技术领域
本发明涉及减少食物中生物胺的含量的方法更具体而言，本发明涉及在低蛋白食物例如饮料像葡萄酒(Wine)和啤酒中减少生物胺的方法甚至更具体而言，本发明涉及使用具有转谷氨酰胺酶活性的酶在低蛋白食物例如饮料像葡萄酒和啤酒中减少生物胺的含量发明背景生物胺是一组有机含氮化合物它们通常由活生物体的代谢形成和降解它们可天然存在或通过氨基酸的脱羧或通过醛和酮的胺化和氨基交换形成在低浓度，生物胺，特别是在体内内源产生的那些，对于许多生理功能例如调节体温、胃容量、胃pH、脑活动等是必需的然而，已显示食用含有高浓度的生物胺的食物引起一些不良反应，如头疼，低或高血压，恶心，心悸，和在严重情况下甚至是死亡当有利于微生物或生化活性的条件持续时，生物胺可能会在含有蛋白质或游离氨基酸的食物和饮料中形成此类食物和饮料的实例包括但不限于鱼、鱼类产品、肉类产品(香肠)、蛋、奶酪、发酵乳制品、巧克力、坚果、发酵的和新鲜的果实、蔬菜如德国泡菜 (sauerkraut)和豆制品包括酱油、啤酒和葡萄酒因此，认为食物中生物胺的存在和浓度与腐败和发酵，特别是由微生物造成的腐败和发酵相关已知啤酒和葡萄酒以不同量和组成含有许多不同生物胺组胺、酪胺、腐胺、异戊胺(isopentylamine)和β -苯乙胺为葡萄酒中一些常见的生物胺人体具有特定酶如例如二胺氧化酶(DAO)和单胺氧化酶(MAO)以将食物中低量的生物胺代谢并因此解毒为生理学上活性较低的降解产物然而，当摄入具有高浓度生物胺的食物时，该解毒系统无法充分地消除生物胺而且，在一些人中，当由于多种因素如遗传组成(genetic makeup)、疾病、药物作用等而使这些酶活性不充分时,甚至低量的生物胺也无法得到有效代谢若代谢效率低下，生物胺很容易被肠/消化道(gut)吸收，导致毒性作用因此担心生物胺涉及食物腐败、食物安全和食物不耐受，并必需尽力确保其在食物中的含量尽可能低许多国家正在审阅对于规章框架的提案以封顶食品中生物胺的上限欧盟(EU) 类似地致力于生物胺的规章框架，其旨在将生物胺囊括于与对变应原提出的类似规章之下减少食物中生物胺含量的方法是已知的，例如，已使用胺氧化酶以酶法减少食物中的生物胺含量US4725540公开了用于制备含胺氧化酶材料的工艺和用于代谢食物中的组胺、产生相应的不含组胺的产物的工艺，其中组胺经代谢形成非有害的代谢产物Punakivi等，Talanta68 (2006) 1040-1045公开了用转谷氨酰胺酶酶法确定生物胺的工艺然而，对于减少食物中生物胺含量的更多工艺的需求持续存在发明内容在一个方面，本发明涉及减少饮料中生物胺含量的方法，其包括将所述饮料和/或饮料中间物与转谷氨酰胺酶相接触在另一个方面，本发明涉及转谷氨酰胺酶用于减少饮料中生物胺含量的用途在一个方面，所述转谷氨酰胺酶可从链霉菌属(Streptomyces)获得在一个方面，所述食物是饮料或饮料中间物在一个方面，所述饮料蛋白含量低在一个方面，所述饮料是麦芽汁在另一个方面，所述饮料是含酒精的(alcoholic)在一个方面，所述饮料是葡萄酒在另一个方面，所述饮料是啤酒在一个方面，所述生物胺选自酪胺、组胺及其组合在一个方面，所述接触是在肽结合的谷氨酰胺的存在下进行的在另一个方面，所述接触是在肽结合的谷氨酰胺不存在时进行的在一个方面，在用所述酶处理后减少了至少50%的生物胺在一个方面，所述与酶的接触在PH3. 0至6. 5进行发明详述本发明人发现了一种减少食物，特别是含有低量蛋白质/氨基酸的饮料中生物胺的量的方法本发明人令人意想不到地发现用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理饮料或饮料中间物可减少此类材料中以及通过加工此类食物、中间物或原材料而制成的产物中的生物胺含量因此在一个方面，本发明涉及减少饮料中生物胺含量的方法，其包括将所述饮料和/或饮料中间物与具有转谷氨酰胺酶活性的酶相接触生物胺是一组有机含氮化合物它们通常由活生物体的代谢形成和降解它们通常由氨基酸的脱羧或通过醛和酮的胺化和氨基交换形成它们可内源存在(在生物内部) 或天然存在(在生物体外，从头合成)或可在微生物对食物的代谢后形成生物胺的实例包括但不限于组胺、酪胺、苯乙胺、色胺、腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、丁胺、二甲胺、乙醇胺、 乙胺、己胺、Π引哚、异丙胺、异戊胺、甲胺、2-甲基丁基胺、吗啉、戊胺、哌唆、丙胺、吡咯烷、腐胺和5-轻色胺(serotonine)术语食物包括饮料、饮料中间物和固体食物材料饮料在本领域中是已知的饮料的实例包括但不限于乳，果汁，葡萄酒，啤酒， 