早鸽—汇聚行业精英
  • 联系客服
  • 帮助中心
  • 投诉举报
  • 关注微信
400-006-1351
您的问题早鸽都有答案
3000+专业顾问
搜索
咨询

应用病毒治疗肿瘤制作方法

  • 专利名称
    应用病毒治疗肿瘤制作方法
  • 发明者
  • 公开日
  • 申请日期
  • 优先权日
  • 申请人
  • 文档编号
  • 关键字
  • 技术领域
    本发明涉及可以复制并可在干扰素(IFN)介导的抗病毒应答中杀死肿瘤细胞的病毒在这一点上,RNA和DNA病毒均可应用本发明还涉及这些病毒在治疗肿瘤性疾病中的应用,所述肿瘤性疾病包括癌症和巨大肿瘤
  • 背景技术
  • 专利详情
  • 全文pdf
  • 权力要求
  • 说明书
  • 法律状态
专利名称:应用病毒治疗肿瘤的制作方法包括癌症在内的肿瘤性疾病是导致人类死亡的首要因素之一。在美国,每年有超过130万的新确诊癌症病例和55万的死亡病例。在癌症转移到身体第二个部位之前的早期探察,可以大大增加宿主的存活机会。但是,癌症的早期探察并非总是可行,甚至在早期探察成功的时候,治疗也往往不尽如人意,特别是高度恶性的癌症病例。癌症的治疗包括化疗和放疗,对晚期病例疗效差强人意,特别是当肿瘤生长相当巨大和/或肿瘤负荷较大时。(见Hillard Stanley,癌症治疗报告,第61卷,第1期,1977年1/2月,29-36页,Tannock,癌症研究,第42卷,4921-4926页,1982年12月)。与暴露于多种病毒有关的肿瘤消退业已有所报道。所述的绝大多数病毒对人类具有致病性,包括流行性腮腺炎病毒和麻疹病毒。其他特定病毒对特定类型癌症细胞的作用也已有报道。Smith等,(1956)癌症,9,1211(腺病毒对宫颈癌的作用);Holzaepfel等,(1957)癌症,10,557(腺病毒对上皮性肿瘤的作用);Taylor等,(1970)国立癌症研究所杂志,44,515(牛肠病毒-l对肉瘤-l的作用);Shingu等,(1991)普通病毒学杂志,72,2031(牛肠病毒MZ-468对白血病细胞F-647的作用);Suskind等,(1957)PSEBM,94,309(柯萨奇B3病毒对HeLa肿瘤细胞的作用);Rukavishnikova等,(1976)病毒学学报,20,387(甲型流感病毒株对腹水肿瘤的作用)。最早的文献描述了应用减毒病毒活疫苗而使肿瘤部分消退的现象,上述治疗是为了使患者获得针对天花或狂犬病的免疫能力。见DePace,N.G.(1912)Ginecologia,9,82-88;Salmon,P.& Baix(1922)Compt.Rend.Soc.Biol.,86,819-820。在自然感染麻疹的病例中,也已观察到肿瘤的部分消退和白血病的消退。见Pasquinucci,G.(1971)柳叶刀,1,136;Gross,S.(1971)柳叶刀,1,397-398;Bluming,A.Z.和Ziegler,J.L.(1971)柳叶刀,2,105-106。在一项有90名癌症患者参加的研究中,患者自愿感染流行性腮腺炎活病毒,结果在79名患者中出现了肿瘤的部分消退。见Asada(1994)癌症,34,1907-1928。尽管这些病毒的副作用是暂时的,但感染这些人类病原体的严重后遗症是人们关注的一个焦点。× × × ×病毒分类如下[见Murphy A和Kingsbury DW主编,病毒学,第2版,1990,(Ed.Field,B.N.),Raven出版社,纽约,9-35页]分类特征 病毒科名称RNA病毒ssaRNA,正义链, 细小核糖核酸病毒科,嵌杯状病毒科未分段,无包膜,ss RNA,正义链, 披膜病毒科,黄病毒科未分段, 冠状病毒科有包膜ss RNA,反义链, 棒状病毒科,线状病毒科未分段, 副粘病毒科有包膜ss RNA,反义链, 正粘病毒科有片段,有包膜ss RNA,双义链, 布尼病毒科,沙粒病毒科有片段,有包膜dsbRNA,正义链, 呼肠病毒科,双RNA病毒科有片段,无包膜ss RNA,DNA复制过程中, 逆转录病毒科正义链,未分段,有包膜DNA病毒ss/dsDNA,无包膜 嗜肝DNA病毒科ss DNA,无包膜细小病毒科dsDNA,无包膜 乳多空病毒科,腺病毒科dsDNA,有包膜 疱疹病毒科,痘病毒科,虹彩病毒科ass=单链bds=双链疱疹病毒科(疱疹病毒)中包括α-疱疹病毒(包括生殖器水痘病毒和生殖器单纯疱疹病毒),β-疱疹病毒和γ-疱疹病毒三个亚科。新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科(或副粘病毒)中的一员。NDV的自然宿主是鸡及其他禽类。典型的NDV可与动物宿主细胞表面的特定分子结合,然后与细胞表面融合,并将其遗传物质射入宿主细胞内。NDV是一种细胞致死性病毒。一旦进入细胞,病毒基因就会指导宿主细胞生成病毒拷贝,并导致宿主细胞的死亡,释放NDV拷贝,感染其他细胞。与一些病毒不同,尚未发现NDV可致人类任何严重疾病。与其他种类病毒(如HTLV-1,乙型肝炎病毒)不同,尚未发现副粘病毒可致癌。在一小部分暴露于NDV的患者中,曾有报道肿瘤的一过性消退,见Csatary,L.K.(1971)柳叶刀,2,825。Csatary观察到,一名养鸡农民的胃肠癌在其养殖的鸡群流行新城疫时消退。在一个类似的轶闻报道中,Cassel,W.A.和Garrett,R.E.观察到在一例已经有淋巴结转移的宫颈癌患者中,向宫颈肿瘤注射NDV后,原位宫颈癌消退。见(1965)癌症,18,863-868。由于肿瘤杀伤活性的机制一直被认为与免疫有关,因此旨在阐述病毒对肿瘤具有直接细胞毒作用的工作一直没有开展。相反,研究人员一直致力于揭示NDV的免疫介导效应。见,如Murray,D.R.,Cassel,W.A.,Torbin,A.H.,Olkowski,Z.L.,& Moore,M.E.(1977)癌症,40,680;Cassel,W.A.,Murray,D.R.,& Phillips,H.S.(1983)癌症,52,856;Bohle,W.,Schlag,PJ.,Leibrich,W.,Hohenberger,P.,Manasterski,M.,Miller,P.,和Schirrmacher,V.(1990)癌症,66,1517-1523。在上述参考文献中,导致肿瘤消退的特定病毒的筛选基于运气或试验以及失误。仅仅在最近,才开发出基于机制研究并有理论支持的应用DNA病毒治疗癌症的方法。这类方法的一个实例是在研发重组腺病毒载体时发现的,该载体仅能在发生于特定组织的肿瘤中复制(Rodriguez,R.等,1997癌症研究,572559-2563),或在那些缺乏某种关键调节蛋白的肿瘤中复制(Bischoff,JR等,1996科学,274373-376)。最近的另一种方法是应用不具有复制能力的重组腺病毒载体来恢复某些肿瘤细胞已经丧失的一种重要蛋白功能(Zhang,WW等,1994癌症基因治疗,15-13)。最后,单纯疱疹病毒业已经工程修饰,优先在快速分裂的细胞中复制,而快速分裂正是肿瘤的特征所在(Mineta,T.等,1994癌症研究,543963-6966)。申请号08/260,536的美国专利公布了应用NDV或其他副粘病毒治疗癌症,在此全文引入作为参考。
病毒干扰素转基因表达应用病毒疗法治疗癌症的一种常用方法是利用病毒载体,将特定基因给予肿瘤瘤体。
重组腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒和逆转录病毒均已经修饰,单独表达干扰素基因或与其他细胞因子基因联合表达。
