专利名称：兔膝关节软骨单位体外酶解消化获取的实验方法在组织工程化软骨体外构建过程中，理想种子细胞的选择最为关键，也是目前研 究的难点。目前，国内外文献报道中，最为常用的关节软骨组织工程的种子细胞为软骨细 胞。其体外常规酶解消化方法为0. 4% Pronase酶按12mLDMEM_F12培养液/g软骨37°C 消化90分钟，更换培养液后，0.025% II型胶原酶过夜消化，获取膝关节软骨细胞。但软骨 细胞体外培养及传代过程中，黏弹性逐渐降低，脆性增加，软骨细胞功能退变比较快，体内 修复软骨缺损过程中形不成符合正常软骨特性的透明软骨组织，成为制约组织工程技术发 展的最大障碍之一。软骨单位(Chondron)作为近年来才逐渐重视的关节软骨功能结构，由细胞周基 质及包裹在一个或几个软骨细胞共同构成，其在软骨细胞代谢及力学环境维持方面发挥了 重要作用。我们试图建立一种实验方法，将兔膝关节软骨单位体外完整消化、分离及培养， 为组织工程化软骨的构建提供一种新种子细胞的选择。
本发明目的在于针对现有以软骨细胞为组织工程化软骨种子细胞的不足，提出一 种新的关节软骨组织工程的种子细胞——软骨单位(Chondron)的体外获取方法。具体是 以兔膝关节软骨为实验对象，建立其体外酶解消化获取软骨软骨单位的实验方法。本发明采用如下的技术方案实现兔膝关节软骨单位体外酶解消化获取的实验方法，其步骤如下(1)、无菌条件下留取兔膝关节，在超净工作台内将膝关节打开，刮取膝关节股骨 和胫骨平台全层软骨，将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗，弃上清，称重， 放置于无菌锥形瓶备用；(2)、采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥 形瓶内，即每克软骨加入DMEM-F12培养液12mL，DMEM-F12培养液中含有质量/体积浓度为 0. 3%的dispase酶和质量/体积浓度为0. 2%的II型胶原酶，上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解，经过0. 22 μ m —次性过滤器过滤、 除菌，加入培养液的锥形瓶放置于37°C 5% CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进行 联合酶解搅拌消化3h，形成消化悬液；(3)、将上述消化悬液用10(^111细胞筛网过滤于离心管中，1200印111离心51^11，弃 上清，然后IOmL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次，加入原代软骨细胞培养液10mL， 原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清lmL，制成无菌的软骨单位悬液。本发明建立了系统的兔膝关节软骨单位体外酶解消化的实验方法，相对现有技术 具有如下有益效果(1)利用dispase酶和II型胶原酶联合酶解搅拌消化3小时可以体外成功获取兔 膝关节软骨单位，获取方法简单，重复性好。(2)酶解消化获得的软骨单位包括完整的细胞周基质及包裹在内的一个或几个软 骨细胞，使得软骨细胞在体外培养及构建组织工程化软骨过程中更加符合软骨细胞在体内 的生长环境及生物学特性。(3)通过微管吸吮生物力学实验发现，急性消化软骨单位平衡模 量(1.573 士 0. 151kPa)、瞬时模量(6.850 士 0.607kPa)以及黏弹性指数 (13.423±1.027kPa*S)明显高于单纯软骨细胞平衡模量(0. 370士0. 013kPa)、瞬时模量 (0.672士0.015kPa)以及黏弹性指数(6. 293士0. 134kPa 。说明关节软骨单位较单纯细 胞相比生物力学特性明显提高，改善了软骨细胞作为种子细胞生物力学特性较差的缺点。本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域，具体涉及一种兔膝关节软骨单位体外酶解消化获取的实验方法。其步骤如下留取兔膝关节，将关节软骨反复剪成碎片组织，冲洗，弃上清，放置于无菌锥形瓶备用；采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，搅拌，消化，形成消化悬液；将消化悬液过滤、离心，加入原代软骨细胞培养液，制成无菌的软骨单位悬液。本发明的有益效果获取方法简单，重复性好；更加符合软骨细胞在体内的生长环境及生物学特性；软骨单位较单纯细胞相比生物力学特性明显提高，改善了软骨细胞作为种子细胞生物力学特性较差的缺点。