一种生物杀线虫剂的生产方法

莫明和, 张克勤, 周薇

2003年12月24日

2003年5月21日

2003年5月21日

云南大学

A01N63/00GK1462583SQ03117930

线虫 生物 生产

1.一种生物杀线虫菌剂的生产方法，其生产工序包括微生物菌种培养，微生物液体条件下或固体条件下的大量繁殖和菌剂加工，其特征在于1.1所用的微生物为指状节丛孢Arthrobotrys.dactyloides LX-Ad菌株，该菌株2002年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.0805；1.2微生物液体下大量繁殖所用的培养基成分为糖蜜20g，玉米粉5g，硫酸铵5g，氯化钠6g，硫酸二氢钾0.5g，柠檬酸三钠4.5g，水1000ml；1.3微生物固体下大量繁殖的培养基成分可以是单一的麦麸，小麦粒或粉，高粱粉，玉米粉或者粒，红薯粉，米糠，大米，棉籽壳，禾本科植物的茎叶粉碎物，淀粉，黄豆粉，也可以起其中两种或两种以上成分的组合；1.4微生物在该菌剂中的重量百分比为15％-75％，菌剂的相对湿度小于10％

本发明涉及一种生物杀线虫的生产方法，属生物农药领域在线虫的天敌微生物中，食线虫真菌(nematophagous fungi)是最有研究和开发价值的重要资源之一食线虫真菌按其侵染线虫的机制可以分为四大类捕食菌，内寄生菌，机会菌和产毒菌捕食菌(nematode trappingfungi)是指通过菌丝特化形成捕食器(predacious device)，利用捕食器捕杀线虫捕食菌形成的捕食器目前共发现的有七大类三维菌网，收缩环，非收缩环，粘球，粘性分枝，粘性菌丝和冠囊体捕食菌形成的收缩环(constricting ring)是由三个细胞构成，通过一段短的菌丝(2-3个细胞构成)与营养菌丝相连接，收缩环分泌一些物质诱吸线虫穿入环内，一旦线虫接触收缩环，环细胞在千分之一秒的时间内很快收缩，将线虫紧紧地套住之后，环细胞分泌一些侵染酶，如蛋白酶等，降解线虫的体壁，随后菌丝侵入线虫体内，利用线虫作为营养不断生长繁殖，最后导致线虫死亡目前利用捕食菌开发的线虫生防制剂已经有2个商业化产品，一个是利用粗壮节丛孢(Arthrobotrys robusta)开发的Royal 300在法国用于防治双孢蘑菇线虫，使蘑菇产量比对照提高25％(Cayrol et al.，1978)另一个是利用不规则节丛孢(A.irregalaris)开发的Royal 350在法国用于防治番茄根结线虫所利用的这两种捕食菌都是以三维菌网捕食线虫，捕食器为三维菌网的捕食菌在土壤中营腐生生活的能力比形成其它类型捕食器的捕食菌要强，强，一般要有线虫诱导才能产生捕食器，因此，在营养丰富的土壤中很难产生捕食器捕捉线虫，导致防治效果不稳定本发明利用捕食线虫真菌指状节丛孢LX-Ad菌株或由该菌株产生的各种突变株，通过固体和液体培养方法，获得菌体培养物(包括菌丝，分生孢子和代谢物质)，添加农业上允许使用的填充料，粘合剂，表面活性剂等有利于有效成分施用和分散的物质制成种粉剂，颗粒剂，可湿性粉剂等可用于防治根结线虫Meloidogyne spp的菌剂本发明通过以下步骤实现(1)微生物菌种的培养(包括微生物试管斜面种子培养、微生物液体种子培养)；(2)将液体种子接入固体培养料中或液体培养料中，通过固体培养条件或液体培养条件培养，获得大量的菌体培养物；(3)根据剂型需要将菌体培养物与相应的填充料，粘合剂，表面活性剂等有利于有效成分施用和分散的物质制成粉剂，颗粒剂和可湿性粉剂等植物寄生线虫生防菌剂本发明使用的微生物是指状节丛孢A.dactyloides LX-Ad菌株或由该菌株通过突变、遗传改造获得的衍生物该菌株已于2002年10月9日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.0805其特征是在CMA培养基(玉米粉20克，琼脂18克，水1000毫升)上培养7-14天，菌落白色，菌丝无色，分枝，分隔，分生孢子梗直立，不分枝，长200-600μm，顶端形成小齿梗，小齿梗上着生棒状分生孢子，分生孢子一个分隔，大小为35-60×7-9μm，小型分生孢子长棍棒形至梨形，有时稍弯，0-2个分隔，大小为16-26×3-5μm该种微生物以收缩环捕食线虫微生物斜面种子培养方法 (为叙述方便，将成分为糖蜜20g，玉米粉5g，硫酸铵5g，氯化钠6g，硫酸二氢钾0.5g，柠檬酸三钠4.5g，水1000ml的培养基命名为MC培养基)将微生物的菌丝或孢子接种到MC培养基斜面上，15-35℃下培养4-20天后获得斜面种子液体种子的培养方法将斜面种子接种到三角瓶中的MC液体培养基中，15-35℃，摇床培养(转速为50-200rpm，培养3-7天)，也可以静止培养(4-14天)微生物固体条件下的大量繁殖方法固体培养料的成分可以是单一的麦麸，小麦粒或粉，高粱粉，玉米粉或者粒，红薯粉，米糠，大米，棉籽壳，禾本科植物的茎叶粉碎物，淀粉，黄豆粉，也可以是其中的两种或两种以上成分的组合将固体培养料用水润湿，调节水分含量至混合物重量百分比的20-45％，用塑料袋(瓶)，玻璃瓶或浅盘等容器装料，灭菌后用斜面种子或液体种子接种，15-35℃下培养10-60天微生物液体条件下的大量繁殖方法将斜面菌种接种到MC平板上，20-29℃下培养4-10天获得平板种子，取平板种子菌丝块15-40块(直径＝3mm)，接种到装有1升MC培养基的2升三角瓶中，在20-29℃，转速为100-250rpm的摇床上培养4-8天后的培养物作为在20立升，50立升，1000-4000立升发酵罐生产这种微生物时的接种体在20立升，50立升中发酵罐的培养温度控制在28-32℃，培养时间40-96小时在1000-4000立升发酵罐中的培养温度控制在25-37℃，作为一级种时培养时间为48-120小时将一级种接入10000-30000立升发酵罐，培养温度控制在28-35℃，培养时间为96-150小时，在发酵罐中培养的转速为300-500rmp菌剂各种剂型的制备如下粉剂的制备微生物大量菌体制备好以后作为原药与粉碎(粒径小于1毫米以下)的单一或组合的各种植物、矿物或合成材料的填料(如草粉，米糠，木屑，滑石，叶蜡石，高岭土，膨润土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭等)和助剂(如烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸盐，木质素磺酸盐以及它们的复配物)混合，混合物中微生物的重量百分比为15-75％混合之后将水分相对湿度调节到10％以下，包装，室温或4-10℃下保存颗粒剂的制备按粉剂的方法将菌体与填料和助剂混合，用造粒机制成直径为1-4mm，长度为0.5-8cm的颗粒，在30-35℃下烘干到水分含量小于10％，制成颗粒剂颗粒剂中微生物的重量百分比为15-75％可湿性粉剂的制备微生物大量发酵生产以后，将发酵物与填料(同粉剂)，润湿剂(茶枯，皂角，土温60，拉开粉，洗衣粉，十二烷基苯磺酸钠等)，分散剂(No，NNO，PolyFON，SOPA，HO，拉散剂MF等)，稳定剂(如抗坏血酸)均匀混合，将水分调节到2％以下在制备时先将微生物发酵物以外的成分混合并粉碎小于44微米后再与菌体混合可湿性粉剂中微生物的重量百分比为15-75％以上菌剂的使用方法可以是拌种，拌土穴施、沟施，也可以是喷雾以上菌剂的使用时期可以是种子期，苗期和成株期本发明产品对根结线虫的防治试验试验一液体培养法制备的粉剂防治根结线虫的室内和温室实验1.试验菌剂粉剂(其中，填料为85％草炭，15％硅藻土，助剂为烷基萘磺酸盐和木质素磺酸盐，菌剂中微生物的重量百分比为15％)2.试验方法将粉剂与沙土(40％的粗沙，10％的细沙，5煤渣，45％的泥土)混合设以下处理，a.以20g菌剂/升沙土的比例混合，b.以10g菌剂/升沙土的比例混合，c.以5g菌剂/升沙土的比例混合，d.用经高温灭菌的菌剂，以10g菌剂/升沙土的比例混合，e.不加菌剂的沙土室内实验是取200ml的每种土样放到250ml有螺旋盖的的容器内，轻轻压实，接种花生根结线虫(Meloidogyne incognita)的卵约10000粒，将湿度调到8％，盖上盖子后将整个容器置于一密闭的温度为25℃，湿度为100％的大容器中，放置4周后，用漏斗分离法(Whitehead and Hemming，1965)分离、记数土壤中的线虫温室实验是以10g菌剂/升沙土的比例混合，在直径为15cm的塑料钵中填加1000ml菌剂-沙土混合物，设5个重复，接种花生根结线虫(Meloidogyneincognita)的卵约10000粒/钵，2周后，移栽刚发芽的番茄种子，每钵2粒4周后记数根系上的瘤结数以不加菌剂的沙土做对照3.