在Zhang等发表的文章中((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA934513-4518),表达人干扰素同质(即合成)基因的重组腺病毒用于在裸鼠上治疗人乳腺癌(和其他)异种移植物。作者总结道“……将病毒的溶瘤细胞作用和致病性低的病毒结合,该病毒本身对干扰素或干扰素基因治疗有抗性,可能成为一种治疗多种不同肿瘤的富有成效的方法,特别是对乳腺癌”。与本发明涉及干扰素敏感性病毒不同,Zhang等(1996)应用了干扰素耐药性腺病毒治疗肿瘤。
在Zhang等发表的文章中((1996)癌症基因治疗,331-38),表达同质干扰素基因的腺伴随病毒(AAV)用来在体外转导人肿瘤细胞,然后给裸鼠注射。转导的肿瘤细胞或者根本未形成肿瘤,或者较未转导的对照组生长缓慢。而且,将一种转导的人肿瘤细胞注射入另一种肿瘤瘤体,结果可导致未转导肿瘤的体积缩小。在Peplinski等的文章中((1996)肿瘤外科学纪事,315-23),γ干扰素(和其他细胞因子,单独表达或联合表达)在小鼠乳腺癌模型中得到了检测。用经重组痘苗病毒修饰过的肿瘤细胞免疫小鼠。当再次暴露于肿瘤细胞时,经病毒修饰细胞免疫的小鼠无瘤存活时间延长,并具有统计学意义。
Gastl等((1992)癌症研究,526229-6236)应用表达γ干扰素的逆转录病毒载体体外转导肾肿瘤细胞。结果显示,对免疫系统功能至关重要的许多蛋白质在这些细胞中的产量大幅提高。
Restifo等((1992)实验医学杂志,1751423-1431)应用表达γ干扰素的逆转录病毒载体转导鼠肉瘤细胞系,使肿瘤细胞系可以向CD8+T细胞更有效地提呈病毒抗原。
Howard等((1994)纽约科学院纪事,716167-187)应用表达γ干扰素的逆转录病毒载体转导鼠和人黑色素瘤细胞。结果发现,对免疫功能至关重要的蛋白质在这些细胞的表达增加。这些细胞较之未转导的亲本细胞系对小鼠的致瘤性弱,并可在体内激活肿瘤特异性CTL反应。
应用治疗剂量的干扰素作为肿瘤病毒治疗的佐剂众所周知,由于干扰素具有免疫增强作用,几项研究检测了干扰素与其他癌症病毒疫苗治疗的联合应用。
在Kirchner等的文章中((1995)世界泌尿学杂志,13171-173),208名患者应用经NDV修饰、放射致死的自体肾细胞癌肿瘤细胞免疫,并联合小剂量IL-2或α干扰素治疗。作者表示,这种治疗方案使局部晚期的肾细胞癌患者的自然病程得到改善。治疗剂量约为3.3×105PKU/kg。这是局部治疗,与系统治疗不同,目的是诱导抗肿瘤免疫反应。
Tanaka等((1994)强调肿瘤免疫学的免疫治疗杂志,16283-293)给小鼠联合应用α干扰素和重组痘苗病毒,作为癌症疫苗疗法模型。该研究显示,接受干扰素的小鼠较之未接受的小鼠存活能力具有统计学意义的改善。作者将干扰素的效果归功于在动物中诱导了CD8阳性T细胞。
Arroyo等((1990)癌症免疫学与免疫治疗,31305-311)应用结肠癌小鼠模型,检测了α干扰素和/或IL-2联合治疗对痘苗病毒结肠瘤细胞溶解剂(VCO)治疗癌症效果的影响。结果发现,VCO+IL-2+IFN的三联疗法在该鼠模型中是最有效的。这一方法有赖于免疫是抗治疗活性的机制。
在上述研究中,干扰素用于增强免疫系统对肿瘤细胞的识别能力。
发明目的本发明的一个目的是为包括癌症的疾病治疗提供病毒。
本发明的另一个目的是为包括癌症的肿瘤性疾病的治疗提供病毒。
本发明的另一个目的是提供一种方法,该方法可以选择和/或筛查用于肿瘤性疾病治疗的备选病毒。
本发明的另一个目的是提供病毒遗传工程学指导,用以在治疗肿瘤性疾病时增加其治疗效用。
本发明的另一个目的是提供一种方法,用该方法可以筛选病毒治疗的潜在靶细胞,目的是评价备选靶细胞对病毒杀伤力的敏感性。
本发明的另一个目的是提供病毒治疗管理的指导。
本发明的一个目的是提供一种治疗巨大肿瘤的方法。
本发明的另一个目的是提供纯化的病毒以及获得纯化病毒的方法。
发明概述本发明涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。所述病毒选自腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、虹彩病毒和疱疹病毒科的RNA病毒和DNA病毒。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒系统性给予哺乳动物。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物包括癌症在内的肿瘤性疾病的方法,该方法包括将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。所述病毒选自腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、虹彩病毒和疱疹病毒科的RNA病毒和DNA病毒。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆痘苗病毒给予哺乳动物。所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变,所述病毒基因与干扰素抗病毒活性的阻断有关,选自K3L,E3L和B18R基因。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物包括癌症在内的肿瘤性疾病的方法,该方法是将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性痘苗病毒给予哺乳动物。所述痘苗病毒在一个或多个病毒基因上具有一个或多个突变,所述病毒基因与干扰素抗病毒活性的阻断有关,选自K3L,E3L和B18R基因。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,该肿瘤至少1cm。所述方法包括将选自(1)RNA病毒;(2)嗜肝DNA病毒;(3)细小病毒;(4)乳多空病毒;(5)疱疹病毒;(6)痘病毒;和(7)虹彩病毒的克隆病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物肿瘤的方法,包括将治疗有效剂量的克隆病毒给予哺乳动物,所述病毒选自(1)RNA病毒;(2)嗜肝DNA病毒;(3)细小病毒;(4)乳多空病毒;(5)疱疹病毒;(6)痘病毒;和(7)虹彩病毒。这里,肿瘤的大小至少1厘米。
本发明还涉及一种治疗哺乳动物肿瘤的方法,包括将治疗有效剂量的肿瘤细胞致死性RNA病毒给予哺乳动物,所述哺乳动物的肿瘤负荷至少占总体重1.5%。
本发明还涉及一种方法,该方法可用于筛选从患者处得到的新鲜肿瘤细胞或组织,并测定该细胞或组织对病毒杀伤力的敏感性,包括应用干扰素敏感性病毒,采用差异细胞毒试验,检测细胞或组织。
本发明还涉及在哺乳动物中鉴别病毒抗肿瘤活性的方法,包括a)应用备检病毒感染i)有干扰素介导的抗病毒活性缺陷的细胞,和ii)具有干扰素介导的抗病毒活性的细胞,和b)测定备选病毒是否优先杀伤有干扰素介导的抗病毒活性缺陷的细胞,而非具有干扰素介导的抗病毒活性的细胞。
本发明还涉及制备用于抗肿瘤治疗的病毒的方法,包括a)修饰现有病毒,以降低或消除病毒灭活干扰素抗病毒作用的病毒机制,并任选b)创建一种减毒突变,结果使其较现有病毒的毒力弱。
本发明还涉及一种在哺乳动物中控制病毒复制的方法,该哺乳动物应用选自RNA病毒、腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、细小病毒、嗜肝DNA病毒,水痘病毒、β疱疹病毒和γ疱疹病毒的病毒治疗,包括给予抗病毒化合物。
