专利名称：高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶因其可以催化两个醛分子络合而独特于其它三种醛缩酶，且该酶宽松的专一性允许两个底物的共取代，一些链长为四个氢原子以下的醛可作为受体，当第一个受体是取代的乙醛时，它可以和乙醛进行两次连续的缩合，产物重排后得到稳定的环状缩醛，可以继续用于合成一些有用的药物中间体。比如2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶可用于催化两分子乙醛和另一个受体醛的羟醛缩合反应得到六氢吡喃结构，进而合成他汀类药物中间体。但是几个重要问题限制了其在大规模生产中的实际应用。首先，催化剂投加量十分大，每克分离产物需要约200 mg的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶，即20%的质量百分数。如此高的酶浓度使得合成费用昂贵并且增加了产物分离的困难；第二，反应时间需要几天；第三，反应物浓度受限。各种因素综合，只有2g/L/d的体积产量，使得2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶的实际应用价值大大降低。
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法。高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法的步骤如下1)向250mL无氧水中加入0.25 0. 35mol三价铁盐和0. 15 0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至PH =广2，超声处理30-40 min;升温至70 85 °C，在1 200 1 400 rpm搅拌下， N2鼓泡25 30 min，加入9 10 mL质量百分数25 28%的氨水或10 15mL 10mol/L NaOH, 使溶液PH = 8-10,20^30 min后，磁分离，无氧水洗涤5 10次，再以0. 010 0. 015mol/L 乙醇水溶液洗涤3、次；2)加入80 100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，6 8 mL硅烷交联剂，50 60 °C、 180^220 rpm搅拌5 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3 5次；3)加入If20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及If 20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液， 200 rpm搅拌纩3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:广5，在冰浴中， PH调整至5-10，200rpm,搅拌3_12h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应剩余上清液的蛋白浓度；5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存2 12h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7.5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测；340 nm处吸光度的变化
所述的二价铁盐为I^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三价铁盐为FeCl3 · 6H20或 Fe2(SO4)3 ·7Η20ο所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述的酸缩酶为 Escherichia coli K12 AB200068。本发明将磁性纳米材料固定化醛缩酶用于催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸(DRP)， 得到3-磷酸甘油醛和乙醛中，其底物耐受性有显著提高，并且大大方便酶的回收和重复利用，具有极大的工业应用价值。