例如但不限于由从出芽的谷物或未出芽的谷物或它们的混合物制成的啤酒，爱尔啤酒 (ale)、烈性爱尔啤酒(strong ale)、苦啤酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porter)、陈忙啤酒(lager)、出口啤酒(export beer)、麦芽酒(malt liquor)、大麦啤酒(barley wine)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒 (low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer),朽1 樣汁，麦芽汁，乳相关产品，例如但不限于可可乳(cocoa milk)、全脂乳(whole milk)、全脂乳(full fatted milk))、增香乳(flavoured milk)、均化乳(homogenized milk)、脱脂乳(skimmed milk)、复原乳粉(reconstituted milk powder)、炼乳(condensed milk)、乳清 (whey)、乳清渗透物(whey permeate)、酪乳(butter milk)、发酵乳(fermented milk)、酸 奶(yoghurt)、凝乳(curd)短语“饮料中间物”指在饮料制造过程中形成的材料饮料中间物的实例包括但不 限于麦芽汁、未加工的果汁、未加工的啤酒、未加工的葡萄酒、未加工的乳、发酵的可可豆 有时，饮料中间物本身可食用，在此情况下其亦可为“饮料”在一个方面，所述饮料蛋白含量低蛋白含量低的饮料为具有少于5%，如少于2%， 如少于1%，如少于O. 5%，如少于O. 1%，如少于O. 01%,如少于O. 001%蛋白质w/w的饮料蛋 白含量低的饮料的实例包括但不限于啤酒和葡萄酒在另一个方面，所述饮料是含酒精的含酒精的饮料为含有乙醇的饮料普通的 含酒精的饮料包括啤酒、葡萄酒和烈酒(spirits)啤酒和葡萄酒通过发酵含糖或淀粉的材 料形成烈酒，其具有相对于啤酒和葡萄酒更高的醇含量，是通过发酵继以蒸馏产生的优 选的含酒精的饮料为啤酒和葡萄酒含酒精的饮料亦包括作为普通的含酒精的饮料和非含 酒精的饮料的混合物的含酒精的饮料，例如但不限于啤酒和烈酒的混合物，或者葡萄酒和 烈酒的混合物，或者烈酒和果汁的混合物在一个方面，所述饮料是葡萄酒葡萄酒和葡萄酒酿造(winemaking)在本领域是 已知的葡萄酒酿造，或酿制葡萄酒(vinification)是产生葡萄酒的工艺，以选择葡萄开 始，并以装瓶的葡萄酒产品结束葡萄酒酿造涉及多种工艺，其包括但不限于选择葡萄及其 品种，其收获和去梗，初步粉碎和发酵，后发酵，熟化(maturation),勾兑(blending)和澄 清(fining),过滤,冷稳定化(cold stabilization),和装瓶简言之,通常的葡萄酒酿造工 艺可如下所述选择葡萄，并手动或使用机械收获机收获然后将葡萄一般地粉碎、去梗，并 允许初发酵在初发酵过程中，酵母(其通常已经存在于葡萄上，或作为培养物外源添加) 摄食鲜葡萄汁(must)(果浆)中的糖份，并增殖，产生二氧化碳和醇若需要，亦添加额外 的糖(葡萄汁增糖(chaptalization))在醇发酵工艺的过程中或之后,亦可发生苹果乳 酸发酵，其中苹果酸由细菌转化为乳酸在初发酵之后，使得葡萄酒产品或粗葡萄酒进行后 发酵和熟化过程，其通常花费大约3-6个月，或对于长陈酿葡萄酒(long aging wine)多至 18个月在此阶段中，啤酒在厌氧条件或接近厌氧条件储藏以防止氧化变质在后发酵之 后，亦对葡萄酒进行换桶(rack)以使其与酒泥(Iees)分开换桶(racking)是将葡萄酒 虹吸与酒泥分开置于新的、干净的桶或罐以允许其澄清，并助其稳定化的过程酒泥指死亡 酵母或剩余酵母和其它颗粒的沉积物，其发生沉淀，或在发酵和陈化之后通过“澄清”作用 被带到葡萄酒桶(vat)底部在葡萄酒陈化过程中换桶工艺重复数次在熟化之后的任何 时间，亦可使葡萄酒进行冷稳定化的过程在冷稳定化过程中，葡萄酒的温度下降至接近冻 结I至2周这导致酒石酸晶体与葡萄酒分开，并粘附于装酒容器(holding vessel)的侧 壁上当将葡萄酒从该容器排干时，酒石酸晶体留下来，和/或过滤所述葡萄酒以确保其去 除在蛋白质稳定化过程中，不稳定的蛋白质通过吸附于澄清剂如膨润土上而去除，防止其 在装瓶的葡萄酒中沉淀在后发酵之后，对葡萄酒进行勾兑和澄清在勾兑过程中，将来自 不同批次和/或不同葡萄的葡萄酒混合在一起以获得一致的味道在澄清过程中，使用称 