一种新型的纳米生物陶瓷涂敷的人工韧带及其制备方法[0002]前交叉韧带(ACL)损伤后很难自愈，且保守治疗无效，功能恢复不完全，运动员重返赛场后十分容易反复再伤。ACL损伤的治疗是国内外运动医学研究的热点和难点。目前，ACL重建手术是治疗ACL损伤的主要方法，术后可恢复膝关节的稳定性[I]。ACL重建移植物选择包括自体肌腱、异体肌腱以及人工韧带。自体肌腱移植物应用较广泛，但存在肌腱供区损害、延迟康复锻炼及重建翻修术移植物来源缺乏等问题。同种异体肌腱移植物，虽然避免牺牲自体肌腱组织，但是来源越来越困难，存在疾病传播以及免疫排异反应等风险[2]。由于自体肌腱和同种异体肌腱存在上述缺点，外科医生及科研工作者试图研究出一种理想化的具备高强度及生物相容性的人工韧带，作为移植物用于重建ACL手术。为了解决这个问题，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带被用于作为ACL重建移植物。然而，LARS韧带重建ACL术后，最突出的问题是“移植物骨愈合不良”。移植物骨愈合需要移植物骨界面上疤痕组织减少以及新骨生成，达到移植物骨紧密贴合，从而保证移植物在骨道内的稳定性。目前还没有组织学研究证实LARS韧带重建ACL术后能够有效地诱导骨组织长入骨道内的人工韧带[3]。人工韧带尚未解决人工韧带移植物与骨道牢固愈合的问题。因此，加速和促进移植物骨愈合对PET人工韧带重建ACL手术的成败意义重大。PET人工韧带移植物骨愈合不良最主要的原因是因为材料表面疏水性以及缺乏相应生物活性，不利于成骨细胞在材料表面的黏附、增殖和分化，以及移植物骨界面上成骨。为了解决这个问题，近年来，研究者采用不同的生物相容性或生物活性材料涂层修饰PET人工韧带来促进移植物骨愈合，主要包括羟基磷灰石、生物活性玻璃、有机高分子等[4，5]。然而目前的PET人工韧带涂层研究主要存在的问题:(1)涂层方法单一，涂层不均匀、稳定性较差、实验结果可重复性较差；(2)涂层效果较慢，移植物骨 愈合不太理想；(3)缺乏相关不同涂层厚度、结晶度及晶粒大小对于体外细胞及体内成骨影响。因此，如果能运用一种新的方法均匀稳定地将生物活性材料涂敷于PET人工韧带表面，来提高移植物表面的生物活性促进成骨，并且通过调控涂层的参数来提高涂层的生物学性能，那么对于选择最佳涂层方案解决人工韧带移植物骨愈合不良问题将起到非常重要的作用。先前的研究表明，近年来，脉冲激光技术(PLD)被广泛应用于材料制备中[6]。Ca-Mg-Si体系陶瓷，比如说镁黄长石(Akermanite, AKT),是一种含钙、镁、硅的生物陶瓷，具有优异的骨诱导能力，被广泛应用骨组织工程中[7]。[0003]参考文献1.LevyBA.1s early reconstruction necessary for all anterior cruciateligament tears?N Engl J Med2010，363，386-388.2.Hu J，Qu J，Xu D，Zhou J，Lu H.Allograft versus autograft for anteriorcruciate ligament recon struction:an up-to-date meta-analysis of prospectivestudies.1nt 0rthop2013, 37，311-320.3.韩增斌，郭秀程，徐栋.人工韧带与骨界面结合的实验研究.中国矫形外科杂志2009，17，1407-1410.4.Li H，Ge Y, Wu Y，Jiang Jj Gao K，Zhang P, Wu Lj Chen S.Hydroxyapatite coatingenhances polyethylene terephthalate artificial ligament graft osseointegrationin the bone tunnel.1nt 0rthop2011，35，1561-1567.5.Li H，Chen Sj Wu Y，Jiang J，Ge Y，Gao K，Zhang Pj Wu L.Enhancement of theosseointegration of a polyethylene terephthalate artificial ligament graft ina bone tunnel using58S bioglass.1nt 0rthop2012，36，191-197.6.Eisenhawer B，Sivakov V，Christiansen S，Falk F.A time-resolvednumerical study of the vapor-liquid-solid growth kinetics describing theinitial nucleation phase as well as pulsed deposition processes.NanoLett2013, 13,873-883.7.Gu H，Guo F，Zhou X，Gong L，Zhang Y，Zhai W，Chen L，Cen Lj Yin S，Chang J，CuiL The stimulation of osteogenic differentiation of human adipose-derived stemcells by ionic products from akermanite dissolution via activation of the ERKpathway.Biomaterials2011, 32，7023-7033.。