本发明还涉及筛查肿瘤细胞、肿瘤组织或组织切片的方法,该方法可以测定哪些肿瘤细胞或组织允许病毒结合,包括将肿瘤细胞、组织或组织切片应用免疫试验或免疫染色,显示肿瘤细胞或肿瘤组织上存在的病毒受体量。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,包括在随后的至少一次大剂量病毒给予前,将脱敏剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒系统给予。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物,整个过程至少持续4分钟。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,包括将具有复制能力的克隆病毒给予,所述病毒选自新城疫病毒株MK107,新城疫病毒株NJ Roakin,新培斯病毒和疱疹性口炎病毒。
本发明包括i)应用无沉淀超速离心法纯化的克隆副粘病毒;ii)一种纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒;iii)一种纯化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒;iv)一种纯化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平的克隆副粘病毒;v)一种纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒;vi)一种纯化至至少1×1010PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒;vii)一种纯化至至少6×1010PFU/mg蛋白水平的克隆RNA病毒;viii)一种细胞致死性克隆DNA病毒,所述病毒对干扰素敏感,纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平;ix)一种具有复制能力的痘苗病毒,所述病毒a)在一个或多个K3L、E3L和B18R基因中含有一个或多个突变,和b)在编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶、核苷酸还原酶、痘苗生长因子、胸苷酸激酶、DNA连接酶、dUTP酶的基因中具有一个或多个减毒突变;x)一种具有复制能力的痘苗病毒,所述病毒在选自K3L、E3L和B18R的两个或多个基因中含有一个或多个突变;xi)一种(2’-5’)A类似物表达被修饰的疱疹病毒,该修饰使疱疹病毒对干扰素的敏感性增强;以及xii)一种在ω-3存在减毒突变的呼肠病毒,所述突变使病毒对干扰素敏感;xiii)一种具有复制能力的细胞致死性病毒,所述病毒干扰素敏感,并纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平;
xiv)一种纯化至至少2×109PFU/mg蛋白水平的呼肠病毒。
本发明还包括下述方法i)一种纯化RNA病毒的方法,包括以下步骤a)产生克隆病毒;以及b)应用无沉淀超速离心法纯化所述病毒;或c)应用切线层流过滤法纯化所述克隆病毒,随后可进行或不进行凝胶渗透层析;以及ii)一种纯化副粘病毒的方法,包括应用无沉淀超速离心法纯化所述病毒,或应用切线层流过滤法纯化所述病毒,随后可进行或不进行凝胶渗透层析。
本发明还涉及在哺乳动物中治疗疾病的方法,在所述疾病中致病细胞对干扰素介导的抗病毒应答有缺陷,所述方法包括将治疗有效剂量的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及应用病毒感染哺乳动物肿瘤的方法,包括将具有复制能力的干扰素敏感性克隆RNA病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及哺乳动物病毒性疾病的治疗,包括将治疗有效剂量的具有复制能力的克隆病毒给予哺乳动物。
本发明还涉及感染哺乳动物肿瘤的方法,包括给予选自副粘病毒科、正粘病毒科、棒状病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、细小核糖核酸病毒科、冠状病毒科、呼肠病毒科、痘病毒科、疱疹病毒科和细小病毒科的病毒。
本发明还涉及治疗肿瘤腹水的方法,包括给予具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒。
本发明还涉及减轻哺乳动物疼痛的方法,包括给予具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒。
本发明还涉及治疗哺乳动物肿瘤的方法,包括应用免疫试验方法测定从所述哺乳动物获得的样本病毒受体的存在量,并且如果受体存在,将能与受体结合的具有复制能力的干扰素敏感性克隆病毒给予哺乳动物。
附图简述

图1显示了抗β干扰素抗体对病毒抗原表达和NHEK(正常人上皮角化细胞)细胞内感染滴度的影响。
图2显示了β干扰素对不同细胞中(正常人皮肤成纤维细胞CCD922-sk和两种类型的头颈部肿瘤细胞(KB和Hep2细胞))病毒抗原表达的影响。
图3A显示了干扰素对CCD922-sk细胞中病毒抗原表达的影响,图3B显示了干扰素对KB细胞中病毒抗原表达的影响。
图4显示了携带人卵巢ES-2肿瘤的无胸腺小鼠在生理盐水或NDV治疗下的生存曲线。
图5显示了一组人肿瘤细胞系和正常细胞系对干扰素的反应性。
图6显示了SW620肿瘤细胞系对PPMK107和PPSINDBIS-Ar339感染的剂量反应。
发明详述本发明涉及一种新机制的发现,通过该机制,病毒复制可以选择性杀伤对干扰素(IFN)介导的抗病毒应答具有缺陷的肿瘤细胞。本发明还提供了筛选、设计、纯化和应用病毒治疗包括癌症和巨大肿瘤在内的肿瘤性疾病的方法。基于肿瘤细胞具有选择性干扰素介导的抗病毒应答缺陷,本发明的病毒在这些肿瘤细胞中可以选择性复制并杀伤这些细胞。将适宜剂量的病毒给予后可导致肿瘤细胞死亡,而正常细胞由于拥有完整的干扰素介导的抗病毒应答,可以限制病毒的复制,从而不被杀伤。本发明的主题包括应用副粘病毒,如NDV和其他病毒治疗包括肿瘤性疾病如癌症在内的疾病。本发明还教导如何筛选和制备适用于肿瘤性疾病治疗的其他病毒。本发明的另一个实施方案包括鉴定备选肿瘤组织是否适用病毒治疗的方法。最后,本发明还阐述了高纯度病毒的制备方法。
应用干扰素敏感性病毒包括NDV治疗肿瘤性疾病的理论基础NDV显示对肿瘤细胞的选择性杀伤作用新城疫病毒对多种人肿瘤细胞具有选择性细胞毒作用,而对绝大多数正常人细胞的作用明显趋弱。在差异细胞毒试验中发现,源于肾癌、胰腺癌、肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌以及成胶质细胞瘤的人肿瘤细胞对NDV较很多正常人细胞肾上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、黑色素细胞以及上皮细胞(见实施例1)敏感3-4个数量级。差异细胞毒试验还可用以新鲜分离患者细胞或肿瘤组织。
实施例1描述了用以界定NDV肿瘤杀伤活性的体外试验。试验测定了杀伤50%在5天内培养的试验细胞所需的病毒量。实施例2和3显示了体内试验的结果,试验中,病毒通过瘤体内(实施例2)或静脉内(实施例3)途径给予携带人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠。结果显示,在检测化疗药物潜力的标准动物模型中,NDV可以使多种类型的人类肿瘤消退。
应用病毒抗原免疫组化染色显示了NDV在肿瘤中特异性复制的证据(实施例2)。瘤体内注射病毒30分钟内,病毒抗原在肿瘤组织中呈现阴性。但治疗2天后,肿瘤内加强免疫染色可以看见病毒抗原,提示病毒在肿瘤内复制。重要的是,病毒在肿瘤组织内特异性复制,因为与肿瘤邻近的结缔组织和皮肤,病毒抗原呈阴性。
重要的是,如应用UV灭活的非克隆病毒进行的研究所示(Lorence,R.等,1994,国立癌症研究所杂志,861228-1233),NDV的有效复制对于病毒杀伤感染细胞至关重要。