为澄清剂的作用剂去除鞣质/单宁，减少涩味，并去除会使得葡萄酒浑浊的微观颗粒在勾 兑和澄清之后，用防腐剂如二氧化硫和山梨酸钾处理葡萄酒，并进行过滤过滤是由此将颗粒状物质从葡萄酒去除的过程，即，使葡萄酒穿过一系列过滤器在过滤之后，葡萄酒有时 通过O. 65或O. 45微米的膜进行过滤除菌，然后将葡萄酒装瓶并销售在葡萄酒中，生物胺可能来自鲜葡萄汁，它们已存在其中，或可由来自天然菌落的 酵母、添加的酵母在醇发酵过程中形成；或通过参与苹果乳酸发酵的细菌的作用而形成在另一个方面，所述饮料为啤酒啤酒酿造的过程是本领域的技术人员熟知的常 规的步骤可以如下方式概述起始材料是出芽的(即，湿化的、出芽的且随后干燥的)大麦 和/或未出芽的附属物(adjunct)(称为麦芽粉(grist))在制醪/淀粉糖化(mashing) 过程中，将麦芽粉磨碎并与水混合，加热并搅拌，在麦芽中天然存在的酶的帮助下将糖类降 解为可发酵的糖在制醪之后，需要将液体提取物(麦芽汁)与固形物(酒糟颗粒和附属 物)分开以获得澄清的麦芽汁该过程称为过滤麦芽汁(Iautering)在过滤麦芽汁之前， 将醪液温度升至约75-78°C (165-173° F)(称作出醪(mashout))麦芽汁过滤是重要的， 因为固形物富含大量蛋白质，改性不良的淀粉(poorly modified starch),脂肪材料,娃酸 盐，和多酚(鞣质/单宁)以及蛋白质在收集第一麦芽汁之后的酒糟中保留的提取物亦 可通过在过滤饼顶部添加热水来洗出该工艺称为淋洗(sparging)热水流经酒糟并溶解 剩余的提取物稀释的麦芽汁称为第二麦芽汁，且其提取物与第一麦芽汁的起始重力相比 下降至1-2%在添加啤酒花(hop)之后，将麦芽汁煮沸由此将多种物质包括几种蛋白变 性，且会发生多酚的沉淀在冷却和去除沉淀之后，将最终的啤酒麦芽汁(a)通气并添加酵 母在主发酵(通常持续5-10日)之后，去除大部分酵母，并将所谓的新啤酒(green beer) (b)储藏于低温，通常在0-5°C储藏一至12周在此期间，剩余的酵母会与多酚一同沉淀 为了去除剩余的过量多酚，进行了过滤这时，发酵成的啤酒(c)可在装瓶之前碳化二氧 化碳不仅导致感受到的满口感(fullness)和醇厚感(body)并作为增味剂，其还起到增强 起泡潜力的作用，并在延长产品的储藏期限中起重要作用术语“啤酒”用于本文中旨在至少涵盖由如下所制备的啤酒从未出芽的谷物制备 的醪液以及从出芽的谷物制备的所有醪液，还有从出芽的和未出芽的谷物的混合物制备的 所有醪液术语“啤酒”亦涵盖以附属物制备的啤酒，和具有所有可能的醇含量的啤酒在一个方面所述饮料中间物是麦芽汁在另一个方面所述饮料中间物是用于制备麦芽汁的醪液在一个方面，所述生物胺是酪胺酪胺是衍生自氨基酸酪氨酸的生物胺其亦称作4-(2-氨基乙基)苯酚或4-羟基苯乙胺在另一个方面，所述生物胺是组胺组胺是衍生自氨基酸组氨酸的生物胺其亦称作2-(1H-咪唑-4-基)乙胺在本发明的上下文中，具有转谷氨酰胺酶活性的酶可为催化肽结合的谷氨酰胺的 Y-羧基酰胺基团(酰基供体)和伯胺(酰基受体)(例如，肽结合的赖氨酸)之间的酰基 转移的酶游离酸酰胺和氨基酸亦发生反应因此，蛋白质和肽可以此方式交联转谷氨 酰胺酶亦可在例如若缺乏胺时，以H2O作为酰基受体催化蛋白质中谷氨酰胺残基的脱氨基根据本发明的转谷氨酰胺酶亦可称作，例如蛋白质谷氨酰胺-Y-谷氨酰基 转移酶(protein glutamine-gamma-glutamyl transferase),因子 XIIIa,纤维蛋白 连接酶，血纤稳定因子，谷氨酰胺酰基肽Y-谷氨酰基转移酶(glutaminylpeptidegamma-glutamyl transferase)，多月安(polyamine transglutaminase)， Η转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase)或R-谷氨酰胺酰基-肽胺Y _谷氨酰基转移酶(R-glutaminyl-peptide amine gamma-glutamyl transferase)或 TG 酶或甚至“肉胶 (meat glue) ”转谷氨酰胺酶的组包括但不限于分配于亚类EC2. 3. 2. 13的酶转谷氨酰胺酶(EC2. 3. 2. 