专利名称：杀线虫生防菌代谢物及其制备方法 植物寄生线虫是植物病害的重要病原物之一，由于其寄生范围广，环境适应性强，几乎每种作物都受到线虫侵害，由于线虫的危害日趋严重，对农作物生产构成严重威胁，每年由于植物寄生线虫危害造成全球农作物方面的损失高达1000亿美元(Sasser&Freckman，1987)，占整个病虫害引起损失的2/3。我国地处温带和亚热带，气候适宜于线虫的活动和繁殖，世界性重要植物线虫病害在我国均有发生。尤其是随着耕作制度的改革和复种指数的提高，大豆、蔬菜、小麦、水稻、花生、果树等植物的线虫病害发生危害越来越严重，损失也日益严重。目前，甘薯茎线虫在我国的甘薯基地卢龙泛滥成灾，减产60-70％，严重时造成绝产，当地农民深受其害；大豆孢囊线虫在我国的发生面积常年在2000万亩以上，造成产量损失15-20％，严重的达50-80％以上；蔬菜根结线虫在保护地中造成的损失达20-30％，严重地可达70％，甚至绝产，如番茄及黄瓜根结线虫病在华北、西北等保护地和华南露地泛滥成灾；花生根结线虫病在山东发生有40多年历史，对花生产量影响极大，严重的减产70-80％；目前被称为“松树癌症”的松材线虫病在我国的发生呈蔓延扩散的趋势，松材线虫肆虐，在距著名风景区黄山70公里的地方已有松材线虫危害而引起我国政府的高度关注；特别是植物线虫与细菌、真菌、病毒等多种病原物共同作用造成对植物的复合侵染，其危害更严重、损失更大。植物线虫病害使我国各种作物年平均产量损失达10-15％。所以植物寄生线虫，已成为全世界农作物产量的一个不容忽视的限制性重要因素，引起了世界各国的高度重视。要提高农作物的产量，治理土壤及植物寄生线虫在近几年已成为一个全球性的、新的、迫切需要解决的重要问题。目前化学农药仍然是控制植物线虫病重要的措施之一，但杀线虫剂的品种甚少。全世界约30种，常用的不过10余种。有的杀线虫剂被发现有致畸、致癌、导致不育等剧毒作用，被撤消注册商标、禁止停用，有的在被重新审查。由于缺乏有效和安全的杀线虫剂，现有化学杀线虫剂多为剧毒农药。其用量高、花费大、且带来人畜中毒、污染地下水源及食品等严重问题。恰恰相反，生物防治克服了上述问题。因此线虫的生物防治日益受到世界各国的普遍重视(RobinN.Heuttel，1996)，成为线虫病害防治研究的重点和热门；目前线虫病害的生物防治发展趋势是利用真菌、细菌等微生物资源开发生物农药来代替化学农药。但是当前线虫生防存在以下的主要问题 1.目前，线虫生防中研究最多的生防因子有捕食线虫真菌、内寄生真菌和寄生性细菌，这些为第一代线虫生防因子。此类线虫生防制剂系属活菌剂，所以存在着以下缺点1)受环境因素影响大，如温度、各地土壤条件不同并存在不同程度的抑菌作用等而导致其稳定性较差、效果不一致等；2)为保证菌体存活率，在保存上有较严格的条件限制、由于活菌剂不好保存，使得货架期较短；3)活菌一般行专性寄生，即专一性强，因此杀虫谱较窄。上述问题的存在使第一代线虫生防制剂(活菌剂)的应用受到限制，尚未广泛及大规模生产和应用。2.为克服活菌剂使用上的缺点，目前人们更加重视线虫生防第二代产品，即对微生物菌株的次生代谢产物的研究。这是当前国内外研究的热门领域。特别是从真菌代谢物中寻找杀线虫活性物质已成为新的研究热点，国内也已开始重视对杀线虫真菌代谢物的开发研究，但已发现的真菌杀线虫代谢物大多为脂溶性，水中溶解度较差，需加增效剂来助溶，这给真菌代谢物的实际应用造成了困难。另外，大多数的微生物代谢物中的目标化合物浓度较低，需要进行浓缩后才可使用；再有，有些代谢物对腐生线虫(土壤中的自由生活线虫)有较强活性，而对使农作物和林木受到严重危害的根结线虫和松材线虫活性小，甚至没有活性；因此，实验应以造成严重危害的松材线虫和根结线虫来衡量代谢物生防潜力的高低，而且也应以此作为筛选菌株的基本依据(董锦艳等2001)。3.丝状真菌在工农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用。关于利用丝状真菌代谢物防治线虫的报道涉及较少(报道最多的是淡紫拟青霉，其次是长臂木霉)，而有关利用丝状真菌总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)代谢产物杀线虫及产业化方面的研究尚未见报道。综上所述，现在对防治线虫病害生物农药的市场需求量很大，但却缺少合适的生防制剂，市场存在很大空白。因此，目前急需筛选高效、广谱杀线虫活性物质产生菌及水溶性代谢物，以便开发新型实用制剂，这是当务之急。