NDV瘤体内或静脉内给予后还可导致巨大肿瘤的消退(实施例4-9)。无胸腺小鼠瘤体内NDV治疗巨大皮内A375人类黑色素瘤异种移植物(最大径≥10mm;肿瘤体积≥300mm3)导致肿瘤的高消退率(实施例4-8)。无胸腺小鼠静脉内NDV治疗巨大皮下HT1080人类纤维肉瘤异种移植物(最大径≥10mm),结果在6只小鼠中有5只发生了肿瘤完全或部分消退(实施例9)。
细胞因子I类干扰素家族是病毒感染的重要负性调节因子I类干扰素包括主要从原始造血细胞中发现的α干扰素和主要从成纤维细胞和上皮细胞中发现的β干扰素。Joklik,W.K.1990,干扰素,383-410页。病毒学,第2版,B.N.Fields,D.M.Knipe等编辑,Raven出版有限公司,纽约;以及Sreevalsan,T.1995,应用α和β干扰素进行生物治疗临床预试验研究,347-364页。癌症的生物治疗,第2版,V.T.DeVita,Jr.,S.Hellman,和S.A.Rosenberg,J.B.LiPPincott公司,费城。两种类型的干扰素通过基本相同的作用机制发挥功能,包括降解病毒复制的中间产物双链RNA,抑制通过双链RNA激活的蛋白激酶的活性,从而抑制细胞翻译(Joklik,W.K.1990,干扰素,383-410页。病毒学,第2版,B.N.Fields,D.M.Knipe等编辑,Raven出版有限公司,纽约;以及该书引用的参考文献)。其他几种病毒(流感病毒,EB病毒,SV40,腺病毒,痘苗)通过一个或多个途径抑制干扰素系统的机制,也使病毒可以有效复制(Katze,M.G.,1995,微生物趋势,375-78)。
多种肿瘤细胞缺乏通过干扰素依赖机制限制病毒感染的能力人宫颈癌细胞(HeLa)在用干扰素预处理后,对疱疹性口炎病毒复制的抑制敏感性较未转化的成纤维对照细胞系弱300多倍(Maheshwari R.K.,1983,生物化学与生物物理学研究评论,17161-168)。本专利发明人发现,感染共同培养的致瘤性人头颈部肿瘤细胞(KB)和正常人皮肤成纤维细胞(CCD922-sk),结果显示开始时病毒在两种细胞内均有复制,然后,在正常细胞内感染受到限制,而在肿瘤细胞中,病毒持续复制,并杀伤肿瘤细胞(实施例10)。而且,尽管正常细胞向培养基中分泌干扰素,但在建立的抗病毒状态下,肿瘤细胞在产生的浓度下对干扰素无反应。通过两个分离的试验,获得了干扰素在NDV杀伤肿瘤细胞和正常细胞不同敏感性中所起作用的进一步证据,在所述试验中,正常成纤维细胞(CCD922-sk)或正常上皮角化细胞(NHEK)在干扰素中和抗体存在的情况下,对NDV感染变得更加敏感(实施例11和12)。最后,在干扰素存在的情况下,平行感染正常成纤维细胞(CCD922-sk)和人肿瘤细胞(KB),结果发现,正常细胞对添加的干扰素的抗病毒作用较之肿瘤细胞敏感至少100倍(实施例13和14)。多个肿瘤细胞系(总共9个)的相似测试发现,细胞系对NDV的杀伤相对敏感性与该细胞系对干扰素介导的抗病毒应答无能之间存在清晰的相互关联(实施例26)。
干扰素和细胞生长目前存在几种类型的干扰素(IFN),包括天然和重组形式的α干扰素、β干扰素、ω干扰素和γ干扰素,以及合成同质形式的干扰素(如,Zhang等(1996)癌症基因治疗,331-38所述)。除了导致其被发现的抗病毒活性,众所周知,干扰素在细胞生长和分化的自然调节中起重要作用。干扰素被认为是一种负性生长调节因子,几种参与干扰素活性功能发挥和调节的关键蛋白质业已显示在正常细胞中作为肿瘤抑制蛋白存在(Tanaka等,1994,细胞,77829-839)。而且,其他几种拮抗干扰素抗病毒活性的蛋白质业已显示,在表达不当时,具有致瘤潜力(见下,Barber,GN,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,914278-4282)。源于多种人类癌症的细胞业已显示编码干扰素的基因缺失(James,CD等,癌症研究,511684-1688),并且在人宫颈癌(Petricoin,E等,1994,分子细胞生物学,141477-1486)、慢性淋巴细胞性白血病(Xu,B等,1994,血液,841942-1949)、和恶性黑色素瘤细胞(Linge,C.等,1995,癌症研究,554099-4104)中观察到干扰素功能的部分或完全丧失。
业已显示,干扰素诱导性激酶(p68,PKR)是一种细胞和病毒蛋白合成的重要调节因子。将p68激酶的表达与活性和细胞分化状态联系起来的相互关系业已显见。因此,分化不好的细胞,如那些在许多癌症中发现的细胞,往往有p68功能的缺陷(Haines,G.K.等,1993,Virchows Arch B CeU Pathol.,63289-95)。缺乏p68活性的细胞通常对病毒介导的杀伤敏感,因为p68激酶是干扰素诱导的抗病毒状态的一种重要效应物质。p68的抗病毒活性可以通过与被定义为p58的细胞蛋白直接作用而被拮抗。当在NIH3T3细胞中克隆并过量表达时,p58可使细胞表现转化表型并呈非锚定依赖型生长(BarberGN等,1994,Proc Natl Acad Sci USA,914278-4282),并且很多人白血病细胞系业已显示过量表达p58(Korth MJ等,1996,基因,170181-188)。p68激酶活性还可被Ras蛋白拮抗。表达突变、激活形式Ras的细胞显示,不能通过双链RNA激活p68激酶(Mundshau,L.J.,和Faller,D.V.,1992,生物化学杂志,26723092-23098)。
未分化细胞对病毒杀伤的敏感性可通过给予分化程度高的表型而逆转(Kalvakolanu,DVR和Sen,G.C.1993,Proc Natl Acad SciUSA,903167-3171)。
定义具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞。这里应用的术语“具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞”是指对低水平(如,10单位/ml)外源性干扰素有反应的细胞,所述反应是指相对于没有干扰素存在的情况,干扰素敏感性病毒的复制能力显著下降(至少10倍,更优选至少100倍,更优选至少1000倍,最优选至少10,000倍)。病毒复制的程度通过检测病毒量来测定(如,感染病毒,病毒抗原,病毒核酸)。正常成纤维细胞CCD922是具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞。
干扰素介导的抗病毒应答缺陷细胞。这里应用的术语“干扰素介导的抗病毒应答缺陷细胞”是指不符合上述具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞标准的细胞,即,这些细胞对低水平(如,10单位/ml)外源性干扰素无反应,所述反应是指相对于没有干扰素存在的情况,干扰素敏感性病毒的复制能力显著下降。口腔肿瘤细胞KB是干扰素介导的抗病毒应答缺陷细胞。
克隆的。应用的术语“克隆的”病毒定义为从单个感染病毒颗粒获得的病毒,并且单独的分子克隆具有显著的核酸序列同源性。例如,序列同源是指在病毒中选取至少8个单独的分子克隆,在300个以上相邻核苷酸范围内,序列特异性高于95%,更优选高于97%,更优选高于99%,最优选为100%。
细胞致死性。这里应用的术语“细胞致死性”病毒是指能够感染细胞并导致细胞死亡的病毒。
脱敏。这里应用的词组脱敏是指应用一种制剂进行预处理,以减轻病毒给予引起的副作用。
脱敏剂量。这里应用的词组“脱敏剂量”是指为减轻随后给予病毒引起的副作用而需要的病毒量。
差异细胞毒试验。这里应用的词组“差异细胞毒试验”是应用病毒筛查肿瘤细胞或组织,指a)病毒感染肿瘤细胞以及一种或多种对照细胞或组织;b)在感染一天或多天以后,测定每个样本的细胞存活力或死亡量(如,实施例1详细描述的应用染色指示剂测定细胞的活力);以及c)根据结果,就可以估计样本相对于对照组对病毒的敏感性(如,实施例1详细描述的IC50测定)。