13)是催化游离胺基团(例如蛋白质或肽结合的赖氨酸) 和蛋白质或肽结合的谷氨酰胺的Y-羧酰胺基团之间的共价键的形成的酶家族肽结合的谷氨酰胺残基的Y-羧酰胺基团充当酰基供体，而蛋白质和肽结合的赖氨酸残基的6-氨基基团充当受体，以获得分子内或分子间的N(6)-(5-谷氨酰基)赖氨酸交联这些酶通常需要钙作为辅因子该酶催化的反应可表示如下蛋白质谷氨酰胺+烃基胺〈=> 蛋白质N (5)-烃基谷氨酰胺+NH3转谷氨酰胺酶可从许多来源获得，包括但不限于Phytophthora cactorum,利迪链霉菌(Streptomyces Iydicus)，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)等具有转谷氨酰胺酶活性的酶亦可为商业上可获得的实例包括但不限于可从 Ajinomoto [Ajinomoto CO. INC. Tokyo, Japan]获得的Activa ，SapronaTG L 可从，例如 Fermenta Pro Food Services, Bratislava, Slovakia 获得]根据本发明使用的转谷氨酰胺酶优选是纯化的术语“纯化的”用于本文中涵盖酶蛋白制备物，其中所述制备物富集所述酶蛋白此种富集可例如为去除产生酶蛋白的生物的细胞，通过蛋白质特异性沉淀或使用层析方法(其中所述酶蛋白选择性吸附于层析基质并从其洗脱)去除非蛋白材料转谷氨酰胺酶可纯化至使得仅少量其它蛋白质存在的程度表述“其它蛋白质”具体指其它酶待用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶可为“基本上纯的”，即基本上不含来自产生该酶的生物的其它组分，所述生物可为天然存在的微生物或用于重组产生转谷氨酰胺酶的遗传修饰的宿主微生物然而，对于根据本发明的用途，所述转谷氨酰胺酶无需那么纯其可例如包含其它酶在一个优选的方面，待用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶已经纯化至在总蛋白质中含有至少20%，优选至少30%，至少40%或至少50%(w/w)的转谷氨酰胺酶转谷氨酰胺酶的量可根据制备物的活性测量结果除以转谷氨酰胺酶的比活性(活性/mg EP)来计算，或可通过SDS-PAGE或本领域中已知的任何其它方法定量总蛋白质的量可例如通过氨基酸分析来测量在本发明的方法的一个实施方案中，具有转谷氨酰胺酶活性的酶是重组产生的 对于本发明的转谷氨酰胺酶的来源和/或对于根据本发明的用途并无任何限制因此，术语转谷氨酰胺酶不仅包括从任何属的微生物获得的天然或野生型转谷氨酰胺酶，而且还包括其呈现转谷氨酰胺酶活性的任何突变体、变体、片段等，以及合成的转谷氨酰胺酶，如改组的转谷氨酰胺酶，和共有的转谷氨酰胺酶(consensus transglutaminase)此类遗传工程的转谷氨酰胺酶可如本领域中一般所知的，例如通过定点诱变，通过PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的一个引物)或通过随机诱变来制备共有蛋白质的制备描述于例如EP897985基因改组一般性描述于例如W095/22625和W096/00343转谷氨酰月安酶基因的重组可通过如 Ness, J. E.等，于 Nature Biotechnology, Vol. 20 (12), pp. 12511255，2002中所述的合成改组(synthetic shuffling)不依赖于亲本的特定序列来完成 设计了在其DNA序列中简并以提供亲本转谷氨酰胺酶组中所见的所有氨基酸可能性的合成的寡核苷酸，并根据参考文献装配基因改组可对于全长序列进行，或仅对于部分序列进行然后再与基因其余部分组合以给出全长序列所述酶可例如从蘑燕属(Agaricus)，例如双孢蘑燕(A. bisporus)； Ascovaginospora ;曲霉属，例如黑曲霉(A. niger)，泡盛曲霉(A. awamori)，臭曲霉 (A. foetidus)，日本曲霉(A. japonicus)，米曲霉(A. oryzae);毛壳菌属(Chaetomium)； Chaetotomastia ;网柄菌属(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌(D. discoideum)； 毛霉属(Mucor)，例如爪睡毛霉(M. javanicus)，高大毛霉(M. mucedo)，细孢毛霉 (M. subtilissimus);脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N. crassa);根毛霉属(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R. pusillus);根霉属(Rhizopus)，例如少根根霉(R. arrhizus)，日本根霉(R. japonicus)，匍枝根霉(R. stolonifer);核盘霉属 (Sclerotinia)，例如白腐核盘霉(S. Iibertiana);毛癣菌属(Trichophyton)，例如红色毛癣菌(T. rubrum);维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如W. sclerotiorum ;芽孢杆菌属，例如巨大芽孢杆菌(B. megaterium)，枯草芽孢杆菌(B. subtilis)，短小芽孢杆菌(B. pumilus)， 嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)，苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis);金黄杆菌属(Chryseobacterium);梓檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如弗氏梓檬酸杆菌 (C. freundii);肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E. aerogenes)，阴沟肠杆菌(E. cloacae);爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华菌(E. tarda);欧文氏菌属 (Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E. herbicola);埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae) ；Miriococcum ； Myrothesium ;毛霉属；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；Phytophthora，例如P. cactorum ;变形菌属(Proteus)，例如普通变形菌(P. vulgaris);普罗维登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗维登斯菌(P. stuartii);密孔菌属(Pycnoporus)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)，血红密孑L 菌(Pycnoporus sanguineus);沙门氏菌属(Salmonella)， 例如鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium);沙雷氏菌属(Serratia)，例如液化沙雷氏菌 (S. Iiquefasciens)，粘质沙雷氏菌(S. marcescens);志贺氏菌属(Shigella)，例如弗氏志贺氏菌(S. f Iexneri);链霉菌属(Streptomyces)，例如抗生链霉菌(S. antibioticus)， 栗色球孢链霉菌(S. castaneoglobisporus)，利迪链霉菌(S. Iydicus)，茂原链霉菌(S. mobaraensis)，紫红链霉菌(S. violeceoruber) ；Streptoverticilium,例如 S. mobaraensis ;栓菌属(Trametes);木霉属(Trichoderma)，例如里氏木霉(T. reesei)， 绿色木霉(T. viride);耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)的菌株获得具有转谷氨酰胺酶活性的酶可单独使用或优选以酶组合物的形式使用此类酶组合物对于本领域技术人员是已知的酶组合物亦可含有其它帮助稳定化酶的稳定剂本发明的组合物可为任何适于所述用途的形式，例如为干粉或颗粒的形式，特别是无尘颗粒的形式，液体形式，特别是稳定化液体的形式，固定化形式，或受保护的酶的形式颗粒可例如如美国专利号4，106，991和美国专利号4，661，452 (两者均授予Novo Industri A/S)中公开的产生，并可任选地通过本领域中已知的方法涂覆液体酶制备物可例如根据公认的方法，通过添加营养学上可接受的稳定剂如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有机酸来稳定化受保护的酶可根据EP238，216中公开的方法来制备—种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是可从链霉菌属(Streptomyces)获得的转谷氨酰胺酶另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是可从茂原链霉菌 (Streptomyces mobaraensis)获得的转谷氨酰胺酶另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是可从利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)获得的转谷氨酰胺酶另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是Activa .另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是具有转谷氨酰胺酶活性的钙非依赖性酶另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是具有半胱氨酸作为活性中心的酶此类酶的实例包括但不限于Activa⑧术语“可从…获得的”如用于本文与给定来源相联应意指由核酸序列编码的多肽是由所述来源产生，或由其中存在来自所述来源的核酸序列的重组细胞(亦称为宿主细胞)产生在一个优选实施方案中，所述多肽分泌至胞外取决于在重组产生方法中采用的宿主，本发明的转谷氨酰胺酶可为糖基化的或可为非糖基化的此外，本发明的转谷氨酰胺酶亦可包括起始的经修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况中作为宿主介导的过程的结果所述宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物可用的宿主细胞是细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，或链霉菌属细胞，或乳酸菌细胞，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E. coli)和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)乳酸菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus),乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属 (Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的菌种其他宿主细胞可为真菌细胞(包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门 (Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由 Hawksworth 等，于 Ainsworth and Bisby，s Dictionary of The Fungi,第八版，1995，CAB International, University Press, Cambridge, UK 中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如 Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi) (Hawksworth 等,1995,见上)在一个方面，所述真菌宿主细胞为酵母细胞“酵母”如用于本文中包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内抱霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽抱纲 (Blastomycetes))的酵母由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，应将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A.，Passmore, S. Μ·，和 Davenport, R. R.