[0005]在此，一方面，本发明提供一种纳米生物陶瓷涂敷的人工韧带，包括人工韧带和均匀涂敷在所述人工韧带表面的Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层，所述Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层的陶瓷颗粒的粒径为20~80nm。[0006]本发明中，通过在人工韧带表面涂敷Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层，可以借助于Ca-Mg-Si生物陶瓷的优异的骨诱导能力，使涂敷有该涂层的人工韧带具有良好的生物活性、成骨性和移植物骨愈合性等多功能特性，成为一种新型的具有生物活性的移植物材料。又，通过使Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层的陶瓷颗粒的粒径为纳米级别，更有利于成骨细胞在材料表面的黏附、增殖和分化、以及移植物骨界面上成骨。
[0007]较佳地，所述Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层的厚度为20~IOOnm。
[0008]较佳地，所述Ca-Mg-Si生物陶瓷为镁黄长石生物陶瓷、白硅钙石生物陶瓷、透灰石和镁蔷薇辉石生物陶瓷。
[0009]较佳地，所述Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层通过脉冲激光沉积法制得。这样的Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层涂敷均匀、结构稳定，有利于提高其生物活性。
[0010]较佳地，所述人工韧带为聚对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带。
[0011]另一方面，本发明还提供上述纳米生物陶瓷涂敷的人工韧带的制备方法，包括:利用脉冲激光沉积法，以Ca-Mg-Si陶瓷为靶材，在人工韧带表面沉积Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层。
[0012]本发明中，通过采用脉冲激光沉积法，可以制得涂层均匀、稳定性好的Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层，从而使制得的纳米生物陶瓷涂敷的人工韧带具有更好的生物活性。而且该方法工艺简单、参数易于控制、可重复性好。另外，可以通过控制工艺参数来控制涂层厚度、结晶度及晶粒大小等。
[0013]较佳地，所述Ca-Mg-Si陶瓷的制备包括如下步骤:按Ca-Mg-Si陶瓷的化学计量比称取正硅酸乙酯、可溶性钙盐和可溶性镁盐为原料，经溶胶凝胶法制得干凝胶；以及将所得干凝胶在1000~1400°C下煅烧得到Ca-Mg-Si陶瓷。通过采用溶胶凝胶法，可以易于获得质量优良的Ca-Mg-Si陶瓷以作为靶材。
[0014]较佳地，所述脉冲激光沉积法的工艺参数包括:激光器频率5~20Hz，气氛压强为5~30Pa，沉积温度为25~100°C，基体与靶材之间的距离为5~10cm，激光束与靶材表面成30~60度角，沉积时间5~40分钟。
[0015]本发明中，通过调控沉积温度、气氛压强、靶基距以及沉积时间，可以控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。
[0016]较佳地，述工艺参数还包括:沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷以1000~3000r/hr的速度旋转。借助于此，可以提高沉积薄膜的均匀性以及防止靶材被击穿。
[0017]本发明通过脉冲激光沉积方法制备了纳米生物陶瓷涂层的人工韧带，具有工艺比较简单，条件易于控制等优点。而含纳米生物陶瓷的人工韧带用作人体韧带移植物材料具有良好的生物活性、成骨性和移植物骨愈合性等多功能特性。因此，本发明制备的纳米生物陶瓷涂层的人工韧带具有很强的实用意义。



[0018]图1为生物 陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET) (b、d)及无涂层PET人工韧带的SEM图(a、c)，其中(a)、(b)分别为(c)、(d)的局部放大图，表明生物陶瓷颗粒大小为纳米级别；
图2为生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)及无涂层PET人工韧带的XRD图；
