一类寡糖及其硫酸化产物和它们的制备方法及含该寡糖的药物组合物制作方法

宁君, 曾盈, 孔繁祚

2003年10月22日

2002年4月11日

2002年4月11日

中国科学院生态环境研究中心

A61P37/00GK1450075SQ0211661

寡糖 硫酸 产物 一类 它们

1.一种具有抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力等药理作用的寡糖及其硫酸酯化产物的结构，其特征在于其寡糖具有如下的结构式 其中n为2-8的整数，R＝葡萄糖，R1为末端基，代表葡萄糖、半乳糖或甘露糖或其它糖，也可代表烃基如烷基、烯基、芳基苷或寡糖肽，其烃基碳链长度为1-20，最好是6-18糖单元之间以1→3α和1→3β交替连接如β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-Gluα-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-Gluβ-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-Glu-OC12H25α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-Glu-OC12H25等等2.一种具有抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力等药理作用的寡糖及其硫酸酯化产物，其特征在于权利1中所述2糖、3糖、4糖、6糖、7糖及更大的糖的合成方法该方法包括以3位烯丙基化的酰基葡萄糖的三氯乙酰亚胺酯1为糖基供体，以3位为游离羟基的酰基葡萄糖烷基甙2为糖基受体，首先得到1，3-β-连接的双糖，选择性地水解掉3位的烯丙基，即得到二糖受体3，如下结构式所示 用类似的方法合成3位为位烯丙基的葡萄糖的二糖供体，即用3-O-烯丙基-2，4，6-三-O-酰基-α-D-葡萄糖的糖基供体4，使其与单糖受体5在路易斯酸催化下，室温搅拌下偶联得到相应的1，3-β-连接的双糖，选择性地水解掉1位的对甲氧基苯，对其进行活化，得到二糖供体6，如下结构式所示 将等摩尔比的二糖供体6与二糖受体3在路易斯酸催化下，室温搅拌下偶联，得到1，3-β-和1，3-α-交替连接的4糖，选择性地水解掉3位的烯丙基，即得到四糖受体7，如下结构式所示 将等摩尔比的二糖供体6与四糖受体7在路易斯酸催化下，室温搅拌下偶联，得到1，3-β-和1，3-α-交替连接的保护的六糖8，再去保护即得到所需要的六糖9如下结构式所示 用相同的方法，以α-1→3-连接的双糖为供体和受体，可方便地制备α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-Glu-OC12H25用类似的方法，可以合成五糖、七糖、八糖、九糖等所述的寡糖，非糖体部分为烃基如烷基、烯基、芳基，其碳链长度为1-20，最好是6-12；非糖体部分也可为氨基酸及肽链，所述的酰基为苯甲酰基，乙酰基或其它酰基所述的路易斯酸为银盐如碳酸银、三氟甲磺酸银，或为三氟化硼，或为三氟甲磺酸三甲基硅酯3.一种具有抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力等药理作用的寡糖及其硫酸酯化产物，其特征在于权利1中所述的寡糖硫酸酯化产物的羟基硫酸化的程度要大于1/5，最好是1/3-2/34.权利1中所述的寡糖和权利3中所述的寡糖硫酸酯化产物可单独用或与其它物质合用，用作抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力的保健品或药物

