢霉接种于固体培养基H中，在40 45°C培养5 7天，制得含有嗜热侧孢霉ACCC30346孢子数0.5 I. 5 X IO9个/g的固体菌剂H;(9)取I 3重量份步骤(I)制得的固体菌剂A、1 3重量份步骤(2)制得的固体菌剂B、1 3重量份步骤(3)制得的固体菌剂C、1 3重量份步骤(4)制得的固体菌剂D、1 3重量份步骤(5)制得的固体菌剂E、1 3重量份步骤(6)制得的固体菌剂F、1 3重量份步骤(7)制得的固体菌剂G和I 3重量份步骤(8)制得的固体菌剂H进行混合，制得复合微生物菌剂。根据本发明优选的，所述固体培养基A、固体培养基B、固体培养基C和固体培养基D组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份 麸皮粉600 800份，稻壳100 300份 ，玉米面60 100份，豆柏粉10 30份，(NH4)2S044 6 份，MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6 份，KH2PO4 O. 4 O. 6 份，石灰粉 16 20 份，水1000 1200 份，pH 7. O 8. O。根据本发明优选的，所述固体培养基E和固体培养基G组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份秸杆粉500 700 份，麸皮粉 300 500 份，(NH4) 2S04 10 30 份，KH2PO4 O. 5 I. 5 份，MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6 份，水 1500 2500 份，ρΗ6· 0 6· 5。根据本发明优选的，所述固体培养基F，采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉200 400份，玉米面600 800份，过磷酸钙3 5份，水400 700份，ρΗ6· 0 6· 5。根据本发明优选的，所述固体培养基H采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉300 400 份，甘蔗渣 600 700 份，(NH4) 2S04 10 30 份，KH2PO4 I 3份，MgSO4 · 7H20 O. 4 O. 6 份，水 1000 2000 份，pH 6. 0 6· 5。上述LB液体培养基和I3DA固体培养基均为本领域常用培养基，LB液体培养基组分如下酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，用NaOH和HCl调节ρΗ7· (Γ7. 2，分装灭菌;PDA固体培养基组分如下 马铃薯汁IOOOml，葡萄糖20g，琼脂20g，溶化后分装灭菌；上述复合微生物菌剂在降解粪便中的应用。上述应用，步骤如下(I)将粪便置于发酵槽中，按照粪便30wt% 50wt%的量添加植物纤维，调节水份至40 60wt%,得到预处理物料；(2)按照预处理物料重量2 3%的量称取复合微生物菌剂，添加到步骤(I)制得的预处理物料中，混合均匀，发酵过程中通过搅拌使物料温度維持在70°C以下，发酵15 30天，含水量降至15 25%，便得到优质有机肥。上述步骤(I)中的植物纤维为作物秸杆、稻壳、木屑。上述操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。有益效果(I)所述复合微生物菌剂利用微生物腐熟，能够缩短粪便发酵时间，有效杀死粪便中的幼虫、卵、病原体，同时提高发酵后物料中有机质、全氮、全磷、全钾的含量；(2)所述复合微生物菌剂为固体形态，単位原料中含菌量高，微生物在干燥情况下以芽孢和孢子的形式存在，可长期保存，利于分装、运输及贮存；(3)所述复合微生物菌剂制备エ艺简单，生产过程不需要大型设备，生产成本低，对环境污染低。具体实施方法下面结合实施例对本发明做进ー步阐述，但本发明所保护范围不限于此。生物材料 实施例中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CICC10088、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CICC20515> 巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)CICC120611、米曲霉(Asperqillus oryzae) CICC41474、细黄链霉菌(Streptomyces microf lavus) CICC11006、嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)CICC22975均购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心；所述长柄木霉(Trichodermaviride) ACCC30150、嗜热侧抱霉(Sporotrichumthermophilic) ACCC30346均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。实施例中所述培养基原料均为本领域常用原料，均可市场购得。