图3为生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET) Cf)及无涂层PET人工韧带(e)的EDS图；图4为兔的骨髓基质干细胞在生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)及无涂层PET人工韧带的生长增殖情况；
图5为兔的骨髓基质干细胞粘附在生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)及无涂层PET人工韧带上。PET (a, c,e), AKT-PET (b, d, f) ;1 天(a，b)，3 天(c, d) ； (e)和(f)是高放大倍数扫描电镜图；
图6为兔骨髓间充质干细胞在空白PET韧带组及生物陶瓷涂层组(AKT-PET)表面培养基因表达情况(Real time-PCR): (a)碱性磷酸酶(ALP) ； (b)骨桥蛋白(OPN) ；(c) Runx2 ；(d)血管内皮生长因子(VEGF)；
图7为生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)及无涂层PET人工韧带的植入胫骨骨隧道后隧道情况；
图8为生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)及无涂层PET人工韧带的生物力学性能；
图9为组织学图片显示移植物骨愈合情况，无涂层PET人工韧带(a，b，c)以及生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET) (d, e, f)。

[0020]本发明一方面提供一种纳米生物陶瓷涂敷的人工韧带，其包括人工韧带和均匀涂敷在所述人工韧带表面的Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层。图1示出本发明一个示例的生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)(b、d)及无涂层PET人工韧带的SEM图(a、c)。如图1所示，AKT-PET中的生物陶瓷涂层颗粒大小为纳米级别，例如为20~80nm。生物陶瓷涂层的厚度为20~IOOnm0
[0021]本发明中，所述的Ca-Mg-Si生物陶瓷是含有Ca、Mg和Si的三元组分的陶瓷，包括但不限于镁黄长石生物陶瓷、白硅钙石生物陶瓷、透灰石生物陶瓷、镁蔷薇辉石。
[0022]在一个优选的示例中，所述的Ca-Mg-Si生物陶瓷通过脉冲激光沉积法制得。由此可以使Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层涂敷均匀、结构稳定，有利于提高其生物活性。[0023]本发明中的人工韧带包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带。此外，应理解，作为被涂覆生物陶瓷涂层的基体，不限于人工韧带，也可以是其它需要具有成骨性和/或骨愈合性的移植物材料，例如骨、软骨、牙齿等的组织修复材料。
[0024]图2示出生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)及无涂层PET人工韧带的XRD图，由图2可知，涂层的PET和纯的PET没有显著差异，意味着生成的陶瓷涂层为无定型相。图3示出生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET) (f)及无涂层PET人工韧带(e)的EDS图，由图3可知，AKT-PET中含有C、O、Ca、Mg、Si元素，说明其含有PET人工韧带和Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层。
[0025]通过在人工韧带表面涂敷Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层，可以借助于Ca-Mg-Si生物陶瓷的优异的骨诱导能力，使涂敷有该涂层的人工韧带具有良好的生物活性、成骨性和移植物骨愈合性等多功能特性(参见后述的生物活性测试)，可以成为一种新型的具有生物活性的移植物材料。又，通过使Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层的陶瓷颗粒的粒径为纳米级别，更有利于成骨细胞在材料表面的黏附、增殖和分化、以及移植物骨界面上成骨。
[0026]本发明另一方面提供上述纳米生物陶瓷涂敷的人工韧带的制备方法，利用脉冲激光沉积法，以Ca-Mg-Si陶瓷为靶材，在人工韧带表面沉积Ca-Mg-Si生物陶瓷涂层。
[0027]作为靶材的Ca-Mg-Si陶瓷可以通过溶胶凝胶法制备。在一个示例中，按Ca-Mg-Si陶瓷的化学计量比称取正硅酸乙酯、可溶性钙盐和可溶性镁盐为原料，经溶胶凝胶法制得干凝胶；以及将所得干凝胶在1000~1400°C下煅烧得到Ca-Mg-Si陶瓷。其中可溶性钙盐包括但不限于硝酸钙、氯化钙等。可溶性镁盐包括但不限于硝酸镁、氯化镁等。
