一种软骨组织工程用多孔支架及其制备方法【技术领域】[0001]本发明涉及生物医用材料【技术领域】，具体地说是一种组织工程用多孔支架及其制备方法。[0002]卡拉胶(carrageenan),又名角叉菜胶,是从红藻中提取的天然阴离子多糖植物胶体。其根据结构类型的不同，可分为K型卡拉胶、t型卡拉胶及λ型卡拉胶等，以K型卡拉胶的凝固性最好。卡拉胶为白色至淡黄褐色、表面有光泽、半透明片状体或粉末状物，无臭无味，口感粘滑，在冷水中膨胀，可溶于60°C以上的热水后形成粘性透明或轻微乳白色的易流动溶液，不溶于有机溶剂。卡拉胶易凝胶，具有热可逆性，加热溶解后，放冷时能形成半固体透明的凝胶。由于其残基上的半酯式硫酸盐基团带有负电荷，使得其可以在钾、铵、钙、钠等阳离子的诱导下形成双螺旋结构的超分子束，从而大大地提高其凝胶强度。在微量氯化钾(0.1%)存在下，即可提高3倍的凝胶强度，但过高的凝胶强度会造成凝胶过脆。0.5%的碳酸钠存在可以提高卡拉胶70%的凝胶强度，且能够降低卡拉胶透明度、增强硬度。卡拉胶稳定性强，在中性和碱性溶液中加热也不会水解，但在酸性溶液中(尤其PH < 4.0)，卡拉胶易发生酸水解，凝胶强度和粘度下降。卡拉胶的这种独特性质使其作为增稠剂、胶凝剂、悬浮剂、乳化剂和稳定剂等而被广泛应用于食品工业、化学工业及生化、医学研究等领域中。此外，卡拉胶及其衍生物还被被证实具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗凝血、增强免疫力及抗病毒等。卡拉胶的应用前景十分可观。 [0003]壳聚糖(chitosan)即脱乙酰基甲壳素，别名甲壳胺，是由甲壳素脱乙酰化制得的天然活性物质，广泛存在于虾蟹壳、昆虫等动物体内。壳聚糖是白色或淡黄色粉粒，性质稳定，不溶于水和碱溶液，可溶于稀酸。在酸性环境下，其侧链氨基会结合质子而带正电荷。壳聚糖具有很好的成膜性、生物相容性和生物活性，无毒、无害、无免疫抗原性，对人体具有强化免疫、抑制细菌、促进疾病痊愈、调节生理机能等功能。壳聚糖可制成膜应用于水果保鲜膜等方面；还可以作为絮凝剂、纤维、液晶、催化剂、吸附剂以及应用于医药方面；在食品工业中，可作为抗菌剂、食用膜、食品添加剂、污水处理剂、药物缓释剂、酶固定化载体等。其应用前景诱人，当前的研究热点在于其拥有的药物缓释等方面。[0004]组织工程(tissue engineering)是应用生命科学与工程学的原理与技术,在正确认识哺乳动物的正常及病理2种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。组织工程在临床医学上有着诱人的应用前景。现今组织工程研究的核心是建立由细胞、生物材料支架和生长因子所构成的三维复合体。其中，由生物材料所构成的细胞支架的作用是为细胞增殖提供空间，使细胞按照生物材料支架的构型在生长因子的作用下分化、增殖，最终成为所要求的组织或器官，达到修复创伤和重建功能的目的。因此，三维多孔支架的制备是组织工程化人体器官的前提条件。当前，三维支架的常用材料包括天然高分子材料如胶原、明胶、纤维素、甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、氨基葡聚糖、琼脂、脂质体等和无机材料如轻基磷灰石、磷酸钙等。此外，还有一些合成的高分子材料，如胶原与聚乳酸、胶原与羟基磷灰石、壳聚糖与聚羟基酸，胶原和壳聚糖与其他聚合物诸如聚偶磷氮、聚酯尿烷的复合等。不同的材料均有其不同的性质和使用范围，但关于组织细胞培养及软骨组织再生类的很多都用到明胶或胶原作为支架。众所周知，当前的明胶面临着巨大的供应不足的现状，已经出现多起关于劣质明胶流入食品药品市场的安全事件，因此，有必要去探索更多的可用于组织细胞培养及软骨组织再生类的三维多孔支架材料。关于三维多孔支架材料的制备技术，当前有微球烧结法、溶液浇铸/粒子浙滤法、热致相分离/冷冻干燥法、静电纺丝法、超临界流体制备方法等。比较传统的微球烧结法致孔率低下；溶液浇铸/粒子浙滤法容易造成溶剂残留，挥发的溶剂也不够环保；热致相分离/冷冻干燥法在控制孔隙率和孔径上不够准确；静电纺丝法、超临界流体制备方法等高技术方法在未来的确拥有较大前景，但其当前的成本太高，大规模使用仍不现实。[0005]卡拉胶-壳聚糖的交联复合已经被多位学者的研究证实，有些还制备了卡拉胶-壳聚糖微丸，但将卡拉胶-壳聚糖的交联复合物作为三维多孔支架仍然存在许多问题，如卡拉胶硬度不强、凝胶孔隙率不高、孔径难以控制等。
[0006]为了解决以上现有技术问题，[0007]本发明的目的在于提供一种软骨组织工程用多孔支架及其制备方法，该多孔支架硬度较高、孔隙率较高，且无有害残留，安全，具有一定功能性，能够用于组织细胞培养或软骨组织再生，制备方法简单有效。
[0008]本发明所采 用的技术方案是:
[0009]一种软骨组织工程用多孔支架，所述软骨组织工程用多孔支架是由卡拉胶与壳聚糖按(8~4):1的质量比组成的三维多孔支架，孔隙率为80~96%，孔径为50~500 μ m，压缩模量0.7~1.2MPa,拉伸模量1.0~2.2MPa。
[0010]优选的，所述卡拉胶是K型卡拉胶K型或K型卡拉胶、t型卡拉胶、λ型卡拉胶的混合物，混合质量比是K型卡拉胶:I型卡拉胶:λ型卡拉胶=(5~9): (I~5):(I~5)的混合胶。
[0011]优选的，所述壳聚糖是分子量为10万~50万、脱乙酰度大于80%的壳聚糖。
[0012]本发明另一目的是提供一种制备所述软骨组织工程用多孔支架的方法，所述方法包括以下步骤:
[0013](I)用60°C~70°C蒸馏水配制3%~15%的卡拉胶溶液，用稀酸溶液配制
0.5%~1.2%的壳聚糖溶液，将二者分别打浆；
[0014](2)将上述卡拉胶溶液与壳聚糖溶液共混，搅拌，得卡拉胶-壳聚糖复合物；
[0015](3)将卡拉胶-壳聚糖复合物打浆，加入碳酸钠晶体粉，再次打浆，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物；
[0016](4)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物在60°C~70°C下水浴20~50min，浇注在模具中，放于_40°C~_20°C下冷冻3~6h，冷冻干燥，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架；
[0017](5)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架浸入稀酸溶液中，浸泡3~5h，再用蒸馏水浸泡8~10h，2~4h换水一次，之后真空干燥，得软骨组织工程用卡拉胶-壳聚糖复合多孔支架。
[0018]优选的，步骤(2)所述的卡拉胶溶液与壳聚糖溶液按照卡拉胶与壳聚糖溶质质量比(8~4):1的比例共混。
[0019]优选的，步骤(3)中碳酸钠晶体粉与卡拉胶-壳聚糖复合物溶质质量比为(6~15):1。
[0020]优选的，步骤(3)所述的碳酸钠晶体粉的大小为100~200 μ m。
[0021]优选的，步骤(1)所述的稀酸溶液为PH3~4的盐酸或乙酸，卡拉胶和壳聚糖在PH3~4左右进行交联复合，材料复合更加均匀；步骤(5)所述的稀酸为pHl.5~2.5的盐酸或乙酸。
[0022]优选的，步骤(1)所述的打浆过程采用打浆机，打浆速度为8000~10000r/min，打浆时间为20~30s ;步骤(2)所述的搅拌使用磁力搅拌器，搅拌速度为1000~2000r/min。
[0023]优选的，步骤(4)所述的冷冻干燥为真空度10~20Pa、0°C下抽气5~IOh ;步骤
(5)所述的真空干燥为真空度10~20Pa抽气5~10h。
[0024]本发明相对于现有技术的有益效果是:
[0025]I)本发明选用带有阴离子的卡拉胶溶液和带有阳离子的壳聚糖溶液进行交联复合，生成卡拉胶-壳聚糖复合物来制备三维支架。未使用明胶，所用天然原料来源广泛，且具有一定生物活性，能够有很好的生物相容性、可降解性。
[0026]2)本发明选用卡拉胶及壳聚糖作为多孔支架的原料，来源广泛，安全，具有一定功倉生;
[0027]3)本发明的原料溶解后分别经过打浆处理，能够使得交联复合更加充分，凝胶结构稳定性相比于现有技术中采用明胶或胶原为支架材料的产品提高40% ；
[0028]4)本发明将卡拉胶和壳聚糖在低酸酸性条件下进行交联复合，由于卡拉胶在酸性下不具有凝胶性，故而材料复合均匀，相比于现有的明胶或胶原-壳聚糖为支架的材料，均匀度提高30% ；
[0029]5)本发明加入大量碳酸钠晶体粉来致孔，在中和部分酸离子的情况下，产生气体，增多孔隙，而本发明的的低酸度能够保证碳酸钠不会被过多的分解；当部分碳酸钠分解后，PH上升，一些碳酸钠溶解于孔隙中，增加了卡拉胶凝胶的凝胶强度和硬度，还有一些仍旧以晶体状态存在于卡拉胶-壳聚糖复合物的孔隙中，保持复合物的孔隙率不会低于80% ;在冷冻干燥时，溶解的碳酸钠会有部分析出增大孔隙率；本发明制备方法中支架的孔径容易控制；
[0030]6)本发明可以有效的制备硬度较高、压缩模量达0.7~1.2Mpa、拉伸模量达
1.0~2.2MPa且孔隙率高的三维多孔支架，且不会有有害残留，卡拉胶-壳聚糖复合物能够用于组织细胞培养或软骨组织再生，新颖独特，前景广阔。



[0031]图1为本发明实施例中软骨组织工程用多孔支架的SEM照片；
[0032]图2实施例3中兔关 节植入支架12周后新生组织的苏木精一伊红染色图；
[0033]图3实施例3中兔关节植入支架12周后新生组织的番红染色粘多糖图。
[0034]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0035]实施例1
[0036]一种软骨组织工程用多孔支架，是由K型卡拉胶与分子量10万、脱乙酰度90%的壳聚糖按6:1的质量比组成的三维多孔支架，孔隙率89%，孔径100~150 μ m，压缩模量
0.7MPa，拉伸模量 1.0MPa0
[0037]—种软骨组织工程用多孔支架的制备方法，包括以下步骤:
[0038](I)用60°C蒸馏水配制3%的卡拉胶溶液，用PH3稀盐酸溶液配制0.6%的壳聚糖溶液，将其分别使用打浆机8000r/min，打浆30s ；
[0039](2)将上述卡拉胶与壳聚糖溶液按照卡拉胶与壳聚糖溶质质量比6:1共混，使用磁力搅拌器1000r/min搅拌,得卡拉胶-壳聚糖复合物；
[0040](3)将卡拉胶-壳聚糖复合物打浆，加入120 μ m碳酸钠晶体粉(与卡拉胶_壳聚糖复合物中溶质质量比为10:1)，再次打浆，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物；
[0041](4)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物70°C水浴30min，浇注不锈钢模具中，放于-30°C下冷冻4h，真空度10Pa、0°C下抽气6h冷冻干燥，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架；
[0042](5)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架浸入pHl.5的盐酸溶液中，浸泡3h，再用蒸馏水浸泡8h，2h换水一次，之后IOPa抽气7h真空干燥，得软骨组织工程用卡拉胶-壳聚糖复合多孔支架。
[0043]实施例2
[0044]一种软骨组织工程用多孔支架，是由K型卡拉胶与分子量20万、脱乙酰度85%的壳聚糖按4: I的质量比组成的三维多孔支架，孔隙率92 %，孔径50~80 μ m,压缩模量
1.2MPa，拉伸模量 2.2MPa。
[0045]一种软骨组织工程用多孔支架的制备方法，包括以下步骤:
[0046](I)用65°C蒸馏水配制5%的卡拉胶溶液，用PH3.6稀乙酸溶液配制I %的壳聚糖溶液，将其分别使用打浆机8500r/min，打浆25s ；
[0047](2)将上述卡拉胶与壳聚糖溶液按照卡拉胶与壳聚糖溶质质量比5:1共混，使用磁力搅拌器1500r/min搅拌,得卡拉胶-壳聚糖复合物；
[0048](3)将卡拉胶-壳聚糖复合物打浆，加入100 μ m碳酸钠晶体粉(与卡拉胶_壳聚糖复合物中溶质质量比为6:1)，再次打浆，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物；
[0049](4)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物60°C水浴50min，浇注不锈钢模具中，放于-20°C下冷冻6h，真空度15Pa、0°C下抽气7h冷冻干燥，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架；
[0050](5)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架浸入pH2的乙酸溶液中，浸泡5h，再用蒸馏水浸泡9h，3h换水一次，之后15Pa抽气6h真空干燥，得软骨组织工程用卡拉胶_壳聚糖复合多孔支架。
[0051]实施例3[0052]一种软骨组织工程用多孔支架，是由K型卡拉胶、t型卡拉胶及λ型卡拉胶的混合胶(混合质量比是K型卡拉胶:t型卡拉胶:λ型卡拉胶=8:1:1)与分子量33万、脱乙酰度92%的壳聚糖按8:1的质量比组成的三维多孔支架，孔隙率90%，孔径200~260 μ m,压缩模量1.0MPa,拉伸模量2.0MPa0
[0053]一种软骨组织工程用多孔支架的制备方法，包括以下步骤:
[0054](I)用67°C蒸馏水配制10%的卡拉胶溶液，用PH3.3稀盐酸溶液配制0.5%的壳聚糖溶液，将其分别使用打浆机10000r/min，打浆25s ；
[0055](2)将上述卡拉胶与壳聚糖溶液按照卡拉胶与壳聚糖溶质质量比8:1共混，使用磁力搅拌器2000r/min 搅拌,得卡拉胶-壳聚糖复合物；
[0056](3)将卡拉胶-壳聚糖复合物打浆，加入170 μ m碳酸钠晶体粉(与卡拉胶_壳聚糖复合物中溶质质量比为9:1)，再次打浆，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物；
[0057](4)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物67°C水浴40min，浇注不锈钢模具中，放于-33°C下冷冻5h，真空度20Pa、0°C下抽气9h冷冻干燥，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架；
[0058](5)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架浸入pHl.5的乙酸溶液中，浸泡5h，再用蒸馏水浸泡9h，2h换水一次，之后20Pa抽气9h真空干燥，得软骨组织工程用卡拉胶-壳聚糖复合多孔支架。
[0059](6)将步骤(5)得到的复合支架种植到新西兰大白兔膝关节骨软骨缺损处，12周后取样大体观察如图，可见缺损处平整光滑，新生组织填满整个缺损且与宿主组织结合良好；将体内12周样品，分别进行苏木精一伊红染色(图2)、粘多糖染色(图3)，可以看到新生软骨富含粘多糖，厚度和自体软骨厚度基本一致，且与新生的软骨下骨结合良好。
[0060]实施例4
[0061]一种组织工程用卡拉胶-壳聚糖复合多孔支架，是由K型卡拉胶、t型卡拉胶及入型卡拉胶的混合胶(混合质量比是K型卡拉胶:t型卡拉胶:λ型卡拉胶=5:4:4)与分子量50万、脱乙酰度95%的壳聚糖按5:1的质量比组成的三维多孔支架，孔隙率95%，孔径400~460 μ m。
[0062]一种组织工程用卡拉胶-壳聚糖复合多孔支架的制备方法，包括以下步骤:
[0063](I)用69°C蒸馏水配制12%的卡拉胶溶液，用PH3.4稀盐酸溶液配制0.9%的壳聚糖溶液，将其分别使用打浆机8800r/min，打浆30s ；
[0064](2)将上述卡拉胶与壳聚糖溶液按照卡拉胶与壳聚糖溶质质量比5:1共混，使用磁力搅拌器1900r/min搅拌,得卡拉胶-壳聚糖复合物；
[0065](3)将卡拉胶-壳聚糖复合物打浆，加入190 μ m碳酸钠晶体粉(与卡拉胶_壳聚糖复合物中溶质质量比为14:1)，再次打浆，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物；
[0066](4)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物69°C水浴30min，浇注不锈钢模具中，放于-40°C下冷冻4h，真空度18Pa、0°C下抽气IOh冷冻干燥，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架；
[0067](5)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架浸入pHl.9的盐酸溶液中，浸泡5h，再用蒸馏水浸泡9h，3h换水一次，之后ISPa抽气IOh真空干燥，得组织工程用卡拉胶-壳聚糖复合多孔支架。[0068]实施例5
[0069]一种软骨组织工程用多孔支架，是由K型卡拉胶与分子量40万、脱乙酰度94%的壳聚糖按4:1的质量比组成的三维多孔支架，孔隙率96%，孔径120~140 μ m，压缩模量
0.9MPa，拉伸模量 2.1MPa0
[0070]一种软骨组织工程用多孔支架的制备方法，包括以下步骤:
[0071](I)用70°C蒸馏水配制15%的卡拉胶溶液，用PH3的稀盐酸溶液配制1.2%的壳聚糖溶液，将其分别使用打浆机10000r/min，打浆30s ；
[0072](2)将上述卡拉胶与壳聚糖溶液按照卡拉胶与壳聚糖溶质质量比4:1共混，使用磁力搅拌器2000r/min搅拌,得卡拉胶-壳聚糖复合物；
[0073](3)将卡拉胶-壳聚糖复合物打浆，加入200 μ m碳酸钠晶体粉(与卡拉胶_壳聚糖复合物中溶质质量比为15:1)，再次打浆，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物；
[0074](4)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合物70°C水浴30min，浇注不锈钢模具中，放于-40°C下冷冻3h，真空度20Pa、0°C下抽气7h冷冻干燥，得卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架；
[0075](5)将卡拉胶-壳聚糖-碳酸钠复合多孔支架浸入pH2.5的盐酸溶液中，浸泡5h，再用蒸馏水浸泡10h，4h换水一次，之后20Pa抽气7h真空干燥，得软骨组织工程用卡拉胶-壳聚糖复合多孔支架。 [0076]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。