一种快速高效筛选鼠李糖脂产生菌营养体系的方法 [0002]近年来，海洋的石油泄漏事件层出不群，给海洋和沿海环境带来了严重的污染问题，石油泄漏污染导致了大量的生物死亡，因此了解如何使用微生物降解烃类是非常重要的。尽管烃类化合物是一种相对稳定的分子，但几百万年来，随着生物的进化，烃类已可以被微生物作为唯一碳源和能源降解利用，据文献报道至今至少有175个种属的微生物可以降解利用烃类化合物。烃类物质中主要的污染物质为芳烃类，低分子量多环芳烃易被多种微生物降解利用，高分子量多环芳烃较低分子量多环芳烃难被微生物降解，然而根据最近几十年的研宄，部分微生物在生长的过程中可以分泌表面活性剂，表面活性剂分子由两部分组成，一部分是疏油亲水的极性基团，另一部分是非极性基团，由疏水亲油的碳氢链组成，正是这种特殊的结构，使得表面活性剂具有良好的表/界面活性和乳化活性，能显著降低发酵液的表/界面张力，使发酵液形成胶束溶液，乳化分散烃类物质，降低原油粘度，从而增大烃类的溶解能力，特别是能增加较难溶于水的高分子量多环芳烃类物质的溶解度，从而促进微生物对烃类的摄取，提高微生物对烃类的降解。 [0003]表面活性剂的种类有很多，根据功能可划分为乳化剂和分散剂，去垢剂，起泡剂，增稠剂，破乳剂，粘黏剂及分散剂等；根据所带电荷可划分为阳离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂及兼性离子表面活性剂，而非离子表面活性剂与其他种类的表面活性剂相比具有更高的表面活性，其水溶液表面张力和临界胶束浓度更低，胶束聚集数更大，增溶作用更强；根据来源可划分为化学合成表面活性剂和生物表面活性剂。化学表面活性剂是人工合成的表面活性剂，这种表面活性剂生产成本较低，生产工艺成熟，在各个领域应用也较早，但化学表面活性剂难被环境中的微生物降解，很容易造成环境的二次污染，由此，生物表面活性剂应用而生。生物表面活性剂是某些微生物在生长后期合成分泌的次级代谢产物，通常由经过筛选的微生物在胞外液体培养获得，常用的生产方法有摇瓶培养，分批培养，流加培养，连续培养，混合微生物培养及酶处理。生物表面活性剂与传统化学类表面活性剂产品相比具有产品稳定性好、适用范围广、绿色环保、可生物降解、不会带来二次污染等优点。 [0004]不同种类微生物产生的生物表面活性剂种类各不相同，研宄最多的是糖脂类，包括槐糖脂、海藻糖脂、鼠李糖脂、蔗糖酯等，其中鼠李糖脂因为化学结构种类多样，性能独特，应用前景广泛，已成为当前研宄的重点。鼠李糖脂是由铜绿假单胞菌合成的一种重要的生物表面活性剂，是一类阴离子微生物糖脂，它的HLB (亲水亲脂平衡指数)在4-6之间，是由L-(+)_鼠李糖和β -羟基烃酸单位组成，鼠李糖脂分子也是由亲水部分和疏水部分两部分组成，因此鼠李糖脂能显著降低界面张力，或吸附在界面上形成紧密的定向排列来改变界面的亲水/亲油性能，使油/水两相得以很好的分散，形成高度稳定的乳化疏水性化合物水溶液。近年来鼠李糖脂由于其特有的生物表面活性剂的优点，已逐渐被各个领域所重视并投入使用，如鼠李糖脂可以促进石油的乳化、消除岩石上的油膜，降低岩层中的石油的粘滞度，从而能够回收一次、二次采油后残留的石油，可清洗储油罐、消除海域中的石油污染，也可应用于生物农药增加有机磷的溶解度，用于生物修复以及运用于医药领域和化妆品领域等。 [0005]鼠李糖脂作为生物表面活性剂，其市场具有很强的竞争性，已经形成商品化的产品较少，其最大潜在应用是石油工业，当降低生产成本后可以代替化学表面活性剂用于石油开采。鼠李糖脂的制备主要采用微生物发酵法，该工艺的发酵原料广泛廉价，安全经济，工艺简单，产物可完全被生物降解，对生物体和环境也无危害，然而由于起步晚，鼠李糖脂的生产发展仍存在一些问题和缺陷。从发酵工艺本身来说，生产时具有相对较高的生产成本和较低的产量，并且微生物菌株通常具有致病性或者很难大规模处理，且产生的产品都是混合物，无法达到单一产品，因此加大了下游处理成本，就发酵菌株本身来说，产品产生量较低，对培养基的要求和适应能力较弱，根据文献报道，如果限制某些发酵条件则可增加鼠李糖脂的产量，因此，如能依据此原理研宄出一种快速确定铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的营养优化体系，将会省去很多的工作。

[0006]为克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速高效筛选鼠李糖脂产生菌营养体系的方法，具有快速高效的优点，可在较短时间内确定多个影响因素，同时还可同时处理多个样品，不仅节省了大量的时间，还节省了大量的人力、物力以及降低了原材料以及实验试剂的损耗，该方法将大大减少菌种营养体系优化的工作量，为以后各种营养物质的筛选和培养基的筛选优化奠定了基础。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种快速高效筛选鼠李糖脂产生菌营养体系的方法，包括以下步骤:
O合成鼠李糖脂产生基因474却勺引物，应用PCR进行基因扩增，合成基因片段，利用基因工程剪切、拼接技术，将基因片段连接到pMS402质粒上的7狀发光基因之前，构成重组质粒，然后将上述重组质粒转入铜绿假单胞菌DN1，将重组菌株涂布于含有200mg/L-300mg/LTmp的LB固体平板上，筛选出阳性克隆，命名该菌株为沒-7m菌株，挑选出阳性单克隆菌落在固体LB培养基上富集，4°C冷藏保存备用；
2)取冷藏的沒-7m菌株，在含有200mg/L-300mg/LTmp(甲氧苄氨嘧啶)的LB固体培养基上活化24h，挑取单克隆，在含有100mg/L-200mg/LTmp的LB液体培养基中，pH5_7，摇床转速为170rpm-250rpm，温度为33°C _37°C，过夜富集菌体，将富集过的液体LB菌液8000rpm，4°C离心，去上清，BPLM无机盐基础培养基重悬得菌液；
3)碳源筛选:使用含有100mg/L-200mg/LTmp的BPLM无机盐培养基，添加不同的碳源，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，摇床转速为170rpm-250rpm，温度为33°C -37°C,分别在8-18h之内，50ul-150ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkinelmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳碳源种类；最佳碳源为棕榈油。
[0008]4)氮源确定:依照步骤2)所述富集菌体，使用含有100mg/L-200mg/LTmp的基础BPLM培养基，添加不同的氮源，添加比例均为0.5%，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，摇床转速为170rpm-250rpm，温度为33°C -37°C，分别在8_18h之内，50ul_150ul加样于分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳氮源种类；最佳氮源为NaNO3;
5)碳氮比的确定:依照步骤2)所述富集菌体，使用含有100mg/L-200mg/LTmp的基础BPLM培养基，以0.5%的添加量固定一种氮源，按碳氮比为10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十个梯度添加不同碳源，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为33°C -37°C，摇床培养，转速为170rpm-250rpm，分别在8_18h之内，50ul_150ul加样于分析板中，在perkinelmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳碳氮比；最佳C/N为20 ；
6)磷源确定:在碳源、氮源及碳氮比确定的前体下，依照步骤2)所述步骤富集菌体，以含有100mg/L-200mg/LTmp的BPLM培养基为基础，配置不含磷源的新型培养基，设置0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同类型的磷源，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为33°C -37°C，摇床培养，转速为170rpm-250rpm，分别在8_18h之内，50ul-150ul加样于分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳磷源种类及其浓度；最佳磷源以及磷源的最佳浓度为 0.15% 的 KH2PO4及 0.12% 的 NaH 2P04；
7)硫源确定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源确定的前体下，依照步骤2)所述富集菌体，以含有100mg/L-200mg/LTmp的基础BPLM培养基为基础，配置不含硫源的新型培养基，按照0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为33°C _37°C，摇床培养，转速为170rpm-250rpm，分别在8-18h之内，50ul-150ul加样于分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳硫源种类及其浓度；最佳硫源以及硫源的最佳浓度为0.06%的MgSO4;
