专利名称：纹枯病抗性评估方法纹枯病是我国冬麦区的重要病害之一，小麦不同生育阶段均可受害，在长江流域及黄淮平原麦区普遍发生。近年来，耕作制度和气候的变化以及感病品种的大面积应用，使得小麦纹枯病的危害面积迅速扩大。一般病田损失产量为10% -15%，严重田块损失可达30%-40%，甚至更高，成为影响小麦高产、稳产的重大障碍。因此抗纹枯病育种以及筛选我国现有的抗性种质对产量的提高具有重要的意义。 目前，小麦纹枯病抗性鉴定的时期主要包括温室苗期、成株期及大田成株期，主要的抗性鉴定方法有自然病圃鉴定和人工接菌鉴定两种，自然病圃鉴定依赖于当年病菌本身的数量、病害发生的环境，如果环境不利于病害的发生或病菌较少，就会导致材料不出现病斑而无法抗性鉴定的情況。人工接菌鉴定法有牙签接种法、表土接种法、播种沟撒病麦粒法3种。非专利文献ー种新的小麦纹枯病抗性苗期鉴定评价方法(任丽娟，姚金保，陈萍等.江苏农业科学，2009，5 :131-133.)报道了一种新的小麦纹枯病抗性苗期鉴定评价方法，它采用牙签接种法在小麦温室苗期进行抗性鉴定，其在小麦3-4叶期进行接种用消毒镊子夹取有菌的牙签，轻轻地嵌入麦苗茎杆与叶鞘内，每个叶鞘嵌入I个有菌牙签，每个品种(系)接种20个单株。其在接种处缠绕浸湿的医用脱脂棉球，并用双层遮阳网覆盖，通过弥雾器使接种幼苗在近100%的相対湿度下保持48h，然后去除遮阳网，幼苗正常生长管理，每天喷水I次；在接种30d后调查病级数，然后计算病情指数。非专利文献小麦抗纹枯病种质创新及QTL定位的初步研究(蔡士宾，任丽娟，颜伟等冲国农业科学，2006，39 (5) =928-934.)在研究小麦纹枯病基因定位时，利用播种沟土壤接菌法进行种质的抗性鉴定，其将纹枯菌在煮熟的麦粒上培养，待麦粒表面长满菌丝后待用。小麦播种开行后，先将培养好的带菌麦粒均匀撒与播种沟内，每平方米接种带菌麦粒3g，后播种试验材料，再覆土、保湿3-5d，在乳熟期分0-4级调查纹枯病病级。采用人工接种鉴定法，不管是在温室还是大田，都需要占用土地资源，接种后需要进行喷水保湿措施，因此抗性鉴定准确与否受到保湿措施、接种效果、环境等因素的限制，也容易发生所有材料均不表现出病斑的情况导致抗性无法确定的情况；接种到病害发生需要ー个月以上的时间，鉴定时间长；鉴定时由技术人员操作，不同人之间存在评价标准不统一，产生误差。由于在鉴定时有时间限制且工作量大，需要很多人员同时展开エ作，消耗大量的人力物力。综上所述，现有的纹枯病抗性鉴定方法的准确性受环境因素的影响，鉴定所需时间长，人为因素误差大，并且需耗费大量的人力物力。
(一 )要解决的技术问题本发明要解决的技术问题是提供一种纹枯病抗性评估方法，其能够缩短植物纹枯病抗性鉴定的时间，且其准确性不受环境等不确定因素的影响，同时可节省大量的人力物力。( ニ)技术方案为解决上述问题，本发明提供了一种纹枯病抗性评估方法，包括以下步骤A :选取具有不同纹枯病抗性的小麦萌发期的种子，并采用染有纹枯病菌的种子对选取的部分种子进行侵染，将其余部分种子作为对照种子；B:在不破坏种子细胞和组织的情况下，采用非损伤性扫描离子选择电极技术检测对照种子和受侵染的待测种子的胚根处的Ca2+离子电压差；C :根据所测Ca2+离子电压差计算所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向及流速；D :若所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向始終保持外流，则该待测种子为感病品种，若所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向始終保持内流，则该待测种子为抗病品种。优选地，所述步骤A中，选取具有不同纹枯病抗性的小麦萌发期种子将种子消毒、浸种催芽后，挑选露白一致的种子。优选地，所述步骤B进ー步包括在距离种子胚根表面预定距离处垂直测量两点之间的电压差，并将两点之间的电压差換算成离子浓度差。