本发明解决的问题针对上述问题，本发明提供了一种成本低、杀线虫活性高、杀虫谱广、热稳定性强、水溶性的新型杀线虫生物农药。它不仅克服了化学农药毒性的危害，而且克服了第一代线虫生防活菌剂，受环境因素影响大的种种弊病，同时还解决了多数第二代线虫生防因子属于脂溶性、水中溶解度较差，给使用带来的困难。从而为生物防治植物寄生线虫病害、开发新型微生物杀线剂，实现其产业化奠定基础。
技术方案本发明的杀线虫生防菌代谢物，它是活性菌株总状共头霉(Syncephalastrumracemosum)的代谢产物；其杀线虫活性组分的基本组成为带两个结晶水的乙二酸、8配位钾的乙二酸配合物、含氨基化合物和其它有机酸；在该代谢物中活性组分含量之和为100％。其中带两个结晶水的乙二酸、8配位钾的乙二酸配合物和其它有机酸含量之和不小于80％，且其之间的含量比为(2.5-3.5)∶(1.8-2.5)∶(1.5-2.5)。其它有机酸包括酒石酸、苹果酸、乳酸，其三者含量之和，占其它有机酸含量的90-95％。此外还含丙二酸等。
该代谢物的活性成分8配位钾的乙二酸配合物，为一种新型结构物，其分子式为K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，结构如图1所示； 两个结晶水的乙二酸分子式为(H2C2O4)(H2O)2；该生防菌代谢物的特性溶解性为水溶性，并能以任意比溶于水；热稳定性121℃处理15-20min，活性不低于原活性的95％；生物活性取1ml发酵原液作用1500条松材线虫，线虫死亡率为100％；将发酵原液稀释一倍后，取1ml作用1500条松材线虫，线虫死亡率为70-95％；杀线虫谱；它可广泛用于松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫重要植物寄生线虫病害的生物防治。
杀线虫生防菌代谢物的制备方法，是以总状共头霉(Syncephalastrumracemosum)为菌种，通过液体通气培养菌株而产生活性代谢产物，然后进行剂型加工制得；具体步骤如下●菌种的培养菌株斜面保存使用马铃薯蔗糖麦芽精培养基即PSM培养基；斜面菌种26℃静置培养6-7天，然后放入4℃冰箱保存；●活性代谢物的制备将上述斜面菌种，进行液体培养，液体培养选择PSM培养基、马铃薯蔗糖PS培养基、普通蛋白胨蔗糖培养基、马铃薯甘油培养基中的一种；初始pH可调范围3.5-8；再经真空抽滤，获得含活性代谢物的发酵原液；液体培养从下述两种方法中任选一种1)、摇瓶培养用无菌水洗下斜面孢子，制成孢子悬液，在500毫升三角瓶中，以每75-125毫升液体培养基中加入104-107孢子，转速120-220rpm，培养4-6天；2)、发酵罐发酵首先进行一级种子的制备，即用无菌水洗下斜面孢子，制成孢子悬液，以每100毫升液体培养基中加入106孢子，26℃，pH4-6，静置或者170rpm振荡培养21-30小时；然后在发酵培养基中接种3-5％的一级种子，26℃，通气搅拌，发酵36-68h，发酵罐发酵时间也可以是45-60h；通气量为1∶0.5-1∶0.75，转速为300-350rpm；●剂型加工将上述获得的含活性代谢物的发酵原液，按照下述一种方法进行处理A.发酵原液可直接作为杀线虫生防制剂使用；B.浓缩液发酵原液经过薄膜蒸发，制备成浓缩水剂；C.粗制粉剂发酵原液经真空冷冻干燥制得。
需要说明的是，液体培养基是马铃薯蔗糖麦芽精培养基(PSM培养基)即300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖，麦芽精2g/L；或马铃薯蔗糖培养基(PS培养基)即200-300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖；初始pH为4-6。
摇瓶培养也可以是以每100毫升液体培养基中加入104-106孢子，转速120-170rpm，培养4-6天；
摇瓶培养时采用下述三种方法中的任意一种培养方式A.26℃静置培养6-7天；B.温度为26℃，用120-220rpm摇床培养4--6天，以104-106孢子数接种于20020的PS培养基中，培养基的初始pH为4-6；C.从28-18℃，170rpm摇床变温培养4-7天。