实施例I高效降解粪便的复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤(I)将枯草芽孢杆菌CICC10088接种于LB液体培养基，在30°C条件下液体培养24h，然后按10wt%的接种量接种于固体培养基A中，在37°C培养3天，制得含有枯草芽孢杆菌CICC10088活菌数IOXlO9个/g的固体菌剂A ；(2)将蜡状芽孢杆菌CICC20515接种于LB液体培养基，在30°C条件下液体培养24h，然后按10wt%的接种量将蜡状芽孢杆菌接种于固体培养基B中，在30°C培养3天，制得含有蜡状芽孢杆菌CICC20515活菌数8 X IO9个/g的固体菌剂B ；(3)巨大芽孢杆菌CICC120611接种于LB液体培养基，在30°C条件下液体培养24h，然后按10wt%的接种量将巨大芽孢杆菌接种于固体培养基C中，在30°C培养3天，制得含有巨大芽孢杆菌CICC120611活菌数2X109个/g的固体菌剂C ;(4)嗜热脂肪地芽孢杆菌CICC22975接种于LB液体培养基，在55°C条件下液体培养24h，然后按10wt%的接种量将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种于固体培养基D中，在55°C培养3天，制得含有嗜热脂肪地芽孢杆菌CICC22975活菌数2 X IO9个/g的固体菌剂D ；(5)将米曲霉CICC41474接种于PDA固体培养基，在28°C条件下固体培养60h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按10wt%的接种量将米曲霉接种于固体培养基E中，在28°C培养5天，制得含有米曲霉CICC41474孢子数I. 5X IO9个/g的固体菌剂E ；(6)将长柄木霉ACCC30150接种于HM固体培养基，在30°C条件下固体培养72h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按15wt%的接种量将长柄木霉接种于固体培养基F中，在30°C培养7天，制得含有长柄木霉ACCC30150孢子数I. 5X IO9个/g的固体菌剂F；(7)细黄链霉菌CICC11006接种于I3DA固体培养基，在30°C条件下固体培养60h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按10wt%的接种量将细黄链霉菌接种于固体培养基G中，在30°C培养7天，制得含有细黄链霉菌CICCl 1006孢子数IO9个/g的固体菌剂G；(8)将嗜热侧孢霉ACCC30346接种于PDA固体培养基，在45°C条件下固体培养60h，加入无菌水调整孢子浓度到IO8个/ml，然后按10wt%的接种量将嗜热侧孢霉接种于固体培养基H中，在45°C培养7天，制得含有嗜热侧孢霉ACCC30346孢子数IO9个/g的固体菌剂H;(9 )取相等重量步骤(I)制得的固体菌剂A、步骤(2 )制得的固体菌剂B、步骤(3 )制得的固体菌剂C、步骤(4)制得的固体菌剂D、步 骤(5)制得的固体菌剂E、步骤(6)制得的固体菌剂F、步骤(7)制得的固体菌剂G和步骤(8)制得的固体菌剂H进行混合，制得复合微生物菌剂。所述固体培养基A、固体培养基B、固体培养基C和固体培养基D组分相同,均采用如下原料混合、经灭菌后制得麸皮粉80kg,稻壳 IOkg,玉米面 8kg,豆柏粉 2kg, (NH4)2SO4 O. 5kg, MgSO4 · 7H2O
O.05kg, KH2PO4 O. 05kg，石灰粉 I. 8kg，水 100L, pH 7. 4。所述固体培养基E和固体培养基G组分相同，均采用如下原料混合、经灭菌后制得秸杆粉60kg，麸皮粉 40kg，(NH4)2SO4 2kg，KH2PO4 O. 1kg，MgSO4 · 7H20 0. 05kg，水200L，pH 6. O0所述固体培养基F，采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉30kg,玉米面70kg,过磷酸I丐O. 4kg,水50L, pH 6. O。所述固体培养基H采用如下原料混合、经灭菌后制得，原料均为重量份麸皮粉35kg，甘蔗渣 65kg，(NH4)2SO4 2kg，KH2PO4 O. 2kg，MgSO4 · 7H20 0. 05kg，水150L, pH 6. 0。经检测，制得的降解粪便的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)活菌数 I. 25X IO9 个、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)活菌数IO9个、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)活菌数2. 5X IO8个、嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophi Ius )活菌数 2.5X108 个、米曲霉(Asperqillusoryzae)抱子数 I. 87X IO8 个、长柄木霉(Trichoderma viride)抱子数 1.87X108 个、细黄链霉菌(Streptomyces microf lavus)抱子数 I. 25 X IO8 个、嗜热侧抱霉(Sporotrichumthermophilic)抱子数 I. 25X IO8 个。