优选地，所述步骤B还包括使Ca2+选择性微电极前端灌充Ca2+离子的液态交换剂液柱，后端灌充电解液柱，将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。优选地，所述步骤C中，计算所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向，进ー步包括根据菲克第一扩散定律J0 = -D · dc/dx判断Ca2+离子的流向,其中，dc为待测种子的胚根处两点间的Ca2+离子浓度差，dx为采用非损伤性扫描离子选择电极技术检测待测种子的胚根处的Ca2+离子电压差时电极的移动距离，D为离子扩散常数。(三)有益效果本发明纹枯病抗性评估方法通过在种子萌发阶段采用非损伤性扫描离子选择电极技术检测受纹枯病菌侵染种子的胚根处的Ca2+离子浓度差，进而推算种子的Ca2+的流向，以此为依据进行小麦种子的纹枯病抗性评估，本发明能够有效地进行纹枯病抗性的鉴定，本发明只需选取品种的几粒种子在实验室进行检测，便可实现对小麦品种纹枯抗性的快速评估，节省了品种、土地资源，降低了人工消耗，同时缩短了抗性鉴定的时间，并不受环境等不确定因素的影响。图I为本发明实施方式中所述纹枯病抗性评估方法的流程图；图2为本发明实施方式中所述山红麦、CI12633、西凤、百农64、宁麦8号、豫麦49对照与接种两种情况下种子胚根Ca2+离子流速变化示意图；图3为本发明实施方式中所述山红麦、CI12633、西凤、百农64、宁麦8号、豫麦49对照与接种两种情况下种子胚根Ca2+平均离子流速图。
下面结合附图和实施例，对本发明的
作进ー步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。钙离子作为重要的第二信使，參与调节细胞众多的生理和病理过程。研究表明，钙信使系统參与植物抗病性表达过程，钙离子进入细胞和胞外也是高等植物对病原侵染的早期反应之一。专著《植物诱导抗病性原理和研究》认为大麦对霜霉病的抗性表现出与细胞间钙离子的浓度有很大的相关性。非专利文献(关春蕾，侯春燕，王冬梅.影响Ca2+代谢和钙通道的药物对小麦受叶锈菌侵染后诱发的HR的作用.河北农业大学学报，2006，29 (6)4-8.)研究表明胞内Ca2+浓度升高可能是诱发小麦叶片发生过敏反应所必需的，Ca2+在小麦抵抗叶锈菌侵染的信号传导途径中可能发挥重要作用。非损伤性扫描离子选择电极技术(scanning ion-selective electrode technique, SIET)是一种选择性离子/ 分子微电极技术，在电脑自动控制下，利用选择性微电极，在不接触被测样品的情况下获得进出样品的各种分子/离子的浓度(mM级)、流速(10-12mol ^nT2)及其三维运动方向的信息。因 此在给小麦种子接种纹枯病菌后，利用非损伤性扫描离子选择电极技术检测Ca2+的流动情况，可以判断出小麦材料的纹枯病抗性。如图I所示，本发明所述的纹枯病抗性评估方法，包括以下步骤A :选取具有不同纹枯病抗性的小麦萌发期的种子，并采用染有纹枯病菌的种子对选取的部分种子进行侵染，将其余部分种子作为对照种子；步骤A中，选取具有不同纹枯病抗性的小麦萌发期种子将种子消毒、浸种催芽后，挑选露白一致的种子。例如可将抗病品种山红麦、西凤、CI12633 ;感病品种扬麦15、豫麦49、百农64共6个品种用3%次氯酸钠消毒5分钟，在培养箱分别浸种催芽24小时后，挑选露白一致的种子，置于铺有单层滤纸的发芽盒中生长，对照盒放置25粒种子，接种盒中放置25粒种子的同时，每粒种子边上放置I粒纹枯病麦粒进行侵染，侵染24小时后分别检测对照以及接种种子的Ca2+进出情況。B:在不破坏种子细胞和组织的情况下，采用非损伤性扫描离子选择电极技术检测对照种子和受侵染的待测种子的胚根处的Ca2+离子电压差；本发明所述方法以扫描离子选择性微电极技术动态检测，获取进出样品的Ca2+离子浓度(禮级)、流速及三维运动方向的信息。