专利名称：仿松质骨生物活性人工骨及其制备方法骨骼移植是仅次于输血的需求量最大的移植物，由于事故或疾病造成骨缺损是临 床常见病例。目前常用的修复材料有自体骨、异体骨及人工合成材料，这些材料均在不同程 度上存在不足，不能满足临床需要。如自体骨移植虽无免疫排斥反应，修复效果良好，但取 材十分有限，且造成供区的骨缺损；同种异体骨移植容易引起免疫排斥反应，修复效果差， 并有传染病毒性疾病的危险，而且取样、处理、存储的成本高，其应用受到很大限制；人工合 成材料如聚甲丙烯酸甲酯、硫化硅橡胶等都是非降解材料，不能修复缺损区，且存在排异反 应。目前研究的重点是致力于找出具有良好的理化性质、生物学特性的生物材料作为骨移 植物或骨诱导材料。利用磷酸钙类物质作为骨移植材料经过近百年的历史，目前仍有广泛 的应用前景，但传统的磷酸钙类物质如羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)等无孔或孔径小， 孔隙交通达不到骨单位内向生长的结构要求，且其存在脆性大、韧性低、可降解性差、修复 能力弱等缺点，只能作为骨科的填充材料。目前，市场上新出现的“纳米人工骨”仍存在可 降解性差、诱导骨再生能力弱的缺点。
本发明提出一种仿松质骨生物活性人工骨及其制备方法，将低结晶度的磷酸氢钙 与动物胶原复配，冷冻干燥制成高孔隙率、具有良好孔隙交通的复合人工骨，使其具有被彻 底降解和诱导大段骨缺损修复的性能。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种仿松质骨生物活性人工骨由磷酸氢钙粉体和胶原溶液复配而成。上述磷酸氢钙粉体为CaHPO4. 2H20粉体和CaHPO4粉体中的一种或两者任意配比的 混合物；优选为CaHPO4. 2H20粉体和CaHPO4粉体任意配比的混合物。上述述胶原溶液的粘度优选为700 lOOOcP。每毫升胶原溶液复配0. 6 1. Og 磷酸氢钙粉体。上述仿松质骨生物活性人工骨的制备方法为在于在每毫升粘度为700 IOOOcP 的胶原溶液中，加入0. 6 1. Og磷酸氢钙粉体，混勻、冷冻干燥。具体包括如下步骤a、制备磷酸氢钙粉体将水溶性的含Ca2+的化合物和含PO43-的化合物充分溶于水 中，滴入碱性溶液至pH值为62 6. 9 (当pH值为6时即开始出现沉淀，随着pH值的升高， 沉淀越来越多，溶液越来越浑浊，待PH值升至6. 2 6. 9时，停止碱性溶液的滴入)，收集沉 淀，干燥、研磨后得低结晶度的以CaHPO4. 2H20为主混有少量CaHPO4的粉体；b、制备胶原溶液取动物肌腱于酸溶液中，加入胃蛋白酶溶液，混勻、浸泡得胶原蛋白溶液；C、在上述制备的胶原溶液中加入磷酸氢钙粉体，混勻；d、将上述磷酸氢钙和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人工骨。e、将所得仿松质骨生物活性人工骨用15 20kGy剂量6tlCo辐照灭菌。上述步骤a中所用水优选为蒸馏水或去离子水；收集沉淀方法优选为离心沉淀 法，所得沉淀物最好水洗3次以上；沉淀的干燥温度优选为80 100°C，干燥时间M 48 小时；水溶性的含Ca2+的化合物和含PO43-的化合物的用量可以为任意值，只要将它们充分 溶解即可，本发明主要是通过调节pH值来控制产物的生成。上述步骤b中所取肌腱一般为哺乳动物的肌腱，在置于酸溶液前，一般要先去 除油脂、用灭菌溶液浸泡消毒灭菌后，漂洗干净；所用酸溶液的体积百分比浓度为0. 5 1. 0% ；每毫升酸溶液中胃蛋白酶的加入量为20 25国际活性单位；所得胶原蛋白溶液的 粘度为700 IOOOcP (厘泊)，且一般要过滤除渣，以去掉部分未溶解的肌腱。上述步骤c中每毫升胶原溶液中磷酸氢钙粉体的加入量为0. 6 1. 0g。上述水溶性含Ca2+的化合物优选为CaCl2、CaO、Ca (OH) 2或Ca (NO3) 2 · 4H20 ；含 PO43-的化合物优选为(NH4)2HPCV Na2HPO4或H3PO4 ；碱性溶液优选为NaOH溶液、Ca(OH)2溶 液、NaHCO3溶液、Na2CO3溶液、NH4HCO3溶液或氨水；酸溶液优选为乙酸、磷酸、硫酸、硝酸或盐 酸溶液；哺乳动物的肌腱优选为猪腿肌腱、牛腿肌腱、羊腿肌腱、狗腿肌腱、驴腿肌腱、骡腿 肌腱、鹿腿肌腱、兔腿肌腱或马腿肌腱。