8)微量元素确定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比确定的前提下，依照步骤2)所述富集菌体，以含有100mg/L-200mg/LTmp的基础BPLM培养基为基础，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为33°C -37°C，摇床培养，转速为170rpm_250rpm，分别在 8_18h 之内，50ul_150ul 加样于分析板中，在 perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定微量元素的种类，测定结果表明有Fe无Mo时发光值最高。
[0009]所述的无机盐培养基包括有以下组分:
磷酸盐缓冲液 5.0mL ;MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 l.0mL，微量矿质元素 LOmL0
[0010]所述的磷酸盐缓冲液的母液包括以下组分！K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.12H20 33.4g/L，NH4Cl 5.0go
[0011]所述的MgSO4的母液含量为22.5g/L ；CaCl 2的母液含量为36.4g/L ；FeCl 3的母液含量为0.25g/Lo
[0012]所述的微量矿质元素包括以下组分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O,34.7mg/L 的(NH4)6Mo4O24.4H20。
[0013]所述的分析板米用康宁公司3603黑色96孔的分析板。
[0014]所述的碳源包括豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、荧蒽、己烷、辛烷、柠檬酸钠、蔗糖、棕榈油和乳酸钠，添加比例为0.5%，所述的试剂添加量固体为W/V (质量/体积)，液体为V/V(体积/体积)。
[0015]所述的氮源包括NH4C1、NaN03、NH4N03、尿素(CON2H4),固体按照W/V (质量/体积)添加。
[0016]所述的磷源包括NaH2P03、Na2HPO3^ Na3PO3^ KH2PO3^ K2HPO3O最佳磷源以及磷源的最佳浓度为 0.15% 的 KH2PO3及 0.12% 的 NaH 2P03。
[0017]本发明的有益效果
特定微生物分解某种有机物，从而产生目的产物的过程，即为一般的发酵过程。发酵过程中培养基的配方及配比以及培养条件的优化对目的发酵产物的积累有很大的影响，根据传统的方法，一般发酵过程的周期大约7-10天，因此依照传统的培养基优化方法，确定一套适合某种微生物生长的营养优化体系大约要90-150天。本发明利用质粒PMS402上luxBCADE基因的发光特性，通过测定发光值来监测铜绿假单胞菌DNl菌的累计量，从而监测鼠李糖脂的产生量，依据这一原理快速确定铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的最佳培养基配方以及配比，形成了一套营养物质快速、高通量的筛选方法。依据上述方法，可以在18-30小时内，动态检测菌体的累积量，从而监测鼠李糖脂的产生量。本方法与传统方法相比具有快速高效的优点，可在较短时间内确定多个影响因素，同时还可同时处理多个样品，不仅节省了大量的时间，还节省了大量的人力、物力以及降低了原材料以及实验试剂的损耗，该方法将大大减少菌种营养体系优化的工作量，为以后各种营养物质的筛选和培养基的筛选优化奠定了基础。




[0018]图1为pMS402质粒图谱。
[0019]图2为以NaNO3S氮源时不同碳源的发光值比较图。
[0020]图3为以棕榈油为碳源时不同氮源的发光值比较图。
[0021]图4为棕榈油/NaNO3不同C/N发光值比较图。
[0022]图5为不同硫源发光值比较图。
[0023]图6为表面张力图。
[0024]图7为荧蒽降解气相色谱图:其中图7 (a)为未降解的对照组图，图7 (b)为降解72h的实验组图。
[0025]图8为NBPLM培养基原油降解曲线图示。


[0026]下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
[0027]实施例1
一种快速高效筛选鼠李糖脂产生菌营养体系的方法，包括以下步骤:
I)在相关基因合成公司合成鼠李糖脂产生基因474却勺引物，应用PCR进行基因扩增，合成基因片段，利用基因工程剪切、拼接技术，将基因片段连接到pMS402质粒上的发光基因之前，构成重组质粒，然后将上述重组质粒转入铜绿假单胞菌DN1，将重组菌株涂布于含有300mg/LTmp的LB固体平板上，筛选出阳性克隆，命名该菌株为rA以沒-7^?菌株，挑选出阳性单克隆菌落在固体LB培养基上富集，4°C冷藏保存备用；
2)取冷藏的沒-7m菌株，在含有300mg/LTmp(甲氧苄氨嘧啶)的LB固体培养基上活化24h，挑取单克隆，在含有lOOmg/LTmp的LB液体培养基中，pH7，摇床200rpm，温度为37°C，过夜富集菌体，将富集过的液体LB菌液8000rpm，4°C离心，去上清，用BPLM无机盐培养基重悬得菌液；