编，Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)中所述所述酵母宿主细胞可为假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉属(Yarrowia)细胞所述真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞“丝状真菌”包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)(如由Hawksworth等，1995，见上文,所定义)的所有丝状形式丝状真菌特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它9复杂多糖组成的菌丝体壁通过菌丝延伸进行营养生长，且碳分解代谢是专性需氧的相对而言，酵母如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，且碳分解代谢可为发酵的丝状真菌宿主细胞的实例为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、 镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、 脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属 (Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)菌种的细胞，但不限于此在本发明的产生方法中，使用本领域已知方法在适合于产生所述转谷氨酰胺酶的营养培养基中培养细胞例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备如果转谷氨酰胺酶分泌到营养培养基中，该转谷氨酰胺酶能够从所述培养基中直接回收如果转谷氨酰胺酶不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收所得的具有转谷氨酰胺酶活性的酶可以使用本领域已知的方法回收例如，该酶可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀本发明的具有转谷氨酰胺酶活性的酶可以通过本领域已知的多种方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取 (参见，例如，Protein Purification, J. _C. Janson和 Lars Ryden编，VCH Publishers, New York, 1989)术语“接触”是将饮料或饮料中间物与酶彼此接触或紧邻的过程许多将饮料与酶接触的方法在本领域中是已知的例如，所述酶可添加至饮料或食物中，反之亦然所述酶亦可为固定化的形式，并与饮料/食物相接触在一个方面，所述酶在酿造过程中制醪/淀粉糖化时添加至醪液在另一个方面， 所述酶在过滤麦芽汁时添加至麦芽汁在又一个方面，所述酶在煮浆(mashing off)时添加至醪液在另一个方面，所述酶在装瓶之前添加至啤酒在一个方面，所述酶在酿制葡萄酒过程中添加至鲜葡萄汁在另一个方面，所述酶在发酵过程中添加在另一个方面，所述酶在苹果乳酸发酵过程中添加在另一个方面，所述酶在换桶过程中添加在一个方面，接触是在肽结合的谷氨酰胺存在下进行的术语“肽结合的谷氨酰胺”指含有通过另外的氨基酸或化学残基结合于一侧或任一侧上的谷氨酰胺残基的肽或蛋白质所述肽为至少2个氨基酸残基长，并可为天然的或合成的，并任选地含有其它非天然侧基或端基肽结合的谷氨酰胺的实例是肽 Z-Gln-Gly-ΟΗ,亦称作N-苄氧羰基谷氨酰基-L-甘氨酸，商业上可从Sigma-Aldridr (Sigma-Aldrich, Missouri, USA)获得优选的肽结合的谷氨酰胺为可从食物来源和其它营养学上可接受的来源(例如但不限于大豆，酪蛋白水解物，谷蛋白，或明胶)获得的肽结合的谷氨酰胺在另一个方面，所述接触是在肽结合的谷氨酰胺不存在时进行的在一个方面，通过实施本发明的方法，减少了至少50%的存在于饮料或饮料中间 物或食物中的生物胺该减少是作为在与酶接触之前和之后存在于样品中的生物胺的百分 比来计算的在另一个方面，减少了至少40%，如至少45%，如至少50%，如至少55%，如至少 60%，如至少65%，如至少70%,如至少75%，如至少80%,如至少81%，如至少82%，如至少83%， 如至少84%，如至少85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%,如 至少91%，如至少92%，如至少93%，如至少94%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少 