上述仿松质骨生物活性人工骨的制备方法的步骤d中，冷冻干燥的流程优选为 经1 3小时从室温降至-40°c -50°c ；保温2 4小时；冻实后抽真空升华12 M小 时；经2 4小时升温至0°C，0°C保温4 12小时；经1 3小时升温至15°C，15°C保温 4 8小时；经1 3小时升温至25°C，紧接着经1 3小时升温至，保温2 4小时，去真空。本发明所得的人工骨的结构和成分，类似天然松质骨；其中低结晶度的磷酸氢钙 更有利于人工骨的降解吸收和自体骨缺损的修复重建。该人工骨传导作用强、孔隙率高、孔 隙交通好、生物相容性好，有利于骨细胞生长，且其中的胶原在被机体降解吸收的过程中， 为骨细胞的长入不断腾出空间。与现有技术所使用的羟基磷灰石复合人工骨相比，无论是 可降解性还是诱导自体骨再生性能，本发明均具有突出的优势。图1为本发明扫描电镜照片。图2为本发明X射线衍射图。图3为本发明植入兔体后不同时间缺损处修复的动态变化的X线照片。图4为本发明植入兔体76天显微镜下放大100倍的组织切片图。图5为本发明植入兔体92天X线照片。图6为标准羟基磷灰石/胶原复合人工骨植入兔体92天X线照片。图7为本发明植入兔体92天显微镜下放大100倍的组织切片图。图8为标准羟基磷灰石/胶原复合人工骨植入兔体92天显微镜下放大100倍的 组织切片图。
具容器中。d、将上述磷酸氢钙粉体和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人 工骨。温度控制流程为经2小时从室温降至-50°C，保温3小时，冻实后抽真空升华20小 时，经3小时升温至0°C，0°C保温5小时，经2小时升温至15°C，15°C保温6小时，经2小时 升温至25°C，紧接着经2小时升温至35°C，保温3小时，去真空。e、然后将冻干品密封包装后用16kGy剂量6tlCo辐照灭菌。实施例4
a、低结晶度磷酸氢钙粉体的制备称取148g Ca(OH)2溶于IOOOml去离子水中，搅拌使其充分溶解，边搅拌边加 入63g磷酸氢二氨((NH4)2HPO4),然后边搅拌边加入饱和氨水至pH值为6.6。离心收集 沉淀，用去离子水洗涤3次，离心，将沉淀置于干燥箱中98°C下干燥30小时，研磨后得到 CaHPO4. 2H20为主混有少量CaHPO4的粉体。重复该步骤制备IOOOg粉体。b、胶原溶液的制备取经检疫后合格的羊腿的肌腱50g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用洗洁精清洗以彻 底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用11倍稀释的新洁尔灭溶液浸泡25分钟消毒灭菌， 取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 0. 8%的 硫酸溶液中(容器事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的50000 U(国际单位)胃蛋白 酶溶液，使每毫升硫酸溶液中的胃蛋白酶为25国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混 勻，在室温下浸泡10小时至溶液粘度为850cP，过滤除渣得胶原蛋白溶液。c、称取750g磷酸氢钙干粉加入IOOOml胶原溶液，充分搅拌混勻后灌装入模具容 器中。d、将上述磷酸氢钙粉体和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人 工骨。温度控制流程为经1.5小时从室温降至-48°C，保温2. 5小时，冻实后抽真空升华 12小时，经2. 5小时升温至0°C，0°C保温7小时，经1. 5小时升温至15°C，15°C保温7小时， 经1. 5小时升温至25°C，紧接着经1. 5小时升温至35°C，保温2. 5小时，去真空。e、然后将冻干品密封包装后用ISkGy剂量6tlCo辐照灭菌。实施例5a、低结晶度磷酸氢钙粉体的制备称取29. 4g CaCl2. 2H20溶于1000ml去离子水中，搅拌使其充分溶解，边搅拌边加 入16g磷酸氢二氨((NH4)2HPO4)，然后边搅拌边加入lmol/L的NaHCO3溶液至pH值为6. 