实施例2采用如实施例I所述的方法，不同之处在于，步骤(9)固体菌剂A、固体菌剂B、固体菌剂C、固体菌剂D、固体菌剂E、固体菌剂F、固体菌剂G和固体菌剂H的混合重量比为3l3l3l3lo经检测，制得的降解粪便的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)活菌数 I. 87 X IO9 个、錯状芽抱杆菌(Bacillus cereus)活菌数5X IO8个、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)活菌数3. 57X IO8个、嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)活菌数 I. 25X IO8 个、米曲霉(Asperqillusoryzae)抱子数 2. 81 X IO8 个、长柄木霉(Trichoderma viride)抱子数 9. 37 X IO7 个、细黄链霉菌(Streptomyces microf lavus)抱子数 I. 87X IO8 个、嗜热侧抱霉(Sporotrichumthermophilic)抱子数 6. 25X IO7 个。实施例3采用如实施例I所述的方法，不同之处在于步骤(9)固体菌剂A、固体菌剂B、固体菌剂C、固体菌剂D、固体菌剂E、固体菌剂F、固体菌剂G和固体菌剂H的混合重量比为2
I : I : I : 2 : I : I : I。 经检测，制得的降解粪便的复合微生物菌剂中，每克复合微生物菌剂含有枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)活菌数2X IO9个、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)活菌数8X IO8个、巨大芽孢杆菌(BaciIIus megaterium)活菌数2X IO8个、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)活菌数 2X IO8 个、米曲霉(Asperqillus oryzae)孢子数3X IO8个、长柄木霉(Trichoderma viride)孢子数I. 5X IO8个、细黄链霉菌(Streptomyces microf lavus)抱子数 IO8 个、嗜热侧抱霉(Sporotrichum thermophilic)抱子数IO8个。实施例4上述复合微生物菌剂在降解猪粪便中的应用，步骤如下(I)将300kg猪粪便与IOOkg玉米秸杆置于发酵槽中，调节水份至55wt%，得到预处理物料；(2)称取8kg复合微生物菌剂，添加到步骤(I)制得的处理粪便中，混合均匀，发酵过程中通过搅拌使物料温度維持在70°C以下，发酵20天左右，含水量降至20%左右，臭气消失，便得到优质有机肥。按上述方法分别对实施例I、实施例2和实施例3制得的复合微生物菌剂进行试验，分别为处理I、处理2、处理3。粪便在降解过程中，温度变化显示了微生物对粪便的作用效果，在发酵过程中，每隔一段时间记录粪便的发酵温度，结果如表I所示。种子发芽指数(GI)是用来检测堆肥对植物有无毒性，当GI大于50%时就可以认为基本无毒，当达到80%以上就可以认为对植物没有毒性。具体方法如下培养皿内垫ー张滤纸，均匀放入20颗黄瓜种子，加入堆肥浸提液(样品按固液比I :5浸提30min)5. OmL，在30°C黑暗的生化培养箱中恒温保湿培养48h后，测定发芽率和根长，根据式(I)计算种子的发芽指数，以蒸馏水作空白対照。发芽指数(GI)=(处理发芽率X处理根长)/ (空白发芽率X空白根长)X 100%Cl)在发酵过程中每隔一段时间记录粪便的发芽指数，结果如表3所示。待发酵结束后，采用农业标准NY525-2002测定含水量、有机质、全氮、全磷、全钾的含量，结果如表5所不。实施例5上述复合微生物菌剂在降解鸡粪便中的应用，步骤如下(I)将300kg鸡粪便与140kg杂木屑置于发酵槽中，调节水份至55wt%，得到预处理物料；(2)称取9kg复合微生物菌剂，添加到步骤(I)制得的处理粪便中，混合均匀，发酵过程中通过搅拌使物料温度維持在70°C以下，发酵20天左右，含水量降至20wt%左右，臭气消失，便得到优质有机肥。按上述方法分别对实施例I、实施例2和实施例3制得的复合微生物菌剂进行试验，分别为处理4、处理5、处理6。检测方法与实施例4相同，实验结果如表2、表4、表6所不。对照例I (I)将300kg猪粪便与IOOkg玉米秸杆置于发酵槽中，调节水份至55wt%进行发酵，发酵过程中通过搅拌使物料温度維持在70°C以下，发酵30天左右。检测方法与实施例4相同，实验结果如表I、表3、表5所不。对照例2參照中国专利文献CN 102093975A中实施例I所记载的技术方案配制对比菌剂，按照本申请实施例4的方法施用上述对比菌剂。检测方法与实施例4相同，实验结果如表I、表3、表5所不。对照例3(I)将300kg鸡粪便与140kg玉米秸杆粉置于发酵槽中，调节水份至55wt%进行发酵，发酵过程中通过搅拌使物料温度維持在70°C以下，发酵30天左右。检测方法与实施例5相同，实验结果如表2、表4、表6所不。对照例4參照中国专利文献CN 102093975A中实施例I所记载的技术方案配制对比菌剂，按照本申请实施例5的方法施用上述对比菌剂。实验结果如表2、表4、表6所不。结果检测表I不同处理猪粪便对发酵温度的影响(V )


本发明涉及一种高效降解粪便的复合微生物菌剂及其制备方法与应用，复合微生物菌剂是由枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、米曲霉、长柄木霉、嗜热侧孢霉、细黄链霉菌经固体发酵制得。该复合微生物菌剂能够缩短粪便发酵时间，有效杀死粪便中的幼虫、卵、病原体，同时提高发酵后物料中有机质、全氮、全磷、全钾的含量。