[0028]在脉冲激光沉积法中，例如可以采用KrF激光器(波长248nm，脉冲宽度20ns)。激光器频率可为5~20Hz。基体与靶材之间的距离可为5~10cm。激光束与靶材表面可成30~60度角。气氛压强可为5~30Pa。沉积温度可为25~100°C。沉积时间可为5~40分钟。可以通过调控沉积温度、气氛压强、靶基距、以及沉积时间来控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。为提高沉积薄膜的均匀性以及防止靶材被击穿，沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷可以1000~3000r/hr的速度旋转。
[0029]以下，作为示例，说明本发明的一个实施方式。
[0030]1.激光脉冲沉积法制备生物陶瓷AKT涂层及表征
试验用脉冲激光沉积薄膜的基体材料为PET人工韧带材料，其来源为LARS (SurgicalImplants and Devices, Arc-sur-Tille, France)人工韧带术后剩余残端。米用75%酒精超声清洗10分钟，然后至于60度高温烘干过夜。在超净工作台环境下将韧带剪为3cmX3cm正方形，密封包装。
[0031]用于脉冲激光沉积薄膜的靶材为Ca-Mg-Si体系陶瓷。采用正硅酸乙酯(TEOS)、四水合硝酸钙[Ca(NO3)2.4Η20]和六水合硝酸镁[Mg(NO3)2.6Η20]为原料，经溶胶、凝胶、陈化、干燥等过程，并在1300°C下煅烧得到纯的Ca-Mg-Si陶瓷粉体。
[0032]实验采用KrF激光器(波长248nm，脉冲宽度20ns)。激光器频率5_10Hz，人工韧带与陶瓷靶材之间的距离为5-lOcm，激光束与靶材表面成30-60度角。为提高沉积薄膜的均匀性以及防止靶材被击穿，沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷以2400r/hr的速度旋转。采用分子泵对沉积室抽真空到20Pa，使用机械泵控制其压强。本试验主要通过调控沉积温度(室温)、气氛压强(20Pa)、靶基距(5-lOcm)以及沉积时间(5_40分钟)来控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。
[0033]所获得的涂层通过广角X-射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)、能谱分析(EDS)及原子力显微镜(AFM)等对涂层材料的物相组成、表面微观结构进行分析与表征。参见图1~3，可知生物陶瓷AKT涂层涂敷于PET人工韧带材料表面，生物陶瓷颗粒大小为纳米级别。制得的材料中含有C、O、Ca、Mg、Si元素。
[0034]2.兔骨髓基质干细胞的培养及在移植物表面的粘附、增殖、分化及骨相关基因表达的影响及其相关机理
2.1兔子BMSC的分离和培养
一月龄新西兰兔(上海斯莱克实验动物有限公司)，用戊巴比妥麻醉；使用骨髓穿刺针进行股骨穿刺，抽取约 0.5mL骨髓；将0.5mL骨髓转移至IOmL离心管；使用添加10%FBS的DMEM培养基将离心管中细胞液补至10ml，离心5分钟，收集沉淀；使用IOml完全培养基重选细胞，接种细胞到96孔细胞培养板，正常条件(37°C和5%C02)培养，命名细胞为Pl代。显微镜观察可见大量的圆形细胞；正常培养3d后使用IOml DMEM+10%FBS的完全培养液对细胞进行换液，镜下观察，可见梭形细胞、圆形有突起细胞、圆形细胞，继续培养；换液后培养5d，镜下观察，有梭型细胞成聚集状生长，皿底有多个克隆斑生成；使用胰酶消化的方法，对细胞进行1/2传代处理，传代后细胞命名为P2代，传代后继续培养；传代后P2代细胞培养48小时，镜下观察细胞梭型，细胞中央饱满且有突起状，生长均匀。
[0035]2.2CCK-8检测细胞活性
接种后正常条件培养，并于ld、3d、7d取各组材料各5块，CCK-8法检测细胞活性:实验前，剪取材料成“ IcmX I cm”大小，放入24孔细胞培养板(每孔添加500 μ I无血清DMEM培养基)缓慢漂洗，去除材料表面残留的未贴附生长的细胞；将洗好的材料重新放入新的96孔板(每孔预先加入100 μ I无血清的MEM培养基)；每孔加入10 μ I的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)；将培养板在培养箱内(37°C和5%C02浓度)孵育4小时；然后将96孔培养板中液体转移至另一个96孔板；上机，使用酶标仪测定在450nm处的吸光度；数据分析。结果参见图4、5，可知兔的骨髓基质干细胞在生物陶瓷涂层人工韧带(AKT-PET)黏附生长增殖情况优于无涂层PET人工韧带。表明通过在人工韧带表面涂敷生物陶瓷涂层可以有利于成骨细胞在其表面的黏附、增殖和分化。
[0036]2.3Real Time-PCR 检测细胞样本主要检测相关成骨基因(RUNX2，0PN)及成血管化基因(VEGF，HIF_la)。简要步骤如下:样本处理；细胞样品Total RNA的抽提；用逆转录酶Reverse TranscriptaseM-MLV (D2640A，Takara)进行逆转录合成cDNA ;Real time PCR扩增体系和反应条件；数据分析。结果参见图6，可知相较于无涂层PET韧带，AKT-PET更能促进碱性磷酸酶(ALP)、相关的成骨基因(如RUNX2、0PN)、及成血管化基因(VEGF，HIF-1a)的表达。
[0037]3.山羊前交叉韧带重建实验
所有动物饲养在大学动物实验室，严格按照国家实验动物饲养及使用条例执行。实验采用48只成年雄性山羊，每只山羊行右膝关节前交叉韧带重建模型手术。共分为两组(PET人工韧带移植物组，AKT-PET人工韧带移植物组)，每组24只。采用盐酸氯胺酮(5mg/kg)肌注麻醉，然后采用戊巴比妥(25mg/kg)静脉麻醉。麻醉成功后，仰卧位置于手术台上。在膝关节区域，备皮及消毒后，沿膝关节中线外侧行IOcm长纵行切口，逐层分离，暴露前交叉韧带。然后完整切除ACL，于ACL在股骨与胫骨止点分别钻取直径5mm股骨与胫骨隧道。将移植物自由端由内向外拉入骨隧道。分别在隧道口对韧带残端进行栓桩固定。冲洗，逐层缝合，关闭伤口。术后，放入笼中，允许活动。于6周及3月时每组分别处死12只，切取标本作检测。
[0038]3.1Micro-CT 扫描
在进行生物力学测试前，标本可先进行micro-CT扫描(Siemens Inveon Micro PET/CTscanner (Siemens Medical Solution, Germany),扫描参数如下:voltage=80kV, current=5OOuA, exposure time=800ms, binning=2, F0V=61.05mmX 40.70mm。在后处理器软件上米用直径3mm高5mm的圆柱形感兴趣区域(ROI)来计量骨隧道内的新生骨量。结果参见图7，可知相较于无涂层PET韧带，AKT-PET更能促进新骨生成。
[0039]3.2生物力学检查
动物处死后，切取移植物 标本，保留骨道端长度lcm。放入液氮罐中，-30度保存。力学检测前，室温下解冻24小时。生物力学试验采用Instron (8874)材料测试器(InstronC0.USA)ο将移植物固定到特定固定夹。采用20N拉力预牵拉5分钟。然后以2mm/min的拉伸速度牵拉直至韧带拉出或拉断。记录拉伸-形变曲线及终止状态(拉出或拉断)，计算最大拉力强度及弹性模量。结果参见图8，可知相较于无涂层PET韧带，AKT-PET的最大拉力强度更大，具有更好的生物力学性能。
[0040]3.3组织学分析
动物处死后，切取下移植物标本，放入10%福尔马林液48小时。然后采用EDTA脱钙处理，石蜡包埋，采用RM2155切片机(Leica，Germany)平行于骨隧道方向切取5 μ m厚切片。采用HE染色，Masson染色以及天狼星红染色作组织学检查。采用奥林巴斯倒置显微镜(IX71SBF-2,Olympus C0., Japan)观察移植物骨界面情况。DP Manager (Olympus OpticalC0.,Japan)进行拍照。结果参见图8，可知相较于无涂层PET韧带，AKT-PET的骨愈合能力更强。
[0041]由以上测试可知，本发明的纳米生物陶瓷涂敷的人工韧带有利于成骨细胞在其表面的黏附、增殖和分化，能够促进碱性磷酸酶(ALP)、相关的成骨基因(如RUNX2、0ΡΝ)、及成血管化基因(VEGF，HIF-1a)的表达，促进新骨生成，并具有优异的骨愈合能力，此外还具有良好的生物力学性能，因此可以用作新型的生物活性植入材料。[0042]下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0043]实例1:
实验采用KrF激光器(波长248nm，脉冲宽度20ns)。激光器频率5Hz，人工韧带与陶瓷靶材之间的距离为5.5cm，激光束与靶材表面成45度角。为提高沉积薄膜的均匀性以及防止靶材被击穿，沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷以2400r/hr的速度旋转采用分子泵对沉积室抽真空到20Pa，使用机械泵控制其压强。本试验主要通过调控沉积温度(室温)、气氛压强(20Pa)、靶基距(5.5cm)以及沉积时间(40分钟)来控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。然后进行材料表征、成血管化、成骨性、和移植物骨愈合性能研究。
[0044]实例2:
实验采用KrF激光器(波长248nm，脉冲宽度20ns)。激光器频率6Hz，人工韧带与陶瓷靶材之间的距离为6cm，激光束与靶材表面成30度角。为提高沉积薄膜的均匀性以及防止革G材被击穿，沉积过程中Ca-Mg-Si陶瓷以2400r/hr的速度旋转米用分子泵对沉积室抽真空到20Pa，使用机械泵控制其压强。本试验主要通过调控沉积温度(室温)、气氛压强(20Pa)、靶基距(6cm)以及沉积时间(10分钟)来控制涂层的厚度、结晶度及晶粒大小。