图1磁滞曲线；
图2表面活化的磁性纳米粒子微球载体固定化醛缩酶酶扫描电子显微镜照片。

1)向250mL无氧水中加入0.25 0. 35mol三价铁盐和0. 15 0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至PH =广2，超声处理30-40 min;升温至70 85 °C，在1 200 1 400 rpm搅拌下， N2鼓泡25 30 min，加入9 10 mL质量百分数25 28%的氨水或10 15mL 10mol/L NaOH, 使溶液PH = 8-10,20^30 min后，磁分离，无氧水洗涤5 10次，再以0. 010 0. 015mol/L 乙醇水溶液洗涤3、次；
2)加入80 100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，6 8 mL硅烷交联剂，50 60 °C、 180^220 rpm搅拌5 6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3 5次；
3)加入If20 mL pH = 7的磷酸缓冲液及If 20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液， 200 rpm搅拌纩3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:广5，在冰浴中， PH调整至5-10，200rpm,搅拌3_12h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应剩余上清液的蛋白浓度；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存2 12h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7.5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测；340 nm处吸光度的变化
所述的二价铁盐为I^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三价铁盐为FeCl3 · 6H20或 Fe2(SO4)3 ·7Η20ο所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷。所述的酸缩酶为 Escherichia coli K12 AB200068。实施例1
1)向250mL无氧水中加入0. 25mol三价铁盐和0. 15mol 二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1，超声处理30-40 min;升温至70 °C，在1 200 rpm搅拌下，N2鼓泡25 min，加入9mL 质量百分数25%的氨水或10 mL IOmol/L NaOH，使溶液pH = 8，20 min后，磁分离，无氧水洗涤5次，再以O.OlOmol/L乙醇水溶液洗涤3次；
2)加入80mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，6mL硅烷交联剂，50°C、180 rpm搅拌 5 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤3次；
3)加入18mL pH = 7的磷酸缓冲液及18 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌2 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:1，在冰浴中， pH=5, 200rpm，搅拌池，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应中剩余上清液的蛋白浓度。载体的吸附量为 37. 1% ；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存2h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7.5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测340 nm处吸光度的变化，酶比活为1. 55U/mg。实施例2
1)向250mL无氧水中加入0.35mol三价铁盐和0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至pH = 2，超声处理340 min;升温至85 °C，在1 400 rpm搅拌下,N2鼓泡30 min，加入10 mL质量百分数28%的氨水或15mL 10mol/L NaOH，使溶液pH = 10,30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，再以0.015mol/L乙醇水溶液洗涤4次；
2)加入100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，60 °C >220 rpm 搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:5，在冰浴中， pH=10, 200rpm，搅拌4h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应中剩余上清液的蛋白浓度。载体的吸附量为 56. 1% ；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存4h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7.5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测340 nm处吸光度的变化，酶比活为1. 71U/mg。实施例3
1)向250mL无氧水中加入0.3mol三价铁盐和0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1. 5，超声处理340 min ；升温至85 °C，在1 400 rpm搅拌下，N2鼓泡30 min，加入10 mL 质量百分数28%的氨水或15mL 10mol/L NaOH，使溶液pH = 10,30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，再以0.015mol/L乙醇水溶液洗涤4次；
2)加入100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，60 °C >220 rpm 搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:5，在冰浴中， pH=7. 5，200rpm，搅拌6h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应中剩余上清液的蛋白浓度。载体的吸附量为 76. 8% ；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存8h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7.5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测340 nm处吸光度的变化，酶比活为1. 92U/mg。实施例4
1)向250mL无氧水中加入0.3mol三价铁盐和0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1. 7，超声处理340 min ；升温至85 °C，在1 400 rpm搅拌下，N2鼓泡30 min，加入10 mL 质量百分数观％的氨水或15mL 10mol/L NaOH，使溶液pH = 9. 5,30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，再以0.015mol/L乙醇水溶液洗涤4次；
2)加入100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，60 °C >220 rpm 搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:5，在冰浴中， pH=7. 5，200rpm，搅拌8h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应中剩余上清液的蛋白浓度。载体的吸附量为 78. 1% ；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存2h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7. 5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测340 nm处吸光度的变化，酶比活为2. 47U/mg。实施例5
1)向250mL无氧水中加入0.3mol三价铁盐和0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1. 5，超声处理340 min ；升温至80 °C，在1 400 rpm搅拌下，N2鼓泡30 min，加入10 mL 质量百分数观％的氨水或15mL 10mol/L NaOH，使溶液pH = 9. 5,30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，再以0.015mol/L乙醇水溶液洗涤4次；
2)加入100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，60 °C >220 rpm 搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:2，在冰浴中， pH=7. 5，200rpm，搅拌8h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应中剩余上清液的蛋白浓度。载体的吸附量为 83. 1% ；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存2h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7. 5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测340 nm处吸光度的变化，酶比活为2. 57U/mg。实施例6
1)向250mL无氧水中加入0.3mol三价铁盐和0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1. 7，超声处理340 min ；升温至85 °C，在1 400 rpm搅拌下，N2鼓泡30 min，加入10 mL 质量百分数观％的氨水或15mL 10mol/L NaOH，使溶液pH = 9. 5,30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，再以0.015mol/L乙醇水溶液洗涤4次；
2)加入100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，60 °C >220 rpm 搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:1，在冰浴中， pH=7. 5，200rpm，搅拌8h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应中剩余上清液的蛋白浓度。载体的吸附量为 78. 1% ；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存12h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7. 5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测340 nm处吸光度的变化，酶比活为2. 13U/mg。实施例7
1)向250mL无氧水中加入0.3mol三价铁盐和0. 2mol 二价铁盐，以盐酸调整至pH = 1. 7，超声处理340 min ；升温至85 °C，在1 400 rpm搅拌下，N2鼓泡30 min，加入10 mL 质量百分数25%的氨水或15mL 10mol/L NaOH，使溶液pH = 9. 5,30 min后，磁分离，无氧水洗涤10次，再以0.015mol/L乙醇水溶液洗涤4次；
2)加入100mL体积百分数为50%的乙醇水溶液，8 mL硅烷交联剂，60 °C >220 rpm 搅拌6 h，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次；
3)加入20mL pH = 7的磷酸缓冲液及20 mL质量百分数5%的戊二醛水溶液，200 rpm 搅拌3 h，磁分离，用pH = 7的磷酸缓冲液洗涤5次，真空干燥，得到表面活化的磁性纳米粒子微球载体；
4)配制lmg/ml的醛缩酶蛋白溶液，醛缩酶蛋白与载体的质量比为1:5，在冰浴中， pH=12, 200rpm，搅拌8h，磁分离，洗涤固定化酶，冻干，得到高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶。用Bradford法检测固定化反应中剩余上清液的蛋白浓度。载体的吸附量为19. 1% ；
5)将IOmg固定化的醛缩酶300mM的乙醛溶液中保存2h，再加入到Iml的50mM的三乙醇胺盐酸盐溶液，其PH为7. 5，含0. Immol的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 4mmol的底物 2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，4U/ml磷酸丙糖异构酶，llU/ml甘油磷酸脱氢酶，50°C条件下反应后检测340 nm处吸光度的变化，酶比活为1. 63U/mg。


本发明公开了一种高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法，包括如下步骤1) 以二价和三价铁盐的混合物共沉淀制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子，以硅烷偶联剂进行修饰，并在修饰后的微粒外表以戊二醛活化，从而得到表面活化的磁性纳米粒子；2)将纯化脱盐后的醛缩酶缓冲液和磁性载体在低温下搅拌、洗涤、冷冻干燥后得到磁性纳米载体固定化醛缩酶；3)采用该磁性纳米载体固定化醛缩酶为催化剂催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸，得到3-磷酸甘油醛和乙醛．本发明所涉及的固定化醛缩酶在催化2-脱氧-D-核糖-5-磷酸反应中，底物乙醛耐受性显著提高，酶的回收利用操作极大简化。