5。 离心收集沉淀，用去离子水洗涤3次，离心，沉淀置于干燥箱中80°C下干燥48小时，研磨后 得到CaHPO4. 2H20为主混有少量CaHPO4的粉体。重复该步骤制备IOOOg粉体。b、胶原溶液的制备取经检疫后合格的狗腿的肌腱50g，用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水 漂洗4次，用0. 5%洗必泰(氯己定)溶液浸泡15分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 0.9%的硝酸溶液中(容器事先经 灭菌处理)，并加入已过滤除菌的46000 U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升硝酸溶液中 的胃蛋白酶为23国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混勻，在室温下浸泡10小时至溶 液粘度为lOOOcP，过滤除渣得胶原蛋白溶液。c、称取800g磷酸氢钙干粉加入IOOOml胶原溶液，充分搅拌混勻后灌装入模具容器中。d、将上述磷酸氢钙粉体和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人 工骨。温度控制流程为经2. 5小时从室温降至-49°C，保温3. 5小时，冻实后抽真空升华 23小时，经3. 5小时升温至0°C，0°C保温10小时，经2. 5小时升温至15°C，15°C保温5小 时，经2. 5小时升温至25°C，紧接着经2. 5小时升温至35°C，保温3小时，去真空。e、然后将冻干品密封包装后用19kGy剂量6tlCo辐照灭菌。
从扫描电镜(JSM-6460LV，Electron，Japan)照片(图1)，可知所得人工骨空隙直 径在100 μ m至400 μ m,孔隙率为83. 8士5%，即人工骨具有类似天然松质骨的内连孔结构 和孔径。从X射线衍射图(图2)可知人工骨的无机成分为CaHPO4. 2H20。实施例6a、低结晶度磷酸氢钙粉体的制备称取118g硝酸钙(Ca(NO3)2 · 4H20)溶于IOOOml去离子水中，搅拌使其充分溶解， 边搅拌边加入^ml 30% H3PO4溶液，然后边搅拌边加IN NH4HCO3溶液至pH值为6. 4。离心 收集沉淀，用去离子水洗涤3次，离心，将沉淀置于干燥箱中100°C下干燥观小时，研磨后得 到CaHPO4. 2H20为主混有少量CaHPO4的粉体。重复该步骤制备IOOOg粉体。b、胶原溶液的制备取经检疫后合格的驴腿的肌腱45g，用0. IN NaOH溶液清洗以彻底去除油脂，然后 用自来水漂洗4次，用70%的乙醇溶液浸泡30分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水 漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 1.0%的磷酸溶液中(容器事先经灭 菌处理)，并加入已过滤除菌的50000 U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升磷酸溶液中的 胃蛋白酶为25国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混勻，在室温下浸泡10小时至溶液 粘度为900cP，过滤除渣得胶原蛋白溶液。c、称取850g磷酸氢钙干粉加入IOOOml胶原溶液，充分搅拌混勻后灌装入模具容器中。d、将上述磷酸氢钙粉体和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人 工骨。温度控制流程为经3小时从室温降至-41°C，保温4小时，冻实后抽真空升华18小 时，经4小时升温至0°C，0°C保温9小时，经3小时升温至15°C，15°C保温4. 5小时，经3小 时升温至25°C，紧接着经1小时升温至35°C，保温4小时，去真空。e、然后将冻干品密封包装后用70kGy剂量6tlCo辐照灭菌。实施例7a、低结晶度磷酸氢钙粉体的制备称取44g CaCl2. 