专利名称：一种肿瘤特异性γδT淋巴细胞的体外扩增方法T细胞表面具有能特异地识别抗原的结构，称为T细胞抗原受体(TCR)。根据TCR 的不同类型，T细胞可分为α β T细胞和γ δ τ细胞。α βΤ细胞主要参与获得性免疫过程，通过MHC限制性识别肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞能通过MHC突变、削弱抗原递呈、诱导产生抑制性免疫细胞等免疫逃避机制，阻断抗原识别过程。γ δΤ细胞被认为是介于获得性与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型 (Chemlmmunol Allergy. 2005，86 151-183.)，占 CD3+T 细胞的 1 % 5%，大部分 γ δ T 细胞不表达CD4、CD8分子，有特异性识别抗原功能而无MHC限制，并在机体抗感染和自身免疫疾病及抗肿瘤等过程中起重要作用(Nat Rev Immune. 2002，2 :336-345)。活化的γ δ T细胞具有多种细胞功能，它既可以直接杀死特殊细胞，表现出Tc活性；又可分泌细胞因子，协调免疫反应，表现出Th活性。由于Y S T细胞灵活的细胞功能和独特的抗原识别谱，它在机体的免疫应答和免疫监视中起着不可或缺的作用。由于γ δ T细胞在人体内比例低、数量有限，鉴于其强大的肿瘤杀伤活性，寻找一种简便、特异地激发和扩增Y S T细胞的方法，无疑将有助于对这群细胞的生物学特性和功能的研究，以及在肿瘤过继免疫疗法中的可能性运用。并且，应用体外诱导扩增的抗原特异性免疫细胞治疗恶性肿瘤已成为一种有效的临床免疫治疗方法(TRENDS in Immunology. 2001,22(9) :516-523.)。体外扩增的Y δ T细胞也已应用于临床试治 (Blood. 2003, 102 :200-206；Immunol Res.2009,45(1) :85-95 ；ExpMol Pathol. 2004, 76(2) :117-121 ；Cancer Res. 2010，70 10024-10027)。目前有许多体外培养Y δΤ细胞方法的报道，包括用抗⑶3抗体、IL-2和 IL-4 (Leukemia. 2011，doi :10. 1038)、抗 TCR γ δ 和 IL_2(中国免疫学杂志· 2011， 739-743)、非肽磷酸抗原和IL-2 (Blood. 2003，102 :200-206)等。虽然细胞培养和扩增方法不断的改进和完善，但国内外对Y S T细胞过继免疫治疗的研究大多以健康人γ δ T细胞为研究对象，所以扩增出来的Y S T细胞特异性不高，降低了其肿瘤杀伤效应，导致以 Y S T细胞为基础的免疫治疗受到了一定的限制。因此，寻找新的高效的自体Y δΤ细胞扩增方法以提高其用于过继免疫治疗的效率，显得尤为重要。
本申请的发明人利用白血病患者自体的单核细胞组分⑶4-⑶8-PBMCs为“种子细胞”，通过与灭活的自体白血病细胞、重组人白介素2(rhIL-2)和植物凝集素(PHA)共同培养，刺激诱导具有真正肿瘤杀伤作用的Y S T淋巴细胞得以选择性扩增，从而获得具有个体化效应特征的肿瘤特异性Y ST淋巴细胞。本发明的目的是提供一种肿瘤特异性Y δ T淋巴细胞的体外扩增方法。本发明的肿瘤特异性Y δ T淋巴细胞的体外扩增方法包括以下步骤(1)由初发白血病患者外周血中分离得到白血病细胞并灭活；(2)由缓解的白血病患者的外周血中分离得到单核细胞组分⑶4-⑶8-PBMCs ；(3)在重组人白介素2(rhIL_2)和植物凝集素(PHA)存在下，将步骤⑴中得到的灭活的白血病细胞与步骤O)中得到的CD4-CD8-PBMCS共同培养，扩增肿瘤特异性、δ T 淋巴细胞。根据本发明的优选实施例，所述步骤(1)包括将白血病细胞经放射性核素钴辐照灭活的步骤。根据本发明的优选实施例，所述步骤(3)中培养的条件为37°C和5% C02。本发明具有如下有益效果(1)直接将灭活的自体白血病细胞与Y δ T淋巴细胞相接触培养，能够免去繁琐的白血病相关抗原的筛选步骤，是一种简洁有效的方法。(2)能够产生具有个体化效应特征的肿瘤特异性Y δΤ淋巴细胞，可作为一种有效的白血病治疗方案。本发明中，通过灭活的自体白血病细胞的肿瘤抗原与Y δ T淋巴细胞的相应受体相交联，并且在重组人白介素2和植物凝集素的生长因子的刺激下，使得对肿瘤抗原特异性的Y δT淋巴细胞被选择性增殖激活。