3)碳源筛选:使用含有lOOmg/LTmp的BPLM无机盐培养基，无机盐培养基的组分为:磷酸盐缓冲液 5.0mL ；MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 1.0mL，微量矿质元素 1.0mL，所述的磷酸盐缓冲液的母液由 K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.Iffi2O 33.4g/L，NH4Cl 5.0g组成，所述的MgSO4的母液含量为22.5g/L ；CaCl 2的母液含量为36.4g/L ；FeCl 3的母液含量为0.25g/L，所述的微量矿质元素包括以下组分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O, 34.7mg/L的(NH4)6Mo4O24.4Η20，添加豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、荧蒽、己烷、辛烷、柠檬酸钠、蔗糖、棕榈油和乳酸钠，添加比例为0.5%，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，摇床转速为200rpm，温度为37°C，分别在8h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳碳源种类；最佳碳源为棕榈油；
4)氮源确定:依照步骤2)所述富集菌体，使用含有lOOmg/LTmp的基础BPLM培养基，添加不同的氮源，氮源包括NH4Cl、NaN03、NH4N03和尿素，添加比例均为0.5%，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，摇床转速为200rpm，温度为37°C，分别在18h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳氮源种类；最佳氮源为NaNO3;
5)碳氮比的确定:依照步骤2)所述富集菌体，使用含有lOOmg/LTmp的基础BPLM培养基，以0.5%的添加量固定似勵3作为氮源，按碳氮比为10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十个梯度添加不同碳源，碳源包括豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、荧蒽、己烷、辛烷、柠檬酸钠、蔗糖、棕榈油和乳酸钠，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm离心，分别在14h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳碳氮比，最佳碳氮比为20 ；
6)磷源确定:在碳源、氮源及碳氮比确定的前体下，依照步骤2)所述步骤富集菌体，以含有100mg/L的BPLM培养基为基础，配置不含磷源的新型培养基，设置0.03%,0.06%、0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同类型的磷源，磷源包括NaH2P03、Na2HP03、Na3P03、KH2P03、K2HPO3,接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm，分别在16h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳磷源种类及其浓度；最佳磷源以及磷源的最佳浓度为0.15%的ΚΗ2Ρ03& 0.12%的NaH2PO3;
7)硫源确定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源确定的前体下，依照步骤2)所述富集菌体，以含有lOOmg/LTmp的基础BPLM培养基为基础，配置不含硫源的新型培养基，按照0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，硫源包括(NH4)2SO^ MgSO4,接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm，分别在14h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳硫源种类及其浓度；最佳硫源以及硫源的最佳浓度为0.06%的MgSO4;
8)微量元素确定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比确定的前提下，依照步骤2)所述富集菌体，以含有lOOmg/LTmp的基础BPLM培养基为基础，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm，分别在1h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定微量元素的种类，测定结果表明有Fe无Mo时发光值最高。