2H20溶于1000ml去离子水中，搅拌使其充分溶解，边搅拌边加入 17ml 30 ^H3PO4溶液，然后边搅拌边加入lmol/L的NaHCO3液至pH值为6. 3。离心收 集沉淀，用去离子水洗涤3次，离心，将沉淀置于干燥箱中100°C下干燥M小时，研磨后得 CaHPO4. 2H20为主混有少量CaHPO4的粉体。重复该步骤制备IOOOg粉体。b、胶原溶液的制备取经检疫后合格的骡腿的肌腱45g，用0. IN的NaoH溶液清洗以彻底去除油脂，然 后用自来水漂洗4次，用70%的乙醇溶液浸泡30分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 0.8%的乙酸溶液中(容器事先经 灭菌处理)，并加入已过滤除菌的50000U (国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中 的胃蛋白酶为25国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混勻，在室温下浸泡10小时至溶 液粘度为900cP，过滤除渣得胶原蛋白溶液。C、称取900g磷酸氢钙干粉加入IOOOml胶原溶液，充分搅拌混勻后灌装入模具容器中。d、将上述磷酸氢钙粉体和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人工骨。温度控制流程为经2小时从室温降至-46°C，保温4小时，冻实后抽真空升华20小 时，经3小时升温至0°C，0°C保温11小时，经2小时升温至15°C，15°C保温5小时，经2小 时升温至25°C，紧接着经3小时升温至35°C，保温2小时，去真空。e、然后将冻干品密封包装后用20kGy剂量6tlCo辐照灭菌。实施例8a、低结晶度磷酸氢钙粉体的制备称取118g硝酸钙(Ca(NO3)2 · 4H20)溶于IOOOml去离子水中，搅拌使其充分溶解， 边搅拌边加入^ml 301^H3PO4溶液，然后边搅拌边加入lmol/L的NaOH溶液至pH值为6. 2。 离心收集沉淀，用去离子水洗涤3次，离心，将沉淀置于干燥箱中90°C下干燥36小时，研磨 后得到CaHPO4. 2H20为主混有少量CaHPO4的粉体。重复该步骤制备IOOOg粉体。b、胶原溶液的制备取经检疫后合格的鹿腿的肌腱40g，用0. IN的NaoH溶液清洗以彻底去除油脂，然 后用自来水漂洗4次，用70%的乙醇溶液浸泡30分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 0.7%的乙酸溶液中(容器事先经 灭菌处理)，并加入已过滤除菌的48000U (国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中 的胃蛋白酶为M国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混勻，在室温下浸泡10小时至溶 液粘度为lOOOcP，过滤除渣得胶原蛋白溶液。c、称取950g磷酸氢钙干粉加入IOOOml胶原溶液，充分搅拌混勻后灌装入模具容器中。d、将上述磷酸氢钙粉体和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人 工骨。温度控制流程为经1. 5小时从室温降至_46°C，保温3小时，冻实后抽真空升华21 小时，经4小时升温至0°C，0°C保温6小时，经1小时升温至15°C，15°C保温6小时，经1小 时升温至25°C，紧接着经2小时升温至35°C，保温3. 5小时，去真空。e、然后将冻干品密封包装后用ISkGy剂量6tlCo辐照灭菌。实施例9a、低结晶度磷酸氢钙粉体的制备称取29. 4g CaCl2. 2H20溶于1000ml去离子水中，搅拌使其充分溶解，边搅拌边加 入16g磷酸氢二氨((NH4)2HPO4),然后边搅拌边加入lmol/L的NH4HCO3至pH值为6. 9。离 心收集沉淀，用去离子水洗涤3次，离心，将沉淀置于干燥箱中85°C下干燥47小时，研磨后 得到CaHPO4. 2H20为主混有少量CaHPO4的粉体。重复该步骤制备IOOOg粉体。b、胶原溶液的制备取经检疫后合格的兔腿的肌腱50g，用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水 漂洗4次，用0. 