本发明扩增获得的Y δT淋巴细胞对于自体白血病细胞和异源性白血病细胞系都有良好的抑制作用，在白血病的过继免疫治疗中有广泛的应用前景。图1为显微镜检测扩增的Y δ T淋巴细胞呈集落克隆性生长。图2为不同的生物因子或其组合对Y δ T淋巴细胞增殖的影响。图3为⑶4-⑶8-PBMCs细胞组分扩增前后的表型改变。其中，A为扩增前，B为扩增后。图4为扩增性Y δ T淋巴细胞的细胞因子分泌谱。图5为扩增性、δ T淋巴细胞对白血病细胞的细胞毒作用。其中，A为对自体白血病细胞的杀伤活性，B为对异源性白血病细胞株的杀伤活性。图6为扩增性γ δ T淋巴细胞在体内的白血病作用。其中，A为在活体内的抗异源性白血病作用，B为在活体内的抗自体白血病作用。将实施例3中获得的四例扩增性Y δΤ淋巴细胞用SyMWCFSESE 10分钟后作为效应细胞，然后与标记的靶细胞按照效靶比(effector target, E T)分别为 0 1(作为 control 组)、0. 5 1、1 1,2. 5 1、5 1 在 37°C (5% CO2)共培养 4 小时， 然后用armexinV-PE和7’_AAD染料室温染色15分钟。用FCM立即检测分析，以CFSE阴性细胞设门，以armexin V或和V -AAD阳性细胞作为凋亡细胞。计算公式为杀伤率(％ ) =实验组(凋亡率对照组(凋亡率％)。如图5所示，在5 1的效靶比的条件下，扩增性Y S T细胞系对自体白血病细胞的杀伤率为20% 30% (图5A)，对异源性白血病细胞株的杀伤率为10% 25% (图5B)，且随着γ δ T淋巴细胞的数量增加，其杀伤力越强， 显示本发明的Y ST淋巴细胞的杀伤能力是数量依赖的。实施例8、扩增件γ δ T细胞在SCID小鼠中的抗白血病作用8. 1、扩增性Y δ T淋巴细胞在活体内对异源性白血病细胞株的抗白血病作用采用6周龄的SCID雌性小鼠，随机分为两组对照组和治疗组，每组3只。取生长良好的AML细胞系Kasumi-I细胞(由上海市血液学研究所提供)，以完全培养基(含10% FBS的RPMI1640培养基)洗涤2次，重悬于无血清RPMI-1640培养基，将4 X IO6细胞注射至每只小鼠腹腔内。治疗组小鼠同时同部位注射生长状态良好的实施例3中获得的一例扩增性Y S T淋巴细胞2 X IO7个细胞，4天后再次注射相同数量的γ δ T淋巴细胞，对照组用同体积的RPMI-1640培养基注射。在上述接种的同时，在同一部位注射rhIL-2 2000IU/只。 Y ST淋巴细胞在活体内杀伤异源性白血病细胞株的作用通过小鼠生存率进行评价。实验结果如图6A所示，所有的小鼠，如果没有接种γ δΤ淋巴细胞，则小鼠腹腔逐步出现肿胀， 在50天后开始逐渐死亡，70天后全部死亡。相反，用γ δ T淋巴细胞接种的小鼠生存期明显延长，在80天后才开始出现死亡，100天后仍然有小鼠存活(P < 0. 01)。8. 2、扩增性γ δ T淋巴细胞在活体内对自体白血病细胞的抗白血病作用采用6周龄的NOD-SCID雌性小鼠，随机分为两组对照组和治疗组，每组7只。用亚致死量的放射线(150cGy)处理小鼠，随后骨髓移植初发白血病病人来源的白血病细胞。 初发的白血病细胞被注射到小鼠胫骨腔，每只小鼠注射1 X IO7个细胞，最终每只小鼠注射的细胞液体量为50μ 1。然后，在治疗组中，分别在第1天和第4天尾静脉注射实施例3中获得的一例扩增性Y δ T淋巴细胞2X IO7个细胞和2000IU rhIL-2至小鼠体内。同时，对照组经小鼠尾静脉注射同体积的RPMI-1640培养基和2000IU rhIL_2。8周后，采集小鼠外周血，检测人⑶45阳性细胞的百分数。γ δ T淋巴细胞在活体内杀伤自体白血病细胞、组织白血病细胞植入的作用通过小鼠生存率进行评估。实验结果如图6Β所示，在没有用γ δ T 淋巴细胞接种的小鼠中，有5只小鼠在外周血出现人⑶45阳性细胞O % 11 % )，在60天后开始出现死亡。相反，所有用、ST淋巴细胞接种过的小鼠在观察期内生存期明显延长 (P < 0. 05)。


本发明公开了一种肿瘤特异性γδT淋巴细胞的扩增方法。该方法是联合使用灭活的自体白血病细胞、重组人白介素2(rhIL-2)、植物凝集素(PHA)和自体单核细胞组分CD4-CD8-PBMCs共同培养，扩增肿瘤特异性γδT淋巴细胞。所述肿瘤特异性γδT淋巴细胞可用于抗白血病免疫反应，可作为一种有效的白血病治疗方案。