[0028] 实施例2
一种快速高效筛选鼠李糖脂产生菌营养体系的方法，包括以下步骤:
1)在相关基因合成公司合成鼠李糖脂产生基因474却勺引物，应用PCR进行基因扩增，合成rhlABm因片段，利用基因工程剪切、拼接技术，将rhlABm因片段连接到PMS402质粒上的A?发光基因之前，构成重组质粒，然后将上述重组质粒导入铜绿假单胞菌PA01，将重组菌株涂布于含有200mg/LTmp的LB固体平板上，筛选出阳性克隆，命名该菌株为故见-Λ/χ菌株，挑选出阳性单克隆菌落在固体LB培养基上富集，4°C冷藏保存备用；
2)取冷藏的菌株，在含有200mg/LTmp(甲氧苄氨嘧啶)的LB固体培养基上活化24h，挑取单克隆，在含有200mg/LTmp的LB液体培养基中，pH5，摇床转速为250rpm，温度为33°C，过夜富集菌体，将富集过的液体LB菌液8000rpm，4°C离心，去上清，用BPLM无机盐培养基重悬得菌液；
3)碳源筛选:使用含有lOOmg/LTmp的BPLM无机盐培养基，无机盐培养基的组分为:磷酸盐缓冲液 5.0mL ；MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 1.0mL，微量矿质元素 1.0mL，所述的磷酸盐缓冲液的母液由 K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.Iffi2O 33.4g/L，NH4Cl 5.0g组成，所述的MgSO4的母液含量为22.5g/L ；CaCl 2的母液含量为36.4g/L ；FeCl 3的母液含量为0.25g/L，所述的微量矿质元素包括以下组分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O, 34.7mg/L的(NH4)6Mo4O24.4Η20，添加豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、荧蒽、己烷、辛烷、柠檬酸钠、蔗糖、棕榈油和乳酸钠，添加比例为0.5%，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，摇床转速为200rpm，温度为37°C，分别在1h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳碳源种类；最佳碳源为葡萄糖；
4)氮源确定:依照步骤2)所述富集菌体，使用含有lOOmg/LTmp的基础BPLM培养基，添加不同的氮源，氮源包括NH4Cl、NaN03、NH4N03和尿素，添加比例均为0.5%，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，摇床转速为200rpm，温度为37°C，分别在12h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳氮源种类；最佳氮源为NaNO3;
5)碳氮比的确定:依照步骤2)所述富集菌体，使用含有lOOmg/LTmp的基础BPLM培养基，以0.5%的添加量固定似勵3作为氮源，按碳氮比为10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十个梯度添加不同碳源，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm离心，在14h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳碳氮比，最佳碳氮比为40 ；
6)磷源确定:在碳源、氮源及碳氮比确定的前体下，依照步骤2)所述步骤富集菌体，以含有100mg/L的BPLM培养基为基础，配置不含磷源的新型培养基，设置0.03%,0.06%、
0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同类型的磷源，磷源包括NaH2P03、Na2HP03、Na3P03、KH2P03、K2HPO3,接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm，分别在1h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳磷源种类及其浓度；最佳磷源以及磷源的最佳浓度为0.09%的腿#03及0.15%的NaH2PO3;
7)硫源确定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源确定的前体下，依照步骤2)所述富集菌体，以含有lOOmg/LTmp的基础BPLM培养基为基础，配置不含硫源的新型培养基，按照