该代谢物具有杀线虫的广谱性，可用于松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫、重要植物寄生线虫病害的生物防治。此外还可用于黄瓜、芹菜等蔬菜寄生线虫的生物防治。
热稳定性检测试验将获得的活性菌株发酵液，放在高压灭菌锅中，在121℃、灭菌20min，然后测定其生物活性，与未灭菌发酵液生物活性相比，仅降低2％左右，证明该活性代谢物具有热稳定性。
发酵滤液生物活性检测方法用松材线虫作为供试线虫，在96孔细胞培养板中依次加入0.2ml1/2浓度的发酵原液和0.02ml线虫悬液(含线虫300条)，26℃培养一定时间用解剖镜观察统计线虫死亡率，发酵液活性以杀线率％表示，杀线率％＝{1-游动线虫数/线虫总数}*100％-空白对照死亡率。
有益效果本发明利用现代发酵工程技术，可快速、简便地获得成本低、生物活性强、广谱性的杀线虫生物制剂，即总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)的代谢产物。这种新型线虫生防制剂为水溶性，能以任意比溶于水，施用方便；而且，其热稳定性强利于制剂加工。该代谢产物中含一种新型结构物的8配位钾的乙二酸配合物，为今后对其进行设计改造、调控，开发一类新型杀线虫活性物质，打下良好的基础；这对线虫的生物防治以及微生物农药的研制开发具有重要的理论意义和广阔的开发前景。本发明产品不仅可以制成浓缩液，而且还可加工成粉剂，便于运输和保存。这种杀线虫生防菌代谢物，生物活性强；发酵原液，不用浓缩，即可直接使用，而且药效高，1ml发酵原液作用1500条松材线虫，线虫死亡率为100％。其发酵原液不经浓缩，甚至在稀释一倍后，杀虫率仍在75％-95％。该菌代谢物，除对松材线虫有极高的活性外，作为一种植物寄生线虫的生防制剂，在实验室、温室及大田小区试验的防治根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫等的应用实验都取得了很好效果。结果表明，该活性菌株的代谢物对上述重要的植物寄生线虫有很强的抑制作用；如大田小区防治甘薯茎线虫试验的防效达到71.5％；保护地大棚的防治蕃茄根结线虫实验，代谢物施用量6.7L/亩，防治效果达到57.3％；番茄增产60％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产39％)的结果；另外温室实验证实其50倍稀释液对大豆孢囊线虫仍有抑制作用，孢囊减少率为60.7％，相当于同期使用的化学农药的水平。以上实验证实，该代谢物具有一定的杀线虫的广谱性，可广泛用于松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫重要植物寄生线虫病害的生物防治。此外，还可用于黄瓜、芹菜等蔬菜寄生线虫的生物防治。它不仅克服了化学农药毒性的危害；而且克服了第一代线虫生防活菌剂，受环境因素影响大的种种弊病；同时还解决了多数第二代线虫生防因子属于脂溶性、给使用带来的困难。从而为生物防治植物寄生线虫病害、开发新型微生物杀线虫制剂，实现其产业化奠定基础。实验证明，该菌代谢物在生物防治植物寄生线虫病害、生产绿色无污染农作物蔬菜等方面将有广阔的开发潜力和应用前景。总之，以上特性，使其在今后开发应用上占有很大的优势，因此，该发明将对植物寄生线虫的生物防治以及微生物农药的研制开发、实现产业化，具有重要的理论意义和应用价值。


图1为8配位钾的乙二酸配合物的结构图
实施例1利用液体通气培养发酵制备抗线虫活性物质的方法，包括以下步骤以总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)为菌种，具体的制备工艺如下(1)菌种的培养菌株斜面保存使用PSM培养基(马铃薯蔗糖麦芽精培养基300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖，麦芽精2g/L)，所有的斜面菌种于26℃静置培养6天，放入4℃冰箱保存。
