专利名称：基于通用pcr扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法基因多态性的检测在分子生物学、病原检测、临床检验、新药开发和人类的起源与进化方面的研究中具有非常重要的作用。人类的许多遗传疾病如α和β地中海贫血症等都是由于单基因突变产生的。这些遗传疾病是我国最主要的出生缺陷之一，严重影响我国的人口质量，给社会与家庭带来沉重的经济负担，因此，需要建立一种快速、灵敏、特异性的高通量检测技术。传统基因突变检测主要借助于电泳、质谱或基因芯片方法，这些方法需昂贵精密仪器，操作程序复杂，技术外延性差，分析周期长，故不适于进行大规模人群筛查与产前的生物学研究。目前国际上的主要趋势都集中于以DNA修饰酶为基础，利用酶催化反应提高基因突变鉴定方法的忠实性、可靠性与灵敏度，发展操作简便、快速可靠、低成本、高通量的基因突变分析手段。例如，基于DNA聚合酶的等位特异性延伸或外切建立的TaqMan 探针分析、单核苷酸延伸分析等，基于DNA连接酶的等位特异性连接建立的寡核苷酸连接分析、连接酶链分析等，基于DNA内切酶结构识别的Invader分析等。但是,这些检测方法大多基于核酸分子杂交、凝胶电泳分析，核酸链的多重标记，要么灵敏度不高、重现性不好、 可靠性差，要么分析通量较低、成本较高，且需要精密的仪器，不能满足经济、准确、快速检测的需求。本发明建立的基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，样品用量少、操作简便、成本较低，且可进行多组分同时测定。
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于通用PCR 扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，这种方法样品用量少、操作简便、成本较低，且可进行多组分同时测定。本发明的技术方案是，基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，包括以下步骤(I)等位特异性连接酶链反应；(2)通用PCR扩增反应；(3)限制性内切酶消化反应；(4)基于液相色谱的核酸片段多组分定量检测。以下对本发明做出进一步说明。所述基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法采用以下步骤实现等位特异性连接酶链反应产生与目标基因型匹配的连接产物，经通用PCR扩增反应产生连接产物的荧光标记扩增产物，通过限制性内切酶消化反应将扩增产物转化为目标基因型特异性的长度编码荧光标记核酸片段，利用液相色谱实施核酸片段多组分定量检测。本发明中，所述基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测分以下几个步骤实现等位特异性连接酶链反应20 μ L IXTaq ligase buffer反应缓冲溶液(20mM Tris-HCl,25mM KAC,IOmM Mg(AC)2，and IOmM DTT，ImM NAD+,and 0. 1% Triton X_100，pH 7.9)中包含IOpM等位特异性区分探针对，IU/μ L热稳定Taq DNA连接酶和一定浓度的相应目标链，于热循环仪中进行连接酶链反应。95°C变性3min，10个循环95°C变性lmin，60°C 退火杂交连接5min。通用PCR反应连接酶链反应之后取10 μ L上述反应液，添加I μ L dNTPs混合溶液(IOmM)，O. 5 μ L Vent exo-DNA聚合酶，12. 5 μ L通用引物混合溶液(浓度分别为4 μ Μ)， 5μ L IOXThermopol buffer (IOOmM KCl,200mM Tris-HCl, IOOmM (NH4) 2S04, and I % Trion-X-100, pH 8. 8)，同时调整溶液反应体积到50 μ L，于PCR仪中进行PCR扩增反应。 95°C变性3min，30个循环95°C变性IOs ;70°C退火30s ;72°C延伸反应15s，最后72°C延伸 7min，4°C避光保存备用。限制性内切酶反应通用PCR反应之后取26 μ L上述反应液，添加IyL RsaI限制性内切酶，3 μ L 10ΧΝΕΒ buffer 4(200mM Tris-Ac, IOOmM Mg (AC) 2，500mM KAC，and IOmM DT T，pH 7. 9)，混匀，于37°C反应2h，然后65°C加热20min进行RsaI限制性内切酶的灭活处理，然后4°C避光保存备用。注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。本发明中，所述基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法的定量检测可采用常规的高效液相色谱法(HPLC)进行，以下是用HPLC法对基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱检测单核苷酸多态性的定量检测步骤取10 μ L限制性内切酶反应混合溶液注入LC-20AT高效液相色谱仪(Shimadzu， Japan)中进行分析。色谱条件为分离色谱柱为Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, 150X4. 6mm), 保护柱为 Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, I X 4. 6mm)，柱温为 40。。，流速为 lmLl/min。流动相 A 为O. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流动相B为O. IM含25%乙腈的ΤΕΑΑ,ρΗ 7. O。 线性洗脱梯度为25min内流动相B从50%增加到58%, IOmin内流动相B从58%增加到 60%。