专利名称：白血病病变前期mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法白血病是造血系统的恶性疾病，俗称“血癌”，是海内十大高发恶性肿瘤之一，其特点为造血组织中某一类型的白血病细胞在骨髓或其他造血组织中的发生恶性增生，并浸润体内各脏器、组织，导致正常造血细胞受抑制，产生各种症状，临床表现以发热、出血、贫血、 肝、脾、淋逢迎肿大为特点。白血病一般按天然病程和细胞幼稚程度分为急性和慢性，按细胞类型分为粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等类型，临床表现各有异同之处。可经中药及化疗， 大部分可达缓解，也可骨髓移植治疗，一部分可持久存活甚或治愈。我国白血病患者约为 3 4人/10万人口，小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高。据调查，我国<10岁小儿白血病的发病率为2. 28/10万，不论什么年龄均可发病，男的的发病率高于女性。一年四季均可发病，农村多于城市。近十余年来美国、日本、英国等国家白血病发生率和死亡人数的比率也有上升趋势，全世界约有M万急性白血病患者。急性白血病属于中医学的“虚痨”、 “血证”、“瘟病”等范畴。人类白血病的确切病因至今未明。很多因素被认为和白血病发生有关。病毒可能是首要因素，此外尚有电离辐射、化学毒物或药物、遗传因素等。1、病毒人类白血病的病毒病因研究已有数十年月历史，但至今只有成人t细胞白血病肯定是由病毒引起的。其他类白血病还没有法证明其病毒因素，并不具备传染性；2、电离辐射电离辐射有致白血病效用，其效用与放射剂量大小和照射部位有关，一次大剂量或多次小剂量照射均有致白血病效用；3、化学物质苯致白血病效用比较肯定。苯致急性白血病以急粒和红白血病为主；4、遗传因素某些白血病发与遗传因素有关；5.最主要的致病因素是长期、 累积使用农药对人类生活环境的污染。急性白血病在临床上分急性髓细胞白血病(acute myeloblastic leukia, ami)及急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukia, all)。 白血病在临床上称之血癌，与癌症同类。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对 1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性(多态性);2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学)等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术)指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以 2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。白血病的临床诊治也是如此，一旦发现都是晚期了，不做骨髓干细胞移植，大部分很难治愈，而且，骨髓干细胞移植的配型人数远远少于白血病发病人数。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)前，就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本(白血病患者、高危人群、正常对照)，对DJ-I基因与白血病的早期预警进行检测分析。研究人员，通过检测病人的骨髓样本，发现骨髓异常增殖综合征中的两个转录因子(TWIST和DJ—1)表达异常。而利用核苷酸干扰技术降低异常表达的TWIST和DJ—1， 可以显著的增高抑癌基因P 53的表达，从而大大促使异常增殖的癌细胞发生凋亡。骨髓异常增殖综合征简称为“MDS”，以往被称为“白血病前期”，是一组起源于多功能造血干细胞克隆性骨髓增殖性疾病。以往认为这种病易发在50多岁的中老年人，但近年来，该病有增多的趋势，且在青少年中发现的病例也不少。经临床观察发现，该病并不一定都会发展成白血病，如果前期诊断及时，采取有效的治疗手段，病人的治愈率较高。利用基因芯片和蛋白质质谱技术，通过分析近百名病人的骨髓样本后发现了 DJ-I有预防性诊断和早期介入治疗“白血病前期”有着重要的临床意义将DJ-I的mRNA作为早期筛查白血病病变前期有非常重要的临床诊断意义。DJ-I的 mRNA在白血病前期及病变过程中表达过度。它作于白血病病变前期筛查、及白血病治疗后的复发预警也有非常重要的临床意义。发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了大胆创新。特别是筛选临床标本(正常人群、高危人群、白血病患者)，突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发白血病前变的mRNA水平，与白血病早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要的靶标，能将临床上癌症形成后诊治模式变成癌症(白血病)的预防性诊治，争取了白血病诊治的时间和空间，达到预防白血病。目前对DJ-I基因的研究都采用高通量基因芯片技术和蛋白谱技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条件尚不成熟。根据4现有的文献资料DJ-I基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。本发明人在针对创新性发明的要求，设计了不同数据例组(白血病患者、高危人群、正常对照人)例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上白血病病人DJ-I基因都过度表达，高危人群有不同程度表达15-25%，正常人都是零表达。表明DJ-I基因是白血病病变前期筛查的重要标志物。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、 cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有咕、353、1251和3牛。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针(mRNA)和检测的靶mRNA是采用碱基互补(杂交互补)的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响(因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上)。鉴于目前临床上癌症的诊断(影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的诊断)是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技术，做了创新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床癌症的诊治争取时间和空间。