5%洗必泰(氯己定)溶液浸泡15分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子 水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 0.6%的硝酸溶液中(容器事先经 灭菌处理)，并加入已过滤除菌的46000U (国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升硝酸溶液中 的胃蛋白酶为23国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混勻，在室温下浸泡10小时至溶 液粘度为lOOOcP，过滤除渣得胶原蛋白溶液。C、称取IOOOg磷酸氢钙干粉加入1000ml胶原溶液，充分搅拌混勻后灌装入模具容器中。
d、将上述磷酸氢钙粉体和胶原的混合膏状物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人 工骨。温度控制流程为经2. 5小时从室温降至-50°C，保温2小时，冻实后抽真空升华18 小时，经3小时升温至0°C，0°C保温7小时，经1小时升温至15°C，15°C保温6小时，经2小 时升温至25°C，紧接着经3小时升温至35°C，保温3. 5小时，去真空。e、然后将冻干品密封包装后用15kGy剂量6tlCo辐照灭菌。应用实施例1方法使用5只新西兰大白兔(1. 5-2. Okg，南京安利默实验动物有限公司)作为 实验动物，所有动物被戊巴比妥钠溶液局部麻醉后在一侧尺骨造成Icm全缺损，在缺损处 植入上述实施例5所得人工骨。术后1周每天按体重给动物注射青霉素消炎。并在术后 0、7、14、21、35、42、49、55、62、69、76天拍X线照片，最后处死动物进行解剖观察及组织学观察。结果从术后X线照片(图3)可看出，术后7天可见缺损处骨组织大量增生，至 术后49天可见缺损处合拢但尚未完全愈合，术后49至55天出现明显的过度增生及与桡骨 粘连，此后经历增生与吸收的过程直至完全愈合，术后76天可见完全愈合。处死动物进行 解剖得知缺损处修复后与未手术部位外观接近，且人造骨已被完全降解吸收。由组织切片 (图4)可见，缺损处形成骨板并完全骨化、骨单位明显、尚未形成明显的层状骨板，散布的 骨窝中有骨细胞、中央管可见新生血管，未见人工骨残留，人工骨被彻底降解吸收。本发明分别将上述其它实施例所得的人工骨植入兔体后，均得到与应用实施例1 接近的结果。比较实施例1方法使用10只新西兰大白兔(1. 5-2. 0kg，南京安利默实验动物有限公司)作为 实验动物，随机分为2组，每组5只，所有动物被戊巴比妥钠溶液局部麻醉后在一侧尺骨造 成Icm全缺损，将第一组在缺损处植入上述实施例4所得人工骨，将第二组在缺损处植入标 准羟基磷灰石/胶原复合人工骨(羟基磷灰石标准品购自南京南奥科技有限公司)。术后 1周每天按体重给动物注射青霉素消炎。在术后92天拍X线照片后，处死动物进行解剖观 察及组织学观察。结果第一组大白兔由术后92天的X线照片(图5)显示，缺损处完全愈合；处 死动物进行解剖得知，缺损处修复与未手术部位外观接近；由组织切片(图7)可见，缺损处 形成骨板并完全骨化、骨单位明显、尚未形成明显的层状骨板，散布的骨窝中有骨细胞、中 央管可见新生血管，未见人工骨残留，人工骨被彻底降解吸收。第二组大白兔由术后92天的X线照片(图6)显示，缺损处部分愈合；处死动物 进行解剖得知，缺损处成骨较差，易折断，其中一只兔子因手术部位骨折死亡；由组织切片 (图8)可见，缺损处虽有组织再生，但由结缔组织和软骨组织构成，基本未骨化。


本发明涉及一种仿松质骨生物活性人工骨及其制备方法，所述仿松质骨生物活性人工骨由磷酸氢钙粉体和胶原溶液复配而成；其制备方法为将制备好的磷酸氢钙粉体和胶原溶液混匀，再将上述混合物冷冻干燥成为仿松质骨生物活性人工骨。本发明所得的人工骨的结构和成分，类似天然松质骨；其中低结晶度的磷酸氢钙更有利于人工骨的降解吸收和自体骨缺损的修复重建。该人工骨传导作用强、孔隙率高、孔隙交通好、生物相容性好，有利于骨细胞生长，且其中的胶原在被机体降解吸收的过程中，为骨细胞的长入不断腾出空间。