感染肿瘤。这里应用的术语“感染肿瘤”是指将病毒核酸给予肿瘤细胞或组织。
干扰素敏感。这里应用的词组“干扰素敏感”病毒(如NDV)是指相对于无干扰素的情况,在有干扰素存在的情况下,复制能力显著减弱(至少减弱10倍,优选至少减弱100倍,更优选至少减弱1000倍,最优选至少减弱10,000倍)的病毒。在有或无低水平外源性干扰素(如10单位/ml)的情况下,收获具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞中的病毒,通过检测病毒量(如感染病毒,病毒抗原,病毒核酸)来确定上述病毒复制能力。
干扰素反应性。这里应用的词组“干扰素反应性”病毒(如NDV)是指在1.0moi(多样性感染)感染后的病毒,在经500单位/ml外源性α干扰素持续预处理24小时的细胞表达的病毒抗原,较未处理细胞至少少50%。测定是在感染后至少24小时,具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞中进行的,并且,在第1天,就会检测到病毒抗原表达50%的下降。
肿瘤和肿瘤性疾病。这里应用的“肿瘤”是指新生的组织,包括肿瘤、良性生长(如湿疣,乳头瘤)和恶性生长(如癌症)。这里应用的“肿瘤性疾病”是指表现为肿瘤的疾病。
具有复制能力。这里应用的术语“具有复制能力”的病毒是指在肿瘤细胞中可以产生感染后代的病毒。
基本无污染鸡卵蛋白。术语“基本无污染鸡卵蛋白”是指病毒纯度的水平,这里本领域的技术人员应用Western印迹法检测不到卵白蛋白,所述方法包括1)每孔(宽3.3cm)病毒量为1.7×109PFU,进行SDS-PAGE(十二烷基硫代硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(厚1mm);2)将病毒蛋白从凝胶转移到硝化纤维膜上;以及3)应用兔抗卵白蛋白抗体兔IgG片段,将4mg/ml抗体浓度(购自Cappel公司)1∶200稀释,或多克隆抗体等价物进行卵白蛋白的免疫染色,以及,更优选,应用敏感度为2.4ng/ml的电化学发光试验检测不到卵白蛋白。
治疗有效剂量。这里应用的术语“治疗有效剂量”是指在治疗肿瘤性疾病时,可以产生预期效应,如肿瘤生长停止、肿瘤消退、临床病情改善或存活增加的病毒数量。
本发明化合物多组病毒被用来选择性杀伤肿瘤细胞。自然存在的或工程学生产的病毒均可作为抗肿瘤剂发挥作用。这些病毒i)感染肿瘤细胞导致其死亡;ii)在肿瘤细胞内具有复制能力;以及iii)由于干扰素的抗病毒效应,在正常细胞中的杀伤作用受限。
在本发明的一个优选实施方案中,具有上述三种特征(i)感染肿瘤细胞导致其死亡;(ii)在肿瘤细胞内具有复制能力;以及(iii)由于干扰素的抗病毒效应,在正常细胞中的杀伤作用受限的病毒也可诱导干扰素。
在本发明的另一个优选实施方案中,具有上述三种特征的病毒也可导致人类肿瘤的消退;和/或在靶定人群中,不会由于已经存在的免疫而被中和。
在另一个优选实施方案中,具有上述三种特征的病毒对肿瘤细胞来说,是细胞致死性的。
根据本发明,副粘病毒(这里应用的“副粘病毒”指副粘病毒科中的一员)可用来治疗肿瘤,包括巨大肿瘤或宿主肿瘤负荷大。副粘病毒科科包括三类(1)副粘病毒;(2)麻疹样病毒(麻疹病毒);以及(3)呼吸道合胞病毒(肺病毒)。这些病毒含有RNA基因组。应用细胞致死性副粘病毒科病毒,特别是副粘病毒,如新城疫病毒(“NDV”)和其他禽类副粘病毒如II型禽类副粘病毒,是实践本发明的优选方法。根据本发明,这些病毒的减毒株在肿瘤治疗中特别有用。
根据本发明,NDV是一种特别优选的病毒。根据其对鸡和鸡胚的影响,NDV可分为不同的三型。“低毒力”株又称为lentogenic,是指在最低致死剂量(MLD)下需要90-150小时杀死鸡胚;“中等毒力”株又称为mesogenic,是指在MLD下需要60-90小时杀死鸡胚;“高毒力”株又称为velogenic,是指在MLD下需要40-60小时杀死鸡胚。见如Hanson和Brandly,1955(科学,122156-157);以及Dardiri等,1961(Am.J.Vet.Res.,918-920)。这三型病毒都可应用,优选NDV的中等毒力株,如MK107株,NJ Roakin株和Connecticut-70726株(见实施例21-23)。其他中等毒力株明细单见如Schloer和Hanson,1968(病毒学杂志,240-47)。
为了某种目的,希望通过去除缺陷的干扰颗粒获得克隆病毒以保证或增加某一病毒株的遗传同质性。通过克隆的方法去除缺陷的干扰颗粒可以增加终产物的纯度,该纯度通过每感染颗粒中病毒颗粒的总数(如颗粒数/PFU)来评价。
技术人员可利用任何可行的方法生产克隆病毒。如噬斑纯化法是获得克隆病毒的常规方法。见如Maassab等,Plotkin和Mortimer编辑,疫苗,费城W.B.Saunders公司,1994,781-801页。特别推荐三重噬斑纯化法,该方法在每轮纯化过程中选择一块符合预期特征的平板,如优选的大小、形状、外观或代表亲本株。生产克隆病毒的其他方法可应用本领域技术人员熟知的重组DNA技术。生产克隆病毒的另一种方法是应用限制稀释技术(如将病毒样本稀释液加入含单层易感细胞的微孔板内,并使每孔平均感染病毒颗粒数等于或少于1)。
在本发明的一个优选实施方案中,纯化病毒被用来治疗肿瘤性疾病。下面给出了纯化鸡卵获得性病毒的优选方法(在这些方法的任何步骤中,病毒都没有聚集呈颗粒状)。
纯化方法Aa)生产克隆病毒(如噬斑纯化法)b)用克隆病毒接种鸡卵c)孵育鸡卵d)冷藏鸡卵e)从鸡卵中收获尿囊液f)从尿囊液中去除细胞残留g)用无沉淀超速离心法离心尿囊液(如用不连续蔗糖梯度超速离心法)在本发明的另一个实施方案中,在超速离心之前和(从尿囊液)中去除细胞残留之前,增加了一些步骤,包括●冷冻然后解冻尿囊液●从病毒悬液中去除污染物质(如通过离心的方法)在本发明的另一个实施方案中,超速离心是通过连续层流超速离心法完成的。
本发明的一个实施方案涉及纯化具有复制能力的RNA病毒的方法,包括的步骤a)生产克隆病毒,以及b)通过无沉淀超速离心法纯化所述克隆病毒。
本发明的另一个实施方案涉及纯化副粘病毒(如NDV)的方法,包括应用无沉淀超速离心法纯化病毒。在超速离心之前,可以任选的其他纯化步骤包括a)噬斑纯化生产克隆病毒,b)用克隆病毒接种鸡卵,
c)孵育鸡卵,d)冷藏鸡卵,e)从鸡卵中收获尿囊液,以及f)从尿囊液中去除细胞残留。
本发明的另一个实施方案涉及从鸡卵或细胞培养液中纯化具有复制能力的克隆病毒的方法,包括超速离心的步骤,但不包括产生病毒沉淀颗粒的步骤(实施例31)。
本发明的另一个实施方案涉及纯化副粘病毒(如NDV)的方法,包括应用连续切线层流过滤法(TFF)纯化病毒。还可任选另外的凝胶渗透层析纯化病毒,其中,所述每一步骤均在稳定缓冲液的存在下完成(实施例15)a)噬斑纯化生产克隆病毒,b)用克隆病毒接种鸡卵,c)孵育鸡卵,d)冷藏鸡卵,e)从鸡卵中收获尿囊液并用缓冲液稀释尿囊液,f)通过TFF从尿囊液中去除细胞残留g)通过TFF纯化病毒h)通过凝胶渗透层析纯化病毒通过凝胶渗透层析收获的病毒还可任选应用TFF浓缩。
本发明的另一个实施方案涉及从鸡卵或细胞培养液中纯化具有复制能力的克隆病毒的方法,包括应用连续切线层流过滤法(TFF)纯化病毒,之后任选凝胶渗透层析,层析后也可任选TFF浓缩病毒。
克隆病毒应用这些方法可以将克隆病毒包括副粘病毒(如NDV)纯化至至少2×109PFU/mg蛋白质,优选至少3×109PFU/mg蛋白质,更优选至少5×109PFU/mg蛋白质,更优选至少1.0×1010PFU/mg蛋白质,更优选至少2.0×1010PFU/mg蛋白质,更优选至少3×1010PFU/mg蛋白质,更优选至少4×1010PFU/mg蛋白质,更优选至少5×1010PFU/mg蛋白质,最优选至少6×1010PFU/mg蛋白质。