(2)活性代谢物的制备采用摇瓶培养即用无菌水洗下斜面孢子，制成孢子悬液，以106孢子接种于PSM液体培养基(500ml三角瓶装液量100ml)中，初始pH6.5，26℃，摇床转速170rpm培养4天。
(3)剂型加工将上述液体培养所得的培养物进行真空抽滤，获得原发酵滤液。
本实施例所获的代谢物中杀线虫活性组分的基本组成为带两个结晶水的乙二酸、8配位钾的乙二酸配合物、氨基化合物和其它有机酸；活性组分含量之和为100％。其中带两个结晶水的乙二酸、8配位钾的乙二酸配合物和其它有机酸含量之和不小于80％，且其之间的含量比为2.5∶1.8∶1.5；其它有机酸包括酒石酸、苹果酸、乳酸，其三者含量之和，占其它有机酸含量的95％。该代谢物的活性成分8配位钾的乙二酸配合物，为一种新型结构物，其分子式为K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，结构如图1所示；两个结晶水的乙二酸分子式为(H2C2O4)(H2O)2；热稳定性检测试验将获得的活性菌株发酵液，放在高压灭菌锅中，在121℃、灭菌20min，然后测定其生物活性，与未灭菌发酵液生物活性相比，活性为原活性的98％；证明该活性代谢物具有热稳定性。
发酵滤液生物活性检测用松材线虫作为供试线虫，在96孔细胞培养板中分别加入0.2ml1/2浓度的发酵原液和0.02ml线虫悬液(含线虫300条)，26℃培养一定时间用解剖镜观察统计线虫死亡率，发酵液活性以杀线率％表示，杀线率％＝{1-游动线虫数/线虫总数}*100％-空白对照死亡率。采用生物活性检测方法测得，发酵原液稀释一倍后的杀线率为85％。
实施例2
改变液体培养基配方，只接种于马铃薯蔗糖培养基(PS培养基300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖)中，其它同实施例1，发酵原液稀释一倍后的生物活性达85％。
实施例3液体培养基改变C/N比，200g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖，初始pH6.7，其它同实施例2，发酵原液稀释一倍后的生物活性为88％.
实施例4三角瓶通气培养发酵5d，其它同实施例3，发酵原液稀释一倍后的生物活性为83％。
实施例5活性菌株发酵和活性物质的制备同实施例3，需要说明的是，发酵6天，发酵原液稀释一倍后的生物活性为80％。
实施例6活性菌株三角瓶通气培养发酵和活性物质的制备同实施例3。需要说明的是，调节液体培养基初始pH3.5，发酵原液稀释一倍后的生物活性为85％。
实施例7活性菌株三角瓶通气培养发酵和活性物质的制备同实施例3需要说明的是，调节液体培养基初始pH4，发酵原液稀释一倍后的生物活性为85％。
实施例8活性菌株三角瓶通气培养发酵和活性物质的制备同实施例3需要说明的是，调节液体培养基初始pH8，发酵原液稀释一倍后的生物活性为75％。
实施例9改变活性菌株三角瓶液体培养的接种量，将孢子悬液以104孢子数接种于液体培养基(500ml三角瓶装液量100ml)中，其它培养条件同实施例3，发酵原液稀释一倍后的生物活性为85％。
实施例10改变活性菌株三角瓶液体培养的接种量，将孢子悬液以107孢子数接于液体培养基(500ml三角瓶装液量100ml)中，其它培养条件同实施例3，发酵原液稀释一倍后的生物活性为78％。
实施例11改变活性菌株三角瓶液体培养的溶氧条件制备活性代谢产物，变化摇床的转速为120rpm，三角瓶的装液量75ml/500ml，其它培养条件同实施例3。发酵原液稀释一倍后的生物活性为72％。
实施例12改变活性菌株三角瓶液体培养的溶氧条件制备活性代谢产物，变化摇床的转速为220rpm，三角瓶的装液量100ml/500ml，其它培养条件同实施例3。发酵原液稀释一倍后的生物活性为74％。
实施例13
改变活性菌株三角瓶液体培养的溶氧条件制备活性代谢产物，变化摇床的转速为170rpm，三角瓶的装液量125ml/500ml，其它培养条件同实施例3。发酵原液稀释一倍后的生物活性为77％。
实施例14用无菌水洗下斜面孢子，制成孢子悬液，以106孢子数接种于PS液体培养基(500ml三角瓶装液量100ml)中，26℃，静置培养6天，其他同实施例1。发酵原液稀释一倍后的生物活性为90％。
实施例15采用变温方式，将活性菌株接种于液体培养基中，从26℃至21℃逐步降温培养，其它培养条件同实施例3。