在Ca2+选择性微电极前端灌充20 μ mCa2+离子的液态交换剂(LIX)液柱，后端灌充有15-20mm左右的电解液柱(IOOmM CaCl)，将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。其中，參比电极为固体电极。在测量前Ih将种子转移到测试盒中，测试液成分采用O. ImMCaCl2，测量位点为种子胚根，在距离胚根表面10 μ m处垂直测量两点电压差,此时电极两点移动距离30 μ m。稳定测量IOmin后，对照与接种处理5次重复。C :根据所测Ca2+离子电压差计算所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向及流速；Ca2+离子选择性微电极在待测离子浓度梯度中以已知距离dx进行两点測量，获得电压Vl和V2，利用已知的该电极的电压/浓度校正曲线将两点之间电压差換算成离子浓度差dc,将它们代入Ficks第一扩散定律JO = -D *dc/dx (10_12mol/cm2 *s)可获得该离子的流速和运动方向，其中，D为离子扩散常数，Jtl为扩散通量。在净离子流的计算过程中，认为根离子流符合圆柱扩散几何模型。流速的换算使用Mageflux软件(Younger USA Sci. &Tech.Corp.，USA)完成。由图2可知，在未用纹枯病菌接种的情况下(对照)，山红麦、CI12633、西凤、百农64、宁麦8号、豫麦49共6个品种的种子胚根处Ca2+流速均为负值，平均流速分别为_8O. I>-36. 5、_35· 3、_63· 4、_21· 3、_12· 4pmoI. cm 2· s 1 (见图 3),大于 _90pmol. cm 2· s 1,且震荡幅度较小。而接种纹枯病菌后，抗病品种一山红麦、CI12633、西凤种子胚根处Ca2+流速仍均为负值(图2)，平均流速分别为-133. 6、-253. 3、-94. lpmol. cm_2· s_H见图3)，与各自的对照相比，Ca2+流向不变，流速明显增大，表现出更强的Ca2+内吸；而感病品种-百农64、宁麦8号、豫麦49种子胚根 处Ca2+流速表现为正值(见图2)，平均流速分别为148.6、136. 1、67. 6pmol. cnT2. S、见图3),与各自的对照相比,Ca2+的流向由内吸转为外排,差值可达 80pmol. cm 2. s 1 以上。D :若所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向始終保持外流，则该待测种子为感病品种，若所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向始終保持内流，则该待测种子为抗病品种。由实验数据(图2、图3)可以得出在纹枯病菌胁迫下，抗病品种一山红麦、Cl 12633、西凤Ca2+流向不变，且流速増大，可能是快速吸收Ca2+，使得胞内Ca2+浓度升高来诱导抗病反应的发生，而感病品种则表现为Ca2+外排，可能是因为病菌给种子造成了很大的伤害，使得无法吸收Ca2+。由此得出，具有不同纹枯病抗性的品种在感染纹枯病后，表现出不同的Ca2+进出情况，据此规律可对小麦品种进行纹枯病抗性的评估。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。


本发明公开了一种纹枯病抗性评估方法，包括以下步骤A选取具有不同纹枯病抗性的小麦萌发期的种子，并采用染有纹枯病菌的种子对选取的部分种子进行侵染，将其余种子作为对照种子；B在不破坏种子细胞和组织的情况下，采用非损伤性扫描离子选择电极技术检测对照种子和受侵染的待测种子的胚根处的Ca2+离子电压差；C根据所测Ca2+离子电压差计算所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向及流速；D若所述待测种子的胚根处的Ca2+的流向始终保持外流，则该待测种子为感病品种，若所述待测种子胚根处的Ca2+的流向始终保持内流，则该待测种子为抗病品种。本发明能缩短小麦纹枯病抗性鉴定时间，且其准确性不受环境等不确定因素的影响，同时可节省大量的人力物力。