硫酸软骨素b的应用及含有硫酸软骨素b的疫苗剂的制作方法 [0002] 近年来，随着疫苗研宄的不断深入，特别是分子生物技术的迅速发展，研制出的新 型基因工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较弱，难以产生有效的免疫应 答。因此应用佐剂来增强其免疫原性就显得尤为重要。 [0003] 目前，已认证应用于人类的佐剂仍寥寥无几，铝盐佐剂就是其中之一。铝盐佐剂在 提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实，但由于其会引起过敏、诱导退行性神经 病变等缺点，迫切需要开发新型疫苗佐剂以克服这些缺陷，更好的为人类服务。 [0004] 硫酸软骨素 （Chondroitin Sulfate)是一种硫酸化的线性粘多糖，由葡萄糖醛酸 和N-乙酰氨基半乳糖组成的二糖单位重复而成。根据硫酸基团的位置不同，分为硫酸软骨 素 A，硫酸软骨素 B和硫酸软骨素 C。硫酸软骨素广泛地分布于动物组织中，主要存在于皮 肤、血管、心脏瓣膜和肌腱部分。具有多种生理和病理功能，参与细胞分裂、胚胎形成、神经 元的可塑性和机体抵抗病毒和细菌等过程。普遍用于治疗骨骼相关疾病、脑损伤复合等疾 病。硫酸软骨素具有提高免疫作用的功能。研宄发现：体外培养条件下，硫酸软骨素能显著 提高B细胞的增殖，通过蛋白激酶C抑制剂GF109203X诱导免疫功能低下小鼠体内实验证 明硫酸软骨素是通过蛋白激酶C作用于B细胞的。注射硫酸软骨素4?5天后，脾脏内B 细胞和CD138+细胞大量增值，CD138+细胞能迀移到骨髓作为浆细胞影响体液免疫，从而提 高体液免疫应答。还有研宄报道硫酸软骨素能通过激活Thl辅助淋巴细胞、诱导干扰素的 产生，增强细胞免疫功能。 [0005] 硫酸软骨素 B (Chondroitin Sulfate B)，亦称硫酸皮肤素 （Dