专利名称：软骨吸收的治疗的制作方法软骨吸收的治疗本发明涉及葛根(Radix Pueraria lobata)(也称为葛藤根(Kudzuroot))通过治疗或预防过度软骨吸收而用于治疗方面的用途，包括治疗骨关节炎以使关节软骨退变(cartilage degradation)减少，或者预防最终可引起软骨室(cartilage compartment)(例如，关节中的软骨室)的结构完整性损伤的过度关节退变。葛根(Gegen)是葛(Pueraria lobata (Willd), Ohwi)的干燥根部分。葛根的主要产地是中国的湖南省、广东省、浙江省和河南省。该植物是长度为10米的多年生藤本植物或蔓生植物。根可在秋冬两季收获，切成厚片并可在干燥后使用。 葛有一种相关植物,名称为粉葛(Pueraria thomsonii Benth)。葛和粉葛的根在所有版本的中国药典中均记载在相同的专题“葛根”(RadixPuerariae, RP)中。但是，在其2005年版中，这两种物种被分成两个独立的专题，即“葛根”(Radix Pueraria lobata, RPL)和“粉葛”(RadixPuerariae Thomsonii, RPT)。在组成上,葛根包含大量纤维,而粉葛富含淀粉。它们均可用作食物和药。葛(Pueraria)属包括在葛藤名下提及的五个种，它们是食用葛(P.edulis)、葛(P. lobata)、葛麻姆(P. Montana)、三裂叶野葛(P. haseoloides)和粉葛(P. thomsonii)。该属中的另一些植物包括泰国野葛(P. mirifica)、蛾眉葛(P. omeiensis)、苦葛(P. peduncularis)、印度葛(P. tuberosa)和瓦氏葛(P. wallichii)。葛根在中医(TCM)中有着悠久的传统，其在提出用于治疗一系列病症(它们并不全能容易地翻译成常规的西医术语)的复杂混合物中作为活性成分。JP-A-2007-186457公开了将葛根作为充当类胰蛋白酶活性抑制剂用于治疗多种病症(包括类风湿性关节炎(RA))的许多材料之一。其理论参照Gruber等.J. Clin.Invest. 1989年11月，84 (5) =1657-62 :存在于类风湿性滑膜中的肥大细胞类胰蛋白酶使MMP3活化，而这在RA中胶原酶对软骨的破坏中是活跃的。没有给出证据证明葛根的作用。但是，几项人体研究已表明，对MMP-3的抑制并不对关节软骨退变提供保护。CN 101002908公开了葛根在外用硬膏剂的17种中药材混合物中使用时在治疗类风湿性关节炎中的用途(根据Espacenet上公开的摘要)。但是，其原始说明书中没有使用术语“类风湿性关节炎”，而是称为“风、寒、湿痹”。这看来在更大程度上是对疼痛的通俗描述，而不是医学术语。还提到了许多其它引起疼痛的病症。很可能全部教导仅仅是疼痛的缓解，而且甚至这一点也并不需要葛根的作用。CN1115160描述了(根据其Espacenet摘要)包含葛根的药，其用于治疗包括类风湿性关节炎和骨关节炎二者的病症。但是同样地，这看来是将疾病的通俗描述翻译成技术性的西方医学术语，其并不正确。该文件实际上提到了消除风湿病和治疗关节肿大。还不清楚其是否确实教导了与类风湿性关节炎或骨关节炎的关系。描述了其复方草药制剂提高血流量，从而使肌肉和关节放松。但是葛在其中的作用并不清楚，因为据称葛根是对脾胃有.、Mo相似地，CN101095845教导了许多草药和其它成分(包括葛根)的复杂组合物，其根据Espacenet摘要是用于治疗包括关节炎的疾病，但是同样地，这好像是对风湿病这一说法过于技术化的翻译。据称葛根的作用是排除肌肉和皮肤中的致病因子。相似地，CN1090512描述了包含几种草药(包括葛根)的泥罨剂，其用于治疗骨质增生，但也有益于风湿病、类风湿性关节炎和肌肉拉伤，其通过提高血流量起作用。此外，CN101391050(根据其Espacenet摘要)公开了包含多种草药成分(包括葛根)的中药制剂，其用于缓解炎症和关节炎，但是不清楚该说明书是否实际上提到了关节炎。其教导了该组合物具有改善血液循环和缓解疼痛(尤其是颈部和肩部疼痛)的作用。CN1506052好像公开了包含来自革兰氏阴性球菌的遗传物质(称作“因子X”)与“葛汁”之组合的用于治疗关节痛的组合物。但是，因为对“因子X”的描述模糊，所以这看来并不是能够实现的公开内容。没有表明组合物以何种方式在缓解关节炎中起作用。已报道了关于葛藤属物种作用的一些科学研究。Manonai等研究了泰国葛对大鼠的细胞学和尿动力学参数的雌激素样作用，发现泰国葛确实表现出雌激素样作用。Urasopon等研究了泰国葛对卵巢切除之大鼠的骨质流失的预防作用，发现以与炔 雌醇相当的方式剂量依赖性地预防了骨质流失。但是，Weaver等报道了在对健康绝经后妇女的小型试验中，葛根并不显著降低净骨吸收。Tanko等在研究了该文献后得出结论雌激素可能在外植体培养物中软骨细胞介导的关节软骨退变中对关节软骨起保护作用，正如雌二醇所产生的CTX-II软骨退变标志物的剂量依赖性减少所示。根据以下发现，Si-Na Kim等提出了葛根提取物可能是治疗骨关节炎的优良草药这种提取物在小鼠巨噬细胞和兔关节软骨细胞中表现出对细胞因子诱导的蛋白聚糖降解、前列腺素E2产生、一氧化氮产生和基质金属蛋白酶表达的强抑制效力。现在我们出乎意料地发现，葛根有效地减少了 II型胶原的损失。在现阶段，该作用的机制还不知道。因此，本发明提供了用于通过治疗或预防过度关节软骨退变来进行治疗的组合物，其包含葛根或其活性成分的提取混合物，并且被配制用于向哺乳动物施用。所述组合物可用于通过在没有关节炎症的情况下治疗过度关节软骨退变而进行治疗。所述组合物可配制成用于药物施用，也可配制成用作食品成分或食品补充剂。因此，所述组合物可采用富含活性物质的食品形式，例如食物棒。合适地，所述组合物包含所述根之溶剂提取物的所有或者基本上所有的固体成分。但是，这些固体可以被部分纯化，从而增加其活性内容物。优选地，所述部分纯化提高所述固体中类黄酮和/或异黄酮的浓度。优选地，所述溶剂提取物为乙醇提取物。或者，所述溶剂提取物可以为甲醇提取物或其它合适的有机溶剂提取物。此外，所述组合物可包含所述根的水提物。溶剂提取物可直接用作药物组合物而不用从其中分离固体，或者可以在任选地进一步纯化之前或之后，移除溶剂以得到所述固体。所述固体组分可以通过部分纯化所述溶剂提取物而得到，例如通过经过大孔树脂柱而实现。在这种情况下，通过弃去穿过柱的流出物并从柱上洗脱保留在其上的活性化合物，活性化合物将被浓缩。更一般地，可部分纯化最初的溶剂提取物，以提高固体中降低软骨损失的活性化合物级分的浓度。在目前仍不知道哪些化合物有效的情况下，这种纯化必须根据经验来指导。因此，通过测定纯化提取物如下文实施例2进行的测试其防止CTX-II释放之效力的测试中是否多少具有活性，可以测试候选的纯化方法。合适的方法可包括将活性化合物捕获在允许某些非活性物质流通的合适色谱介质上，然后可以从所述介质中洗脱活性化合物。大孔树脂，尤其是AB-8树脂适用于该目的。所提取的物质可以以任何常规的固体或液体制剂形式施用，例如以片剂或胶囊或用于经口施用的其它形式。但是最优选地，作为食品的成分提供。合适的剂量率(以提取物干物质计)包括12mg/kg体重至I. 2g/kg体重，例如60至250mg/kg,例如在人体中约120mg/kg。特征是II型胶原损失的疾病包括骨关节炎，所述组合物将可用作针对该疾病的预防或治疗手段。 提取方法和任何后续纯化可用于例如得到存在于根中的异黄酮化合物。已知存在于这种提取物中的异黄酮(包括异黄酮苷)包括二素嗪(diadzin)、黄豆苷原(diadzein)、染料木黄酮(genistein)、葛藤根素(puerarin)和鹰嘴豆素A (biochanin A)。优选地,所述组合物中存在这些中的一些或者更优选全部。当选择在部分纯化提取物中包含富含异黄酮或类黄酮的色谱级分时，可以利用这些化合物与FeCl3 (作为其存在的便利标志物)的变色反应。参照附图并通过以下实施例对本发明进行进一步描述和阐明，其中图I示出实施例2中进行的骨吸收测量的结果；图2示出实施例2中进行的软骨吸收测量的结果；图3示出实施例2中进行的体重测量的结果；实施例I :葛根的提取将根粉碎并称重。提取将碎片放入圆底烧瓶中，填充小于烧瓶体积的3/5。将8倍于粉末物质体积的70%乙醇加入烧瓶。将烧瓶与冷凝器连接，并在8°C下加热维持3小时，两次。通过滤网过滤液体提取物，得到澄清液体，然后在50°C通过旋转蒸发器进行浓缩，从而得到密度约I. 1-1. 2g/cm3的浓缩提取物。纯化用水稀释浓缩提取物至固体浓度相当于每毫升水中有约O. 26 O. 28g原材料中的可提取内容物，并且PH值为5 6。该计算浓度用于估计溶液在Ab-8大孔吸附树脂柱上的上样体积。将稀释的提取物在AB-8上纯化，以进一步富集提取物的活性成分并且去掉一些杂质。弃去流出物，水溶液提取物中的活性成分被保留在AB-8树脂柱中，然后用70%乙醇洗脱。水溶液以2ml/min被AB-8树脂吸附，然后使用70%乙醇以2ml/min解吸附；70%乙醇的体积为树脂体积的6倍。我们按级分收集了洗出液，并用1% FeCl3测试反应性。收集了由黄色变为深绿色(表明抗氧化特征)的级分。旋转蒸发掉70%乙醇洗脱液，然后在低压和50°C下浓缩，得到密度为I. 1-1. 2g/cm3的浓缩提取物，将其放于烧瓶或板中，-20°C下冷冻。然后，将烧瓶或板放入低温真空干燥器中，得到干粉。不同批次之间，每千克原材料的固体药物产量为50至IOOg不等。实施例2 :提取物对卵巢切除之大鼠的作用进行OVX筛查研究以评价当连续6周向卵巢切除的6月龄Sprague-Dawley大鼠通过经口饲喂给药时，TCM提取物对骨质流失和关节退变的作用。该研究由不同的组组成。每个组包含10只大鼠，并且用不同测试物品处理6周。还包括了假手术组、用赋形剂处理的OVX组和用雌激素处理的OVX组作为研究对照。在基线处、第3周和第6周，在过夜禁食后的早晨收集每只大鼠的血清样品用于生物化学标志物分析。每周一次记录每只动物的体重。用二氧化碳(C02)使动物窒息并放血处死。通过CTX-I (I型胶原骨退变标志物)和CTX-II测定(II型胶原软骨退变标志物)对血清样品进行测量。·6. 3统计学分析通过SPSS统计软件进行了比较不同组的统计学分析，将所有试验的显著性水平设置为O. 05。得自于动物的数据使用列文中位数检验(LeveneMedian test)分析方差齐性，并且使用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验(Kolmogorov-Smirnov test)分析正态性。对于OVX赋形剂对照组与假手术组的比较，使用独立样本T检验分析参数数据，并且使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)分析非参数数据。对于所有组，使用方差分析(ANOVA)分析参数数据，并且使用Dunnet’ s T检验确定组间差异(赋形剂对照与样品处理组)的显著性。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)分析非参数数据，并且使用Dunn’ s检验确定赋形剂对照与物品处理试验组之间的组间差异显著性。结果基于TCM的草本提取物对骨吸收的体内作用图I示出第一种研究的结果。对六月龄大鼠进行假手术(Gr. I)或卵巢切除(OVX)。用基于TCM的草本提取物(Gr. 10 ；NBB-K6, 750mg/Kg体重，17- β -雌二醇(Gr. 3)，或赋形剂(Gr. 2)每天口服处理OVX大鼠一次，持续6周。将干燥提取物以120mg/ml的浓度重新溶解于水中，并且以750mg/kg体重的剂量通过饲喂每天向大鼠给药。测定血清CTX-I水平作为骨吸收的生物化学参数，在临OVX手术之前(O周)的基线处、OVX手术后3周(第3周)和OVX手术后6周(第6周)进行测量。标绘出6周处理过程期间每个处理组中CTX-I的平均个体变化，并且误差线表示平均标准误(SEM)。与假手术组相比，OVX引起的雌激素不足引起卵巢切除后CTX-I水平的显著增高。