0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，硫源包括(NH4)2SO^ MgSO4,接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm，分别在12h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定最佳硫源种类及其浓度；最佳硫源以及硫源的最佳浓度为0.09%的MgSO4;
8)微量元素确定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比确定的前提下，依照步骤2)所述富集菌体，以含有100mg/LTmp的基础BPLM培养基为基础，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步骤2)所述菌液，菌液添加量为1%，温度为37°C，摇床培养，转速为200rpm，分别在16h之内，10ul加样于康宁公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶标仪上测定发光值，发光值越大则表明鼠李糖脂产生越多，依此确定微量元素的种类；测定结果表明有Fe无Mo时发光值最高。
[0029]表面张力的测定:
使用上述已确定成分及配比的最优BPLM培养基，按照第二步a项所述方法富集菌体，菌液添加量为1%，330C -370C，170rpm-250rpm,摇床培养，分别在10h_22h之间，利用表面张力仪，每隔2h测定溶液的表面张力。结果显示随着时间的变化，表面张力呈现先降后升的趋势，最低表面张力可达到21N/m。
[0030]原油降解实验:
使用10ml优化培养基，加入5%的原油，按照步骤2)所述方法富集菌体，接入菌液，330C -370C，170rpm-250rpm，摇床培养，在不同时间观察原油的乳化及降解情况。结果表明，降解72h后，相比于M9培养基，NB培养基中培养发酵液对原油有明显的乳化和沉降现象。
[0031]荧蒽降解实验:
使用10ml优化培养基，加入150mg/L-200mg/L的荧蒽，按照步骤2)所述方法富集菌体，接入菌液，33°C -37°C，170rpm-250rpm，摇床培养，每隔24h利用紫外分光光度计测定荧蒽的降解量，并计算其降解率，同时将提取液进行气相色谱测定。紫外分光光度计测定降解率的测定结果表明，与荧蒽的初始加入量相比，第72小时时荧蒽降解了 63.5% ;气相色谱图像结果表明，与对照组相比，第72h的峰值明显比对照组低。
[0032]鼠李糖脂的提取
使用10ml优化培养基，按照步骤2)所述方法富集菌体，接入菌液，33°C -37 °C,170rpm-250rpm,摇床培养7_10天，用硫酸-蒽酮显色法测定鼠李糖脂的含量，用甲醇_氯仿萃取法提取鼠李糖脂，并通过质量差计算提出的鼠李糖脂的含量。硫酸-蒽酮显色法及甲醇-氯仿提取法结果同时表明第九天时发酵液内鼠李糖脂含量达到17.6g/L。
[0033]参见图1，图1为本实验所用质粒pMS402，图中该质粒上含有发光基因，BamHlJk.酶切位点。pMS402质粒:oril及ori2为复制起始位点；Terminator为终止子；BamHl及Xhol为限制性酶切位点；luxCDABE为发光报道基因；dhfR II为Tmp(甲氧苄氨嘧啶)抗性基因，Kan为卡那霉素抗性基因。图中粗箭头表示多克隆位点MCS，用于外源基因的插入，箭头方向表示外源基因转录的方向，由启动子指向终止子。
[0034]参见图2，图2为NaNO3S固定氮源时不同碳源的发光值比较图示，以NaNO 3为氮源，棕榈油为碳源时发光值最高，因此最佳碳源为棕榈油。
[0035]参见图3，图3为棕榈油作为固定碳源时不同氮源的发光值比较图，以棕榈油为碳源，NaNO3S氮源时发光值最高，因此最佳氮源为NaNO 3。
[0036]参见图4，图4为棕榈油为碳源，NaNO3S氮源时，不同碳氮比的发光值比较图，当棕榈油/似勵3的C/N为20时，发光值最高，因此最佳碳氮比为20。
[0037]参见图5，图5为不同硫源的发光值比较图，M0.03为添加浓度为0.03%的MgSO4,依此类推，N0.03为添加浓度为0.03%的(NH4)2SO4,依此类推，如上图所示，当添加0.06%的1%504或0.03%的(NH 4)#04时发光值最高，因此最佳硫源为0.06%的MgSO 4或0.03%的(NH4)2SO40
[0038]参见图6，图6为NBPLM培养基表面张力变化图，以优化的BPLM培养基为基础培养基，铜绿假单胞菌DNl为研宄菌株，10-34小时内表面张力的变化图示，图示中NB表示优化的BPLM培养基，DZ表示无菌对照，图示表明，与对照组相比，实验组的表面张力有明显的降低。
[0039]参见图7，图7荧蒽降解气相色谱图，图7 Ca)为未降解的对照组，图7 (b)为降解72h的实验组，如图标注所示，与对照组相比，在11.445分钟时荧蒽的最高峰已基本完全降解。
[0040]参见图8，图8为NBPLM培养基原油降解曲线图示，如图所示，摇床培养14天后原油降解率达到95.7%。