检测器为RF-IOAxl突光检测器(Shimadzu, Japan),最大激发光波长设定为490nm, 最大发射光波长设定为520nm。本发明提出了一种基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，该方法依靠连接酶链反应进行等位基因的基因分型，利用通用PCR进行连接产物的扩增，从而产生大量的荧光标记的扩增产物，然后通过限制性内切酶将该扩增产物转化成目标基因型特异的编码长度荧光标记核酸片段，最后利用HPLC进行分离检测，从而可实现对目标基因的便捷，稳健，多组分同时检测。实施例I :基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法用于β地中海贫血IVS-II-654(C > T)和⑶17(A > T)基因突变位点的突变检测I)等位特异性连接酶链反应20 μ L I XTaq ligase buffer反应缓冲溶液 (20mM Tris-HCl,25mM KAC,IOmM Mg(AC)2, and IOmM DTT，ImM NAD+, and 0. 1% Triton X-100, pH7. 9)中包含 IOpM 等位特异性区分探针对(Probe LI :5，-P032—CCTTAACCC AGAAATTCATTGTTCGTAGCGCCCTGCCAC-3’ ；Probe Rl-M :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAG TACAGAGATATTGCT ATTA-3’ ；Probe IU-W :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGT GTACAGAGATATTGCTATTG-3，；Probe L2 :5’-P032-GCCCCACAGGGATTGTTCGTAGCGCCCTGCCAC-3，； Probe R2-M :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACCACGTTCACCTA-3’； Probe R2-ff :5’-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACCACGTT CACCTT-3’)，lU/μ L热稳定Taq DNA连接酶和一定浓度的相应目标链，于热循环仪中进行连接酶链反应。95°C变性3min，10个循环95°C变性Imin，60°C退火杂交连接5min。2)通用PCR反应连接酶链反应之后取10 μ L上述反应液，添加I μ L dNTPs混合溶液(IOmM) ,0. 5μ L Vent exo-DNA聚合酶，12. 5 μ L通用引物(引物I : 5’ -GTGGCAGGGCGCTACGAACAAT-3’ ；引物 2 :5’ -FAM-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3’ )混合溶液(浓度分别为 4μΜ)，5μ IOXThermopol buffer(IOOmM KCl,200mM Tris-HCl, IOOmM (NH4)2S04, and 1% Trion-X-100, pH 8. 8)，同时调整溶液反应体积到 50 μ L，于 PCR 仪中进行PCR扩增反应。95°C变性3min，30个循环95°C变性10s ;70°C退火30s ;72°C延伸反应15s，最后72°C延伸7min，4°C避光保存备用。3)限制性内切酶反应通用PCR反应之后取26 μ L上述反应液，添加IyL RsaI 限制性内切酶，3yL 10XNEB buffer 4(200mM Tris-Ac, IOOmM Mg (AC) 2, 5 OOmMKAC, and IOmMDTT, pH 7. 9)，混匀，于37°C反应2h，然后65°C加热20min进行RsaI限制性内切酶的灭活处理，然后4°C避光保存备用。4)高效液相色谱测定取10 μ L限制性内切酶反应混合溶液注入LC-20AT高效液相色谱仪(Shimadzu, Japan)中进行分析。色谱条件为分离色谱柱为Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m，150 X 4. 6mm)，保护柱为 Shim-pack VP-ODS (4· 6 μ m，I X 4. 6mm)，柱温为 40°C，流速为lmLl/min。流动相A为0. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流动相B为 O. IM含25%乙腈的ΤΕΑΑ,ρΗ 7.0。线性洗脱梯度为25min内流动相B从50%增加到58%， IOmin内流动相B从58%增加到60%。检测器为RF-IOAxl荧光检测器(Shimadzu，Japan)， 最大激发光波长设定为490nm,最大发射光波长设定为520nm。按照上述步骤1)、2)、3)、4)对4个四种不同基因型的目标链(人工合成)的标准溶液(浓度分别为0fM、0. lfM、lfM、10fM、100fM、lpM、5pM、10pM。)进行检测，记录各标准溶液的相对保留时间和所对应的色谱峰的荧光强度，未知样品的相对保留时间和荧光强度与和标准的液的相对保留时间和荧光强度对照，从而实现对未知样品的基因分型。
本发明公开了一种基于通用PCR扩增进行生物编码的多组分色谱单核苷酸多态性检测方法，它包括等位特异性连接酶链反应，通用PCR扩增反应，限制性内切酶消化反应以及利用液相色谱对目标基因型特异性的生物编码长度荧光标记核酸片段的多组分定量检测。本发明利用等位特异性连接酶链反应产生与目标基因型匹配的连接产物，经通用PCR扩增反应产生连接产物的荧光标记扩增产物，通过限制性内切酶消化反应将扩增产物转化为目标基因型特异性的长度编码荧光标记核酸片段，利用液相色谱实施核酸片段多组分定量检测。该方法样品用量少、操作简便、成本较低，且可进行多组分同时测定，可望为人群筛查、产前的生物学研究提供一个通用的技术平台。