专利名称：一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐弧菌,广泛的存在于温暖的水体环境中，其在河口、海洋环境里是较常见的致病菌。主要通过污染海产品和感染伤口而感染健康人畜，创伤弧菌能够引起败血症和伤口感染。近年来有由于食用被创伤弧菌污染的海产品而发生胃肠炎的相关报道，主要症状为呕吐、腹泻以及腹部疼痛。由创伤弧菌引起伤口感染的病死率高达50%，由创伤弧菌感染引起败血症的病死率高达75%，尤其是在免疫抑制的病人和体内荷铁量过多的人群中。在腹泻病监测中，常不能从标本中分离到法 定传染病中监测管理的甲类和乙类肠道感染病原菌以及沙门菌等，使得对病原的确认带来困难，其中一个原因是缺乏对其它致腹泻病原菌的有效检测手段，并且，随着近年海产品食用量的增加、由创伤弧菌引起病例增加以及创伤弧菌感染的高病死率，迅速建立一种能够快速检测创伤弧菌的方法显得至关重要。创伤弧菌的常规检测方法有分离培养、生化鉴定以及核酸杂交。随着分子生物学技术的发展，PCR技术以及荧光PCR技术已经被广泛的应用于病原菌的检测。有许多研究介绍了借助常规PCR和(或)实时PCR检测能够作为创伤弧菌生物标记的溶血素基因(V. vulnificus hemolysin A, vvhA)来鉴定创伤弧菌的方法。如 Mark S. Campbell 根据创伤弧菌溶血素基因(vvhA)建立了基于SYBR Green的实时PCR检测方法，但该方法需要借助溶解曲线来区分特异性扩增和非特异性扩增，特异性不高。
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、省时、特异性好、灵敏度高的利用TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法。为实现上述目的，本发明一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法，该非诊断性方法包括以创伤弧菌溶血素WhA基因的DNA序列作为靶序列，比对后选取保守区域，确定vvhA基因的保守序列tgggtatttg ataagacgaa gttcaaccca atctcttatt ccaacttcaa accgaactatgacgttttgt acgaagcgcc tgtgtctgaa actggcgtaa cggatttcga gatgggcgtgaaactcaact atcgtgcacg ctttggtacg gtaatccctt cagcactctt ctcagtttatggttctgcgg gctcgtcaac caacagcagt accgtgaaac aacgtattcg catcgactggaatcatccac tgtttgaagc ggaagcacac gttacactac aatcactgag caacaacgatctctgcctag atgtttatgg tgagaacggt gacaaaacgg ttgcgggtgg ttcggttaacggctggagct gtcacggcag ttggaaccaa gtttggggcc tagataaaga agaacgttaccgtagccgag tggcatccga tcgttgtttg accgtaaacg cagacaaaac gctcacagtcgaacagtgtg gtgcgaactt agcacagaaa tggtattggg aa ；设计创伤弧菌实时PCR引物和探针本发明公开了一种TaqMan探针荧光RT-PCR检测创伤弧菌的非诊断性方法，以创伤弧菌溶血素vvhA基因的DNA序列作为靶序列，比对后选取保守区域，确定vvhA基因的保守序列，设计创伤弧菌实时PCR引物和探针，创伤弧菌实时PCR检测方法利用特异性荧光探针，实行完全闭管式操作，大大减少了扩增产物污染的机会、减少了实验步骤、实验时间和对试剂的消耗，不同于常规PCR，无需电泳鉴定，不易污染环境出现假阳性结果，该方法能快速地检测到致病菌，具有很高的灵敏度、特异度和检测下限，可以用于国境口岸环境水体、水产品以及腹泻病人粪便中创伤弧菌的检测，有很高的应用价值。