该观察与卵巢切除引起的骨转换(bone turnover)的预期增加一致。雌激素植入物能够完全使OVX大鼠中的CTX-I水平正常化。在第3周和第6周的OVX大鼠中，提取物NBB-K6 (Gr. 10)均表现出对降低骨吸收(CTX-I水平)的显著作用(p < O. 005)。基于TCM的草本提取物对关节软骨退变的体内作用每个实验组(TCM-8研究)中不同时间点的血清CTX-II浓度图2示出在6周的处理过程中，标绘的每个处理组中血清CTX-II (pg/ml)平均水平的相应测量，误差线表示平均标准误(SEM)。与假手术组相比，OVX引起的雌激素不足引起卵巢切除后第3周CTX-II水平的显著增高。雌激素处理能够完全使OVX大鼠中的CTX-II水平正常化。基于TCM的草本提取物NBB-K6表现出对降低软骨退变产物CTX-II的显著作用(p < O. 05)。我们认为，观察结果不太可能是因为抗炎症作用，因为卵巢切除的大鼠并未表现出关节炎症或其它炎性病症。本领域技术人员将理解，用RPL提取物处理之后，卵巢切除之大鼠中所观察到的CTX-II片段循环水平的抑制是软骨退变减少的反映，并且这种在其它方面健康的动物中代谢软骨平衡的恢复与任何其它疾病阶段或状况的缓解无关。这种效果最终将转变成在关节中(尤其是关节软骨中)代谢活性提高的人或其他哺乳动物中的有利作用。本领域技术人员会理解，在卵巢切除之大鼠中所观察到的对软骨代谢的作用不是抑制炎症或任何其它这种病理状况的反映，而是反映了软骨室中已恢复了正常或接近正常的代谢活性水平，这如果长时间维持的话，将维持关节功能。 基于TCM的草本提取物对动物体重增长的作用图3示出6周的研究中每组大鼠的平均体重，误差线表示平均标准误(SEM)。卵巢 切除引起了动物的显著体重增加，在卵巢切除后第6周的OVX+赋形剂组(Gr.2)中达到了18%，这与公认的剥夺内源性雌激素生产的作用一致。OVX与雌激素处理组(Gr.3)和OVX与葛藤提取物处理组(Gr. 10)中的相应变化分别为-5. 5%和-2. 5%，这与OVX+赋形剂对照组(Gr. 2)显著不同。在本说明书中，除非另有明确说明，否则使用词语“或”的意思是当符合所述条件之一或两者时作运算符都返回真值，其与需要仅有其一符合条件的运算符“异或”相反。使用词语“包含”的意思是“包括”，而不是意指“由......组成”。以上公认的所有现有教导
均通过引用并入本文。本文中没有公认的任何现有公开文件应理解为承认或代表其教导为澳大利亚或其它地方在其日期的一般常识。参考文献Manonai J,Seif C,Bohler G,Junemann KP,Menopause,2009Mar~Apr,16(2)350-6Si-Na Kin, Hee-Seok Kim, et al. Inhibition of inflammatory-cytokinesproduction and prostaglandin E2 Activity by Puerariae Radix extracts, JKorean SocFood Sci Nutr,2006,35(I) ,28-34.Tanko LB, Sondergaard B_C, Oestergaard S, Karsdal MA, Christiansen C ；Climacteric 2008,11 :4-16Urasopon N,Hamada Y,Cherdshewarsart W,Malaivij itnond S. Maturitas2008,Feb20 ；59(2) ； 137-48Weaver CM, Martin BR, Jackson GS, McCabe GP, Nolan JR, McCabe LD, BarnesS,Reinwald S, Boris ME, Peacock M ；J Clin Endroclinol Metab 2009，Oct,94(10)，3798-80

通过向哺乳动物(例如人)施用例如葛(Pueraria lobata)(葛藤)根或其提取物来治疗或预防过度的关节软骨退变。