本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与白血病发生、复发相关的DJ-I基因的原位杂交检测方法。为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针是DJ-I基因碱基序列，即SEQ ID NO. 1所示序列，DJ-I基因的核苷酸序列长度是 822bp。(在探针标记过程中如果基因序列太长，超过IOOObp以上，我们会用⑶S的序列来设计探针，如果CDS的序列也超过IOOObp以上，会采用基因的中间一段碱基序列来合成探针，碱基序列不少于500bp，探针合成后要做序列检测，并对功能进行临床意义的分析)。本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。本发明的癌变前期DJ-I基因筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA水平，及早对白血病病变前期筛查及白血病经治疗后复发的早期预警。DJ-I基因是一种类似致癌基因，它的高表达表明有白血病前变的可能及治疗后有可能复发，提示临床医生及早介入诊治。本发明还提供一种DJ-I基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤(1)在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和
(2)检测所述杂交复合体。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16 - 24小时。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自白血病患者、高危人群、正常对照。本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的白血病高危人群，经治疗后病人复发及白血病患者。本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以DJ-I基因为检测对象，合成探针是DJ-I基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供DJ-I基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人DJ-I基因表达低或不表达，即不显色，DJ-I基因在白血病病人和正常人有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都高，高危人群有低表达。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括
1).将待测标本放入反应槽中；
2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；
3).仪器自动弃去液体，自动后固定；
4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C);
5).仪器自动弃去液体，自动清洗；
6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C);
7).仪器自动弃去液体，自动清洗；
8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；
10).取出封片镜检。本发明的一个优选实施例的方案是以DJ-I基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点， 还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的DJ-I 基因表达量，用来确定白血病是否发生及治疗后有没有复发，因为DJ-I基因在正常人中低表达或不表达，如果DJ-I基因表达高度，说明白血病病变风险非常高，已及治疗后病人可能已复发，从而获得白血病病变前期的筛查和诊断信息，帮助临床医生及早介入。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述，当检测到DJ-I基因的表达高于正常对照时，则可预测受试者为白血病病变已发生。本发明具有如下有益效果
本发明的临床意义是更早期跟踪检测白血病病变发生和病理演变过程中白血病病变的发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测标志物(癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子)和影像医学检查有显着不同。本发明可以在基因水平上检测DJ-I基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，白血病发病前期，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床白血病病变前期高风险人群，一个真正的早期筛查以及治疗后复发的及早预测。这样才有可能实施乳癌的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治白血病恶疾。此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。


图1是本发明DJ-I基因原位杂交技术流程图。图2是本发明实施例中白血病病人DJ-I过量表达图片。图3是本发明实施例中正常人DJ-I表达图片。图4是高危人群DJ-I表达图片。

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以DJ-I基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中 本实施例的探针标记物选用地高辛。试剂盒杂交液组成


本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与白血病病变前期病理演变有密切相关的转录因子(DJ-1)基因的mRNA方法，包括以下步骤(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测DJ-1基因的表达量，现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的白血病病变前期mRNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低，便于县区级医院推广应用。