应用这些方法可以将克隆病毒包括副粘病毒(如NDV)纯化至某一水平,在该水平,每PFU病毒颗粒数少于10,更优选少于5,更优选少于3,更优选少于2,最优选少于1.2。(每PFU病毒颗粒数低代表纯度高)。
RNA病毒在另一个实施方案中,这些方法可以纯化(至上述克隆病毒水平)RNA病毒包括(a)细胞致死性RNA病毒;(b)未分段、无包膜的单链RNA病毒;(c)有片段、有包膜的单链RNA病毒;(d)有片段、无包膜的双链RNA病毒;(e)以及未分段、有包膜的单链RNA病毒(如副粘病毒(如NDV)以及如逆转录病毒)
DNA病毒在另一个实施方案中,这些方法可以纯化(至上述克隆病毒水平)干扰素敏感性细胞致死性病毒,所述病毒选自(a)有包膜的双链DNA病毒(包括痘病毒);(b)无包膜的单链DNA病毒;以及(c)无包膜的双链DNA病毒。
鸡卵获得性病毒在另一个实施方案中,这些方法可以将鸡卵获得性病毒纯化至基本不含污染鸡卵蛋白的水平。在人类治疗性应用的病毒制剂中,优选限制鸡卵蛋白量,因为大部分鸡卵蛋白如卵白蛋白是致敏原。
× × × ×表1显示了用于治疗包括癌症在内的肿瘤性疾病的病毒。在“Murphy A和Kingsbury DW,1990,病毒学,第2版(Ed.Fields,B.N.),Raven出版社,纽约”中可以发现其他病毒科成员的实例,在此全文引入。任选这些病毒筛查自然发生的变异(特定病毒株和分离株),所述变异导致变异病毒株与亲本病毒株在干扰素产生方面不同。
在本发明另一个实施方案中,对无论自然发生还是工程学生产的备选病毒,在肿瘤治疗方面,均进行了治疗能力的检测。在一个实施方案中,比较了杀伤50%干扰素介导的抗病毒应答缺陷性细胞,如头颈部肿瘤细胞KB所需的备选病毒量和杀伤50%相同数量的具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞,如正常皮肤成纤维细胞所需的病毒量。杀伤量可以应用包括台盼兰排除法或MTT试验的任一方法进行定量(见实施例1)。杀伤干扰素介导的抗病毒应答缺陷性细胞所需病毒量较杀伤具有干扰素介导的抗病毒应答能力的细胞所需病毒量显著减少(如至少5倍),说明受检病毒具有肿瘤治疗所需的治疗能力。其他NDV病毒和新培斯病毒就是具有肿瘤选择性杀伤能力的自然发生的病毒(见实施例21-23,和25)。
表1.用于癌症治疗的自然发生的病毒
了解在抗病毒状态建立时涉及的因子可以创建筛查可能对病毒治疗发生反应的肿瘤的方法。原则上,可以筛查通过活检获得的患者肿瘤组织p68激酶、p58或其他与抗病毒状态或细胞分化调节有关的因子的表达。其他因子包括但不限于干扰素反应因子-1(IRF-1),干扰素刺激基因因子-3(ISGF-3),c-Myc,c-Myb和干扰素受体。如果c-Myc,c-Myb或p58高水平表达,表示肿瘤组织或细胞可备选用于病毒治疗。如果,IRF-1,ISGF-3和干扰素受体低水平表达,表示肿瘤组织或细胞可备选用于病毒治疗。
至少30%的人类肿瘤具有激活的Ras表型特征(Bos,J.L.,1989,癌症研究,494682)。Ras表型的激活可由于下述原因导致,i)突变激活Ras蛋白表达,ii)野生型Ras蛋白高表达,或iii)酪氨酸激酶受体或其他Ras信号途径成员如Grb2或Sos不受调控的表达。具有激活Ras表型的细胞较没有激活Ras表型的相同细胞,对NDV(Lorence,R.M.等,1994,癌症研究,546017-6021)和呼肠病毒(Strong,J.E.S.等,1998,EMBO,173351-3362)的杀伤更加敏感。激活的Ras业已显示可以抑制干扰素诱导的反应基因(Zullo,J.N.和Faller,D.V.,1988,分子细胞生物学,85080-5085)和dsRNA诱导的PKR活化(Mundschau,L.J.和Faller,D.V.,1992,生物化学杂志,26723092-23098)。设定PKR在干扰素介导的抗病毒应答的诱导过程中起关键作用,具有激活Ras表型的细胞对NDV和呼肠病毒的杀伤敏感性增强,这一事实为利用本发明病毒选择性杀伤干扰素介导的抗病毒应答缺陷性细胞提供了更多的证据。
通过活检获得的患者肿瘤组织可用来筛查i)激活的Ras蛋白,ii)Ras的GTP结合片段(活性形式),iii)MAPK的活性形式(如ERK1或ERK2),或其他Ras途径激活指示物质的表达。患者标本激活Ras表型的存在提示肿瘤组织可备选病毒治疗。
本发明的另一个实施方案,将活检获得的患者原代肿瘤组织或细胞培养扩增,然后测定对适宜病毒疗法的杀伤敏感性。在一个实施方案中,如上述,比较了杀伤50%肿瘤组织培养细胞所需的病毒量和杀伤50%正常培养细胞所需的病毒量,用以筛选备选病毒。肿瘤细胞对病毒制剂的杀伤敏感性较正常细胞高10倍或以上,说明该肿瘤细胞对病毒治疗的细胞致死性效应特别敏感。在本发明的一个进一步实施方案中,还测定了靶肿瘤细胞对内源性或外源添加的干扰素(应用α或β干扰素,如10单位/ml,见实施例27)的反应能力,测定方法是在干扰素存在的情况下,进行上述筛选。
理解病毒粘附或进入所需的细胞受体,可以进一步筛查受体高表达从而对干扰素敏感性病毒更加敏感的肿瘤。这是对可能对病毒治疗有反应的患者进行的另一水平筛查。优选应用干扰素敏感性病毒进行治疗,患者的肿瘤可能对干扰素有耐药性,同时高表达病毒的细胞受体。原则上,患者的血清、肿瘤细胞、组织或组织切片均应通过免疫试验或免疫染色的方法筛查血清、肿瘤细胞或肿瘤组织上的病毒受体量。例如,新培斯病毒就是通过高亲和力的层粘连蛋白受体感染哺乳动物细胞(Wang等,1992,病毒学杂志,664992-5001)。现已得知,这种受体在多种转移癌上大量表达。这种高亲和力的层粘连蛋白受体mRNA在胰腺癌细胞系Panc-1和结肠腺癌细胞系SW620上表达水平很高(Campo等,1992,美国病理学杂志,141107301983;Yow等,(1988)Proc.Natl Acad Sci,85,6394-6398),而且这两种细胞对新培斯病毒表达高度敏感(实施例25)。相反,直肠腺癌细胞系SW1463表达的高亲和力层粘连蛋白受体mRNA水平很低(Yow等,(1988)Proc.Natl Acad Sci,85,6394-6398),对PPSINDBIS-Ar339的杀伤耐受性较SW620细胞高4个数量级。
筛查或工程学合成了在正常细胞中对干扰素反应不同(如,优选对干扰素反应增强)的现存NDV,或其他病毒,包括RNA和DNA病毒。除了具有对干扰素很强的反应能力,还筛查了其他病毒特征,或通过工程学手段,将其他病毒特征给予病毒。受体特异性发生改变(如新培斯病毒PPSINDBIS-Ar339,见实施例25)或神经毒性降低的病毒也包括在本发明内(如NDV病毒PPNJROAKIN,见实施例24)。本发明优选具有通过细胞直接接触进行传播能力的病毒。
这里描述的本发明包括很宽泛的病毒类型(见表1),所述病毒通过与NDV很相似的方式用于肿瘤治疗。另外,由于在正常细胞中抑制干扰素反应的机制存在,一些不宜应用的天然病毒可以任选工程学手段来规避上述限制。如果不经修饰,具有抑制干扰素反应机制的病毒对正常细胞的毒性较那些去除了该机制的病毒大。本发明提供(1)易于操作的载体的研发;以及(2)创建一系列治疗病毒。操作包括添加干扰素基因,使病毒转基因表达干扰素或其他干扰素反应途径激活因子。其他的改变还包括利用工程学手段表达前药激活酶,如疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷激酶或胞嘧啶脱胺酶(Blaese RM等,1994,欧洲癌症杂志,30A1190-1193),以及表达适宜的标记抗原,使免疫系统可以瞄准肿瘤细胞。另外的改变包括应用工程学手段使之表达靶细胞携带的这些受体的配体如,一些病毒感染靶细胞,就表达这些病毒的受体(见Mebastsion等,1997,细胞,90841-847;以及Schnell MJ等,1997,细胞,90849-857)