结果室内试验结果显示(表1)，在每升沙土加10g菌剂的处理中，菌剂对花生根结线虫M.incognita卵的致死率高达92.36％表1菌剂对花生根结线虫M.incognita卵的致死率(％)处理 幼虫数量 致死率A73 94.07B94 92.36C52157.64D1175 4.47E1230 /温室试验的结果为对照的瘤结数为302个/株，菌剂处理的瘤结数为64个/株，瘤结减少率为78.80％试验二固体培养法制备的颗粒剂防治根结线虫的温室实验1.试验菌剂颗粒剂(其中，填料为75％草炭，10％硅藻土，15％高岭土，助剂为烷基萘磺酸盐和木质素磺酸盐，菌剂中微生物的重量百分比为75％)2.试验方法按试验一的方法进行3.结果对照的瘤结数为351个/株，菌剂处理的瘤结数为43个/株，瘤结减少率为84.9％试验三颗粒剂防治根结线虫的温室实验1.试验菌剂本发明液体培养法制备的颗粒剂，其中，填料为75％草炭，10％硅藻土，15％高岭土，助剂为烷基萘磺酸盐和木质素磺酸盐，菌剂中微生物的重量百分比为45％对照药剂5％涕灭威颗粒剂(山东宁阳化工厂)2、试验处理(1)生物杀线虫颗粒剂1千克/亩(2)生物杀线虫颗粒剂1.5千克/亩(3)生物杀线虫颗粒剂2千克/亩(4)生物杀线虫颗粒剂2.5千克/亩(5)5％涕灭威颗粒剂1千克/亩 (6)5％涕灭威颗粒剂2.5千克/亩(7)空白对照3、实验方法供试作物为烟草(Nicotiana tabacum)的云烟87品种，感染花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)；地点为云南嵩明县接届村，黄壤土试验小区面积为20平方米，每处理四次重复，小区排列采取随机排列法在烟苗移栽时，将药剂与部分土壤混合，施于根际，实验期间按常规管理实验时间2001年5月1日至2001年8月30日4、调查方法2001年8月30日烟叶全部采收后调查根结病情指数，病株率，土壤中的幼虫数，平均每克根系的卵粒数，雌虫数病情指数按烟草病害药效试验方法Y/cT40-1996计算防治效果＝对照线虫数[幼虫+卵+雌虫]-处理线虫数]/对照线虫数*100％5、实验结果表1实验结果 6.结果分析从表1可以看出，使用本发明制备的菌剂对田间防治烟草根结线虫都有不同程度的防治效果，与对照相比较能显著降低田间的线虫数量，根结线虫造成的危害明显比对照减轻防治效果随施用量的增加而增加，当施用量在2.0-2.5千克/亩的防治效果没有显著性差异，防效在78.2-81.1％之间，其防治效果与每亩施用2.5千克5％涕灭威颗粒剂(防效84.7％)相当从表中结果可以看出用本发明制备的菌剂在田间的施用量适宜在每亩2千克左右本发明具有原料成本低，生产工艺先进，菌体产量高，所制成的菌剂对植物寄生线虫有很好的防效等优点实施例2液体培养大规模化生产制备粉剂的方法按液体种子∶MC培养基＝1∶20(V/V)的比例将种子接入装有3200立升MC培养基的4000立升发酵罐中，32℃，450rpm，培养96小时后接入装有28000立升MC培养基30000立升发酵罐，32℃，450rpm条件下培养4天按实例1中的方法生产和制备粉剂，其中，按菌体(体积)∶草炭(重量)∶硅藻土(重量)＝45毫升∶45克∶10克的比例混合，这样制备的菌剂中微生物含量约45％实施例3固体培养小规模化生产制备颗粒剂的方法将培养料(25％麦麸，45％红薯粉，25％草粉，5％黄豆粉)混合均匀，用适量的水调节培养料的水分含量到35％，然后将培养料装入塑料袋，每袋1公斤，121℃下灭菌4小时，冷却后在塑料袋培养料的两端分别接种5毫升液体种子，25℃下培养30天后，将菌丝长满培养料按体积比为1∶1与25％的硅藻酸钠溶液混合，然后用造粒机制成直径为4mm，长度为4.5cm的颗粒，在32℃下烘干到水分含量小于10％，制成颗粒剂这样制备的颗粒剂中微生物的重量百分比约75％，实施例4可湿性粉剂的小量制备按实施例1方法生产微生物，用板框过滤去2/3的液体，将菌体与填料按15克∶85克的比例混合，其中填料为95％草炭，2％吐温-60，1％十二烷基苯磺酸钠，1％拉散剂MF，1％抗坏血酸，混合后将水分调节到2％以下这样制备的可湿性粉剂中微生物的重量百分比约15％