本发明是关于有抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力活性的，特别是涉及可用作增强免疫力、抗肿瘤，抗爱滋病的保健品或药物的寡糖及其硫酸酯化的产物具体的涉及含1，3-β-和1，3-α-交替连接接的葡聚寡糖，本发明还涉及所述寡糖及其硫酸酯化产物的制备方法及含该寡糖的药物组合物本发明的目的在于确认主链含有1，3-β-和1，3-α-交替连接的葡聚寡糖及其硫酸化产物具有抗病毒、抗肿瘤活性，可做为免疫增强剂、抗肿瘤，抗爱滋病的保健品或药物通过寡糖对健康人外周血单核细胞IL-2和TNF-α的基因表达水平的影响以及抑制肿瘤效果的情况进行它们的活性试验；通过这些试验确定的有免疫、抗肿瘤活性并能作为增强免疫力、抗肿瘤，抗爱滋病的硫酸化寡糖中的寡糖的新结构为 其中n为2-8的整数，R＝葡萄糖，R1为末端基，代表葡萄糖、半乳糖或甘露糖或其它糖，也可代表烃基如烷基、烯基、芳基苷或寡糖肽，其烃基碳链长度为1-20，最好是6-18糖单元之间以1→3α和1→3β交替连接如β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-Gluα-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-Gluβ-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-Glu-OC12H25α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-Glu-OC12H25等等2.一种具有抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力等药理作用的寡糖及其硫酸酯化产物，其特征在于权利1中所述2糖、3糖、4糖、6糖、7糖及更大的糖的合成方法该方法包括以3位烯丙基化的酰基葡萄糖的三氯乙酰亚胺酯1为糖基供体，以3位为游离羟基的酰基葡萄糖烷基甙2为糖基受体，首先得到1，3-β-连接的双糖，选择性地水解掉3位的烯丙基，即得到二糖受体3，如下结构式所示 用类似的方法合成3位为位烯丙基的葡萄糖的二糖供体，即用3-O-烯丙基-2，4，6-三-O-酰基-α-D-葡萄糖的糖基供体4，使其与单糖受体5在路易斯酸催化下，室温搅拌下偶联得到相应的1，3-β-连接的双糖，选择性地水解掉1位的对甲氧基苯，对其进行活化，得到二糖供体6，如下结构式所示 将等摩尔比的二糖供体6与二糖受体3在路易斯酸催化下，室温搅拌下偶联，得到1，3-β-和1，3-α-交替连接的4糖，选择性地水解掉3位的烯丙基，即得到四糖受体7，如下结构式所示 将等摩尔比的二糖供体6与四糖受体7在路易斯酸催化下，室温搅拌下偶联，得到1，3-β-和1，3-α-交替连接的保护的六糖8，再去保护即得到所需要的六糖9如下结构式所示 用相同的方法，以α-1→3-连接的双糖为供体和受体，可方便地制备α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-β-Glu-1→3-α-Glu-1→3-Glu-OC12H25用类似的方法，可以合成五糖、七糖、八糖、九糖等所述的寡糖，非糖体部分为烃基如烷基、烯基、芳基，其碳链长度为1-20，最好是6-12；非糖体部分也可为氨基酸及肽链，所述的酰基为苯甲酰基，乙酰基或其它酰基所述的路易斯酸为银盐如碳酸银、三氟甲磺酸银，或为三氟化硼，或为三氟甲磺酸三甲基硅酯2.一种具有抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力等药理作用的寡糖及其硫酸酯化产物，其特征在于权利1中所述的寡糖硫酸酯化产物的羟基硫酸化的程度要大于1/5，最好是1/3-2/34.权利1中所述的寡糖和权利3中所述的寡糖硫酸酯化产物可单独用或与其它物质合用，用作抗病毒，抗感染，抗肿瘤及提高免疫力的保健品或药物下面结合实施例对本发明进行详细地说明实施例1.二糖受体3的制备 3位烯丙基化的酰基葡萄糖的三氯乙酰亚胺酯1(5.6克，7.56毫摩尔)溶于40毫升二氯甲烷中，得溶液A，3位为游离羟基的酰基葡萄糖烷基甙2(2.8克，10.77.毫摩尔)溶于20毫升二氯甲烷中，得溶液B，将B与A混合得溶液C，向C中加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTF，0.08毫摩尔)，在室温反应二小时后，薄层色谱分析表明反应完成得到相应的二糖将其溶于100毫升干燥的甲醇溶液中，加入氯化钯0.5克，在室温、搅拌下反应，并以薄层分析检测，当检测表明烯丙基已被选择性移除时，过滤，减压下蒸干溶剂，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到二糖3(4.22克)，产率87％2.