98%，如至少99%的存在于饮料或饮料中间物或食物中的生物胺在一个方面，通过实施本发明的方法，减少了至少50%的存在于饮料或饮料中间 物或食物中的组胺该减少是作为在与酶接触之前和之后存在于样品中的组胺的百分比来 计算的在另一个方面，减少了至少40%，如至少45%，如至少50%，如至少55%，如至少60%，如 至少65%，如至少70%，如至少75%，如至少80%，如至少81%，如至少82%，如至少83%，如至少 84%,如至少85%,如至少86%,如至少87%,如至少88%,如至少89%,如至少90%,如至少91%, 如至少92%，如至少93%，如至少94%，如至少95%，如至少96%，如至少97%,如至少98%，如至 少99%的存在于饮料或饮料中间物或食物中的组胺存在多种可用于检测食物样品中的生物胺含量的方法这些方法在本领域中一般 是已知的这些包括但不限于层析方法如气相、液相、高效液相层析、纸层析、薄层层析、纸 和毛细管电泳，其它方法像放射免疫测定法或酶联免疫吸附测定法酶方法亦可用于确定 食物中的生物胺含量这些方法使用酶如胺氧化酶以将生物胺转化为其相应的醛，连同释 放过氧化氢和氨然后过氧化氢和氨可通过比色方法检测—种根据本发明检测生物胺含量的优选方法是层析方法，此种方法描述于实施例 I待使用的具有转谷氨酰胺酶活性的酶的量通常会取决于特定需求和特定酶转谷 氨酰胺酶添加的量优选足以在指定的时间内造成理想的生物胺减少通常，在约O. Img至 约IOOOmg酶蛋白(EP)每升底物(即饮料或饮料中间物)范围内的转谷氨酰胺酶添加是充 分的，特别是约Img至约500mg酶蛋白(EP)每升底物,特别是约IOmg至约500mg酶蛋白 (EP)每升底物，且更特别是约50mg至约200mg酶蛋白(EP)每升底物调整减少生物胺所 需的具体酶的量属于本领域技术人员的一般常识或者，所述酶可根据酶活性单位添加转谷氨酰胺酶的活性以TGH单位测量一个 TGHU (转谷氨酸胺酶氧厢酸单位，TransGlutaminase Hydroxamate Unit)是使用 Z-Gln-Gly 和羟胺作为底物在37°C，pH6，每分钟产生lymol氧肟酸(盐)的酶的量通常添加的酶 活性的范围会在约2. OTGHU至约25000TGHU每升底物，如约20TGHU至约25000TGHU每升底 物，如约200TGHU至约12000TGHU每升底物，如约1000TGHU至约5000TGHU每升底物接触应进行合适长度的时间(温育时间)以允许样品中生物胺的减少一般而言， 基于饮料的性质选择温育时间举例而言，在啤酒或麦芽汁的情况下，温育应为数小时或数 日的数量级，而在葡萄酒的情况下，温育应为多日至数周的数量级而且，温育时间亦取决 于原始样品中生物胺的浓度，使用的酶的浓度等调整减少生物胺所需的温育时间属于本 领域技术人员的一般常识温育温度通常会取决于使用的转谷氨酰胺酶，并通常根据该转谷氨酰胺酶的最佳反应温度来选择本领域技术人员会知道如何鉴定酶的最佳温度合适的温度亦取决于饮料/食物的性质以及添加酶的生产阶段举例而言，对于啤酒，合适的温度会在约40°C至约 80°C的范围，优选在45°C至75°C的范围，更优选在50°C至70°C的范围，甚至更优选在50V 至65°C的范围对于葡萄酒，合适的温度会取决于葡萄酒的性质和葡萄酒的年份举例而言，对于白葡萄酒，合适的温度范围为约15°C至约25°C，优选为约18°C至约22°C的范围对于红葡萄酒，合适的温度范围为约20°C至约35°C，优选为25°C至30°C接触应在转谷氨酰胺酶有活性的最适pH进行一般而言，pH应为3. O至9. O的范围，优选3. O至7. 5的范围，甚至更优选3. O至7. O的范围，最优选3. O至6. 5的范围本领域技术人员能够调整PH水平以获得最佳的酶活性本领域技术人员亦能够基于饮料的特性选择合适的酶合适PH的选择取决于饮料/食物的性质和添加酶的生产阶段实施例材料和方法下文描述了同时检测样品中的酪胺和组胺的层析方法层析实验使用具有荧光分光光度检测器(激发340nm，发射460nm)的DIONEX Summit HPLC进行分离在40°C以Img/分钟的流速使用来自Phenomenx的C18110A柱(粒度3 μ m)(之前有用C18填充的保护柱)进行应用下述洗脱液A(0. 56%三甲胺缓冲液， ρΗ7· 5，离子强度 20mM)和 B (90% 乙腈和 10%Milli-Q 水)乙腈商业上可从Merck获得,而三甲胺、酪胺和组胺从Sigma-Aldrich获得施加下述梯度