4天后对发酵滤液进行活性测定，与26℃恒温培养作为对照，活性提高一倍以上。将发酵滤液稀释4倍，其杀线虫结果达90％以上，说明变温培养有利于杀线虫代谢物的积累。
实施例16菌株的培养同实施例1，但需要说明的是，活性物质的制备采用发酵罐发酵发酵罐发酵采用PS培养基，300g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖。首先进行一级种子的制备，即用无菌水洗下斜面孢子，制成孢子悬液，以每100毫升液体培养基中加入106孢子，26℃，pH6.5，静置培养26小时；然后在发酵培养基中接种4％的一级种子，26℃，通气搅拌，通气量为1∶0.5-1∶0.75，转速300-350rpm；发酵36h，剂型加工是将真空抽滤后获得的发酵原滤液，经真空冷冻干燥制得粗制粉剂，用蒸馏水稀释为1/2发酵原液的浓度，生物活性达到95％以上。
实施例17活性菌株5L发酵罐发酵生产和活性物质的制备同实施例16，需要说明的是，发酵罐发酵PS培养基，300g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖发酵68h，发酵原液稀释一倍后的生物活性为95％以上。该代谢产物主要活性成分含带两个结晶水的乙二酸和8配位钾的乙二酸配合物，此外还含其它有机酸；上述各物质之间的含量比为3.5∶2.5∶2.0。
实施例18活性菌株5L发酵罐发酵生产和活性物质的制备及剂型加工同实施例16需要说明的是，发酵罐发酵PS培养基改变C/N比，200g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖，发酵60h后获得发酵液，发酵原液稀释一倍后的生物活性为95％以上。
实施例19在实验室以松材线虫为供试线虫进行杀虫实验，1ml原发酵液作用1500条线虫，线虫死亡率达100％。其他同实施例1。
应用实验1将20倍的浓缩液用无菌水稀释一倍，按照实施例1的生物活性检测方法加入供试线虫，26℃培养，定时用解剖镜观察统计线虫死亡率，结果为浓缩液作用线虫3小时，线虫死亡率达100％；
应用实验2取20倍浓缩液按照实施例1的生物活性检测方法加入供试线虫，26℃培养，定时用解剖镜观察统计线虫死亡率，结果为浓缩液作用线虫1小时，线虫死亡率达100％；证明经浓缩后，菌发酵液的杀虫活性显著提高。
应用实验3取20倍浓缩液用水稀释32倍后作用线虫5天，线虫死亡率达80.9％，证明加热浓缩对代谢物杀虫活性影响不大。
应用实验41998年5-10月，在河北省卢龙县进行大田小区防治甘薯茎线虫试验，取得一定成效，将总状共头霉的代谢产物制得的粗制粉剂，用水稀释成水溶液(剂量以75g干粉/亩)进行浇埯，防效为71.5％。
应用实验51999年7-12月在北京郊区保护地大棚进行的防治蕃茄根结线虫实验，代谢物的发酵原液施用量6.7L/亩，栽苗前一周用水稀释进行土壤处理，防治效果达到57.3％，番茄增产60％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产39％)的结果。
应用实验61998年5月在中国农科院植保所温室进行的实验，将发酵原液稀释50倍后，进行大豆孢囊线虫的防治试验，试验结果孢囊减少率为60.7％，相当于同期施用的化学农药的水平。
以上应用实验结果表明，该活性菌株的代谢物对松树、甘薯、番茄、大豆等重要植物的寄生线虫表现了其杀线虫的广谱性。


杀线虫生防菌代谢物及其制备方法，涉及总状共头霉代谢物及制备。它解决了线虫生防制剂缺乏、活菌剂及脂溶性制剂使用上的问题。本发明为总状共头霉的代谢产物，是一种新型线虫生防制剂。其主要活性成分含带两个结晶水的乙二酸和8配位钾的乙二酸配合物，此外还含酒石酸、苹果酸、乳酸。其制备方法是利用现代发酵工程技术，以总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)为菌种，主要利用液体通气培养制备出活性代谢产物。该生防菌代谢物具有水溶性、利于制剂加工、热稳定性强、成本低、杀虫谱广、易实现产业化生产、施用方便等特性。本发明对线虫的生物防治及微生物农药的研制开发，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。