二糖给体6的制备按1与2偶联的条件，即用3-O-烯丙基-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-葡萄糖三氯乙酰亚胺酯4(4.10克，8.38毫克分子)与单糖受体5(2.13克8.20毫克分子)偶联，得到相应的二糖将其选择性地水解掉1位的对甲氧基苯，溶于40毫升二氯甲烷中，加入三氯乙睛3毫升，碳酸钾3克，室温下搅23小时，薄层分析表明反应完成，用常规方法进行后处理，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的二糖供体6(6.01克)，产率91％如下结构式所示 3.四糖受体7的制备按照制备二糖受体3的方法，使二糖供体6(3.12克，2.13毫克分子)与二糖受体3(0.80克，2.50毫克分子)偶联，得到1，3-β-和1，3-α-交替连接的4糖，选择性地水解掉3位的烯丙基，即得到四糖受体7(2.34克，产率69％)如下结构式所示 4.六糖9的制备将二糖供体6(3克，1.92毫克分子)与四糖受体7(2.12克，1.91毫克分子)溶于40毫升二氯甲烷中，在冰盐浴冷却下加入TMSOTf(0.02毫摩尔)，然后自然恢复至室温，在氮气保护，室温、搅拌下进行反应，用薄层分析检测，反应完成后，用常规方法后处理，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(2/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到1，3-β-和1，3-α-交替连接的保护的六糖8，将8其溶于40毫升甲醇中，用氨饱和，室温过夜，用薄层分析检测反应，反应完成后，减压蒸干溶剂，用二氯甲烷洗涤，弃掉洗涤液，得到粉末状的所需要的六糖9(681毫克)，总产率55％如下图所示 用类似的方法，可以合成五糖、七糖、八糖、九糖等5.硫酸化六糖的制备将三氧化硫-吡啶络合物4克溶于5毫升DMF中，加热至80℃，搅拌下滴加500毫克六糖9在15毫升吡啶中的溶液，反应物再在80℃下反应100分钟，在热的条件下，倒掉上清夜，将余下的粘稠物用10毫升甲醇洗涤三次，去掉残余的甲醇，将产品溶于15毫升水中，在搅拌下用乙酸钡中和至pH为6，离心，分掉上清夜，余下的钡盐用水洗三次，将上清夜与洗涤液合并，用阳离子交换树脂DOWEX 50W-X8-400精制，用水淋洗直到淋洗液为中性，将淋洗液用乙酸钠中和，溶液用1升丙酮稀释，离心，对游离六糖得到硫酸化产物10共计0.88克，产率55％如下图所示 其中R代表硫酸基团或氢所述的硫酸化寡糖在使用时可注射或口服(单独用或与其它物质合用)可用作增强免疫力、抗肿瘤，抗爱滋病的保健品或药物下面结合实施例对本发明进行详细地说明1.所述的硫酸化寡糖(10)对健康人外周血单核细胞IL-2和TNF-α的基因表达水平和活性有显著影响，在0.5毫克/升-10毫克/升的浓度范围内，随浓度增加该基因表达水平及活性增加，诱导免疫反应2.所述的硫酸化寡糖(10)对肿瘤的抑制作用所述的硫酸化寡糖(10)的抗癌及抑制癌细胞转移作用的情况肿 瘤 宿 主 寡糖剂量途经 注射时间寡糖肿 肿瘤完全(1mg/kg×d) 瘤抑制率 消退率肉瘤180CD-1/JCR1×10 i.p.1to1010010/10A/J 5×4 i.p 1to4 93.79/10DBA/2N 5×4 i.p.1to4 9510/10SWM/Ms 1×10 i.p.1to1010010/10艾氏腹腔癌 CD-1/ICR1×10 i.p.1to1053.20/5CCM腺癌SWM/Ms 1×10 i.p.1to1063.50/10MC.S1纤维肉瘤 A/J 1×10 i.p.1to1010018/18MC.CS1纤维肉瘤 DBA/2N 1×10 i.p.1to1078.52/7甲基胆蒽 SWM/Ms1×10 i.p.21to3181→32％甲基胆蒽 DBA/2N1×10 i.p.14to2476→35％腺病12型 C3H/HeN 3×10 i.p.14to1877→37％由此可见，所述的硫酸化寡糖不仅对S180等同种移植癌而且对同系癌，自发癌的生长也能明显抑制，并对化学致癌，病毒致癌均有预防效果所述的硫酸化寡糖抑制肿瘤作用的特点是对肿瘤细胞没有直接细胞毒作用，其作用依赖于宿主；有最适剂量，过量使用使抑制肿瘤作用及免疫增强作用减弱；其作用因小鼠种系不同而有显著差异A/J，DBA/2，CD-1等小鼠对硫酸化寡糖最敏感，肿瘤可完全消失对C3H/He不消失，BALB/C，CBA中等对敏感小鼠接种甲基胆蒽(MC)，建立了纤维肉瘤株，以此移植于近交系小鼠后，给与硫酸化寡糖后肿瘤消失所述的硫酸化寡糖对化学致癌有强的抑制作用接种MC35周后几乎所有小鼠均发生癌，但在接种MC2～3周后开始腹腔投与硫酸化寡糖，致癌率约降低至30％这是因为接种MC产生的少数癌细胞由于注射寡糖增强了免疫功能而被消灭寡糖还可使腺病毒的致癌率由80％降低至40％表明硫酸化寡糖不单是促进免疫排斥的物质而且是抗癌物质此外，所述的寡糖对各种细菌，病毒，寄生虫的感染也有突出效果药物组合物实施例配方实施例1 将1000毫克、5000毫克和10000毫克式10的6糖分别溶于1000毫升的1％生理食盐水中，分别配置成浓度为1毫克/毫升、5毫克/毫升及10毫克/毫升的注射用药物，此注射药物通常在使用时配置