除了上述的一种新城疫病毒,还有几种新城疫病毒株显示可以选择性杀伤肿瘤细胞。在应用第二株中等毒力的新城疫病毒进行差异细胞毒试验中发现,对该病毒的杀伤,肿瘤细胞较正常细胞敏感3个数量级(实施例21)。另外,在应用第三株中等毒力的新城疫病毒进行差异细胞毒试验中发现,对该病毒的杀伤,肿瘤细胞较正常细胞敏感80-5000倍(实施例22)。将这两种中等毒力的新城疫病毒直接给予携带人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠肿瘤瘤体后,可导致肿瘤生长消退(实施例23)。
在分离的实验中,通过给具有免疫能力的无胸腺小鼠脑内接种,分别研究了这三种不同新城疫病毒的安全性。研究结果显示,具有完整免疫系统的小鼠可以很好地耐受这三种病毒。无胸腺小鼠脑内接种揭示,其中一种病毒的耐受性显著优于其他两种(实施例24)。这些结果显示,在单一的病毒科中,可以存在病毒特性的重要差异,并可在治疗方面开发,使其具有更好的疗效和更高的安全性。
应用溶瘤细胞性病毒治疗后,另一种提高疗效、减低毒性的方法是使用干扰素敏感性病毒,这需要肿瘤细胞优选表达特定的细胞表面受体。Sinbdis病毒为这种限制提供了一个实例。新培斯病毒通过高亲和力层粘连蛋白受体哺乳动物细胞(Wang等,(1992)病毒学杂志,664992-5001)。在差异细胞毒试验中,当正常细胞和肿瘤细胞同时感染新培斯病毒时发现,致瘤性和表达高亲和力层粘连蛋白受体的细胞对该病毒的杀伤较其他细胞更敏感(实施例25)。在该试验中,表达高亲和力层粘连蛋白受体的正常角化细胞(Hand等,(1985)癌症研究,452713-2719)对新培斯病毒的杀伤具有耐受性。而且,对正常角化细胞和两种不同肿瘤细胞系的干扰素敏感性和层粘连蛋白受体表达水平的分析发现,PPSINDBIS-Ar339选择性杀伤肿瘤细胞,所述肿瘤细胞i)对干扰素介导的抗病毒应答有缺陷,并且ii)表达高亲和力层粘连蛋白受体。
在皮下携带腺癌细胞SW620的无胸腺小鼠的体内试验发现,PPSINDBIS-Ar339具有很强的肿瘤生长抑制作用(实施例32)。
疱疹性口炎病毒(VSV)为溶瘤细胞性病毒选择性杀伤肿瘤的一般假说提供了证据,该假说是指肿瘤细胞对干扰素反应的固有性缺陷致使这些细胞对具有复制能力的干扰素敏感性病毒的杀伤作用敏感。在有外源性干扰素存在的情况下,应用VSV感染人非致瘤性细胞WISH和致瘤性细胞HT1080或KB,结果致瘤性细胞被选择性杀伤(实施例26)。其他证据在实施例33中提供。在该实施例中,两种不相关病毒在感染肿瘤细胞系是,表现了基本相同的行为。该细胞系对这两种病毒的相似反应显示,这两种不相关病毒在该肿瘤细胞系中的生长受相似机制的控制。
下面列出了病毒明细单,这些病毒经除去自然发生的抗干扰素活性修饰后,可用于病毒癌症治疗(见表2)。内源性抗干扰素活性被摧毁或减弱的修饰病毒(优选但非必须,除抗干扰素外还有减毒修饰,见表3)可用于癌症治疗。该明细列表包括但不限于下述病毒。由于同一类型的病毒间具有相似性,下面列出的每种特定病毒已经鉴定的机制,也存在于该类病毒的其他成员中,表现为相同或功能类似的机制。更宽泛的病毒组在圆括号内添加。通过任何方法,包括自然发生的突变,以及应用工程学手段去除或点突变获得的如下具有抗干扰素活性功能丧失的病毒,可用于本发明的方法。
特别优选自然发生或通过工程学手段获得的较野生型病毒生长率生长缓慢的分离病毒株,因为病毒生长缓慢,可以在病毒复制杀伤细胞或细胞群之前,使具有干扰素反应能力的细胞或细胞群建立有效的抗病毒状态。
本发明还包括,作为病毒特征的特定改变,病毒抗干扰素活性无能导致感染细胞干扰素反应的增强,但病毒仍可在肿瘤细胞中复制。
表2显示了应用工程学手段去除抗干扰素活性的现存病毒。
表3列举了应用工程学手段使毒性减弱的病毒。
表2.应用工程学手段去除抗干扰素活性的现存病毒
表3.筛选病毒中目前所知的减毒突变
肿瘤治疗本发明涉及肿瘤的病毒治疗,特别是患有癌症的动物。在一个优选实施方案中,本发明涉及最大径测量大小≥1厘米(cm)的肿瘤的治疗。肿瘤应用的“1cm肿瘤”是指肿瘤至少一个径的长度为1cm。这种肿瘤对病毒治疗较预期更加敏感,较之更小的肿瘤,如果对病毒不是更加敏感,通常也与之相同。本发明更优选的一个方面,是治疗超过1cm的肿瘤,如≥2cm的肿瘤,2-5cm的肿瘤,以及超过5cm的肿瘤。
本发明还可用来治疗肿瘤负荷高的宿主。这里应用的词组“肿瘤负荷”是指机体内肿瘤的总量,用体重的百分比表示。对于肿瘤负荷约为总体重1%-2%的宿主,病毒治疗惊人的有效,如导致肿瘤消退或肿瘤总负荷的降低。这一点原来根本没有想到,因为肿瘤负荷约为总体重2%(如一个60公斤的人将有一个1公斤的肿瘤),几乎是生命可以承受的最大瘤体。见如Cotran等,罗宾逊疾病病理学基础,第4版,WB Saunders,1989,252页。在实施例中,携带体积高达397mm3黑色素瘤(如A375)的小鼠宿主,在用新城疫病毒(如经三重噬斑纯化的病毒)治疗后,显示了完全消退反应。设定1000mm3的组织重量相当于1克,体积为397mm3的肿瘤大约相对于一只20克小鼠总体重的2%。
如下实施例4-9所示,大小至少1cm的肿瘤治疗后获得了消退,而未治疗的对照动物却在数周内死于肿瘤。但是,尽管两周内就会死亡,这些患病动物还是得到成功救治。因此,根据本发明,一个处于肿瘤终末期的动物可以应用病毒疗法有效治疗。因而,本发明可被用来治疗对传统疗法无反应的患者,所述传统疗法如化疗,如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶,和放疗。
还检测了NDV通过腹膜内给药治疗肿瘤的疗效。应用卵巢癌的腹水预防模型,给携带ES-2人卵巢癌的小鼠腹膜内注射NDV,结果发现,较之用生理盐水治疗的小鼠,生存率提高(实施例16)。当ES-2细胞用于腹水阳性模型,应用病毒治疗的动物较之生理盐水处理的对照组,腹水产量明显减少(实施例17)。
在本发明的另一个实施方案中,应用病毒导致1)肿瘤相关性症状的缓解,如但不限于腹水生产率的降低,疼痛的缓解,以及梗阻性疾病的缓解,和2)生命的延长。
52名患者通过静脉途径接受了噬斑纯化的NDV分离病毒株。肿瘤反应包括5名患者中独立肿瘤的消退;2名患者病情稳定7个月,2名患者5个月,在1名以上的患者中,在3个月时疾病继续发展;疼痛治疗减少(实施例20)。
给药方法和制剂在本发明的一个实施方案中,体外筛查肿瘤细胞或组织以鉴定这些肿瘤患者对病毒治疗是否敏感。从患者患处取出的肿瘤细胞(提取细胞的方法,如实体瘤的细针穿刺或卵巢腹水肿瘤的腹水穿刺法)体外生长并与病毒共同孵育。在本发明的该实施方案中,如果病毒对肿瘤细胞有高活性,这些患者就入选治疗。
在本发明的一个优选实施方案中,给予的病毒量导致肿瘤或多个肿瘤的消退。这里应用的术语“消退”是指肿瘤萎缩,如大小、重量或体积。肿瘤大小的萎缩可用多种方法测定,包括体检,胸片或其他x线检查,超声,CT扫描,MRI或放射性核苷扫描。
根据本发明,包括癌症在内的多种类型的肿瘤都是可以治疗的。本发明的病毒可用于治疗多种癌症,包括但不限于肺癌,乳腺癌,前列腺癌,结肠腺癌,宫颈癌,子宫内膜癌,卵巢癌,膀胱癌,Wilm肿瘤,纤维细胞肉瘤,骨肉瘤,黑色素瘤,恶性滑膜瘤,成神经细胞瘤,淋巴瘤,白血病,脑癌包括成胶质细胞瘤,神经内分泌肿瘤,肾癌,头颈部肿瘤,胃癌,食管癌,女性外阴肿瘤,肉瘤,皮肤癌,甲状腺胰腺癌,以及间皮瘤。本发明病毒还可用于治疗多种良性肿瘤,包括但不限于湿疣,乳头瘤,脑脊膜瘤以及腺瘤。
将治疗有效剂量的病毒给予肿瘤宿主。本领域的技术人员应当理解,给予病毒的剂量由于以下因素而有差异,这些因素包括所选的病毒,肿瘤的类型,肿瘤细胞的生长范围或转移,肿瘤生长的生物位置或机体屏障,病毒株,给药途径,给药时间,给药方式,并鉴定哺乳动物正在接受的其他药物或治疗,如放疗、化疗或手术治疗。这些参数通过最大耐受剂量(MTD)定义,MTD是通过动物模型测定的,并通过相对体表面积或体重功能换算出人用剂量。还应理解,在某些特定情况下,病毒给药会超过1次。病毒多剂量给药的最适间隔时间属于本领域已经掌握的技术,可根据经验决定。NDV通常的给药剂量约为3×106-5×1012PFU病毒。对于局部给药(如直接注入瘤体),典型应用总量至少为3×106PFU,更优选至少3×107PFU,更优选至少3×108PFU,更优选至少3×109PFU,更优选至少3×1010PFU,更优选至少3×1011PFU,最优选至少5×1012PFU。对于系统给药,应用剂量至少为1×108PFU病毒/m2体表面积,更优选至少为1×109PFU病毒/m2体表面积,更优选至少为5.9×109PFU病毒/m2体表面积,更优选至少为1.2×1010PFU病毒/m2体表面积,更优选至少为4.8×1010PFU病毒/m2体表面积,更优选至少为7.2×1010PFU病毒/m2体表面积,更优选至少为9.6×1010PFU病毒/m2体表面积,最优选至少为3.0×1011PFU病毒/m2体表面积。
对于静脉内给药,给药剂量时间可应用每周一次,每周两次或每周三次。根据本发明的病毒,任选与化疗药物共同应用时,可通过多种途径给药,如经肠道,不经肠道,口服,鼻腔,直肠,胸腔内,静脉内(如应用导管),皮下,肿瘤瘤体内(如直接给予肿瘤组织或给予供血血管),围肿瘤,局部,舌下,口腔,局部外用,肌内,吸入给药,经皮,阴道,动脉内,颅内,皮内,硬脑膜外,系统,局部外用,腹膜内,胸膜内,囊内(膀胱癌)等。对于肺癌,可以应用支气管途径(如支气管给药),皮内途径,或内镜途径。在适宜的情况下,还可应用内镜注射治疗胃肠道肿瘤,以及栓剂治疗直肠肿瘤。
NDV鼠毒性研究显示静脉内给予病毒后的急性毒性反应与细胞因子介导的反应非常相似。众所周知,在首次诱导事件之后,细胞因子对重复刺激的反应下调,或脱敏(Takahashi等,(1991)癌症研究,512366-2372)。接受脱敏剂量病毒的小鼠,较接受生理盐水处理的对照小鼠,可以更好地耐受随后给予的大剂量病毒(实施例18)。接受静脉内注射脱敏剂量病毒的小鼠,较在第一次注射时仅接受介质的小鼠,在接受第二次静脉内给药时,可以多耐受大约10倍的病毒。
病毒静脉途径给药的速率可以显著影响其毒性。给两组无胸腺小鼠静脉注射相同剂量的NDV,一组给药较慢(4分钟0.2ml),一组较快(30秒0.2ml)。比较两组体重减轻最大值发现,缓慢注射组体重减轻较快速注射组少50%(实施例19)。
在临床试验中,患者在一周内接受3次噬斑纯化NDV分离株注射。在这种情况下,首剂脱敏治疗减轻了第二和第三剂相关性毒性,甚至在第二和第三剂比首剂剂量高2-8倍时(实施例20)。实施例18和28显示了这些数据以及在动物研究中获得的相似数据。在临床试验中还进一步发现,在应用小剂量脱敏从而可以应用更高剂量治疗时,肿瘤的消退率也更高(见表19,实施例20)。这与在动物模型试验中获得的数据一致(实施例29)。
应用溶瘤细胞性病毒治疗肿瘤的一个令人关注的问题是体液免疫反应的潜在抑制可能对治疗有所影响。在临床研究中,1个月后仍显示疾病稳定的患者可以进行第二疗程的治疗。因此,第二以及随后疗程的治疗是在存在NDV中和抗体的情况下进行的。但是,在第二疗程给药后,可以在患者的尿中发现感染病毒,并在第二疗程后观察到肿瘤消退,这些现象提供了给予大剂量病毒可以克服中和抗体的作用,并在患者体内发生感染的证据(实施例20)。在本发明的一个优选实施方案中,给予了多疗程病毒治疗。一个疗程的实例包括给予病毒每周3次,共1周,随后休息3周;给予病毒每周3次,共4周,随后休息2周;给予病毒1剂,随后休息4周;给予病毒每周3次,共6周,随后休息2周。在另一个实施方案中,在给予首剂病毒后,给药病毒2周以上。
在本发明的一个优选实施方案中,在随后给予高剂量之前,先给予一剂脱敏剂。脱敏剂量水平可通过临床毒性指征如低血压、疲劳、肝脏转氨酶升高或其他适宜指标来决定,其中脱敏剂量水平等于或低于单次给药的最大耐受剂量(MTD)。脱敏之后,再给予高于脱敏剂量的病毒。在一个优选实施方案中,随后的病毒剂量等于或大于单次给药的MTD。例如,应用的脱敏剂量至少为1×108PFU/m2,更优选至少3×108PFU/m2,更优选至少1×109PFU/m2,更优选至少5.9×109PFU/m2,最优选至少1.2×1010PFU/m2。脱敏后,应用的再次给予的病毒剂量至少为1×108PFU/m2,更优选至少3×108PFU/m2,更优选至少1×109PFU/m2,更优选至少5.9×109PFU/m2,更优选至少2.4×1010PFU/m2,更优选至少4.8×1010PFU/m2,更优选至少9.6×1010PFU/m2,最优选至少3.0×1011PFU/m2。在另一个实施方案中,脱敏还单独或联合应用了α肿瘤坏死因子,IL-2或其他细胞因子。
给药剂量之间的时间框架包括脱敏剂量和下一次给药之间的时间框架为1-14天,优选1-7天。脱敏剂量可通过多种途径给药,如静脉内,经肠道,不经肠道,口服,鼻腔,直肠,胸腔内,静脉内,皮下,肿瘤瘤体内,围肿瘤,局部,舌下,口腔,局部外用,肌内,吸入给药,皮内,阴道,动脉内,颅内,皮内,硬脑膜外,系统,局部外用,腹膜内,胸膜内,内镜,支气管内等。随后的剂量可通过与脱敏剂量相同的途径给药,或通过任一途径给药,如静脉内,经肠道,不经肠道,口服,鼻腔,直肠,胸腔内,静脉内,皮下,肿瘤瘤体内,围肿瘤,局部,舌下,口腔,局部外用,肌内,吸入给药,皮内,阴道,动脉内,颅内,皮内,硬脑膜外,系统,局部外用,腹膜内,胸膜内,内镜,支气管内等。实施例28显示了应用静脉注射给予脱敏剂,应用其他途径给予随后的剂量。静脉注射脱敏剂量病毒的小鼠较之在第一次注射时仅接受介质的小鼠,在腹膜内给予第二剂量时,可多耐受大约5倍的病毒。
实施例29描述了在临床预试验中,应用脱敏方法可以增加最大耐受剂量,从而使抗肿瘤疗效增加。
任选的,可以序贯或同时应用一种以上的给药途径。同时或序贯给药的途径包括但不限于静脉内,经肠道,不经肠道,口服,鼻腔,直肠,胸腔内,静脉内,皮下,肿瘤瘤体内,围肿瘤,局部,舌下,口腔,局部外用,肌内,吸入给药,皮内,阴道,动脉内,颅内,皮内,硬脑膜外,系统,局部外用,腹膜内,胸膜内,内镜,支气管内等。一个实例就是静脉内给药脱敏剂量,最后腹膜内给予另一剂量。
在本发明的另一个优选实施方案中,病毒通过缓慢注入的方式给予,包括应用静脉泵,泵式注射器,静脉点滴或缓慢注射,注射时程4分钟-24小时,优选20-60分钟。
一种病毒可与任选的一种或多种化疗药物同时注射、分开多次注射或连续注射。病毒可与化疗药(如但不限于白消安,环磷酰胺,氨甲蝶呤,阿糖胞苷,争光霉素,铂复合物如卡铂或顺铂,阿霉素,氮烯咪胺,gemcitabine,马法兰,巯基嘌呤,长春碱,5-氟尿嘧啶,taxol,和维甲酸)同时、或在化疗药注射之前或之后注射。根据本发明的病毒还可任选与其他治疗联合,包括手术治疗、放疗、化疗(见如,现代医学诊断与治疗,Tierney等编辑,Appleton & Lange,1997,特别是78-94页)、以及生物治疗。病毒可以在给予生物物质之前、同时或之后给予,所述生物物质如(1)其他溶瘤细胞制剂如但不限于其中一个基因在前列腺细胞特异性反应元素转录控制下的腺病毒(见RodriqRes,R.等,1997,癌症研究,572559-2563);不编码能够与p53结合的E1b多肽的腺病毒(见Bischoff,J.R.等,1996,科学,274373-376);不表达γ34.5功能性基因产物的单纯疱疹病毒(见Mineta,T.等,1995,自然医学,1938-943);(2)细胞因子(如但不限于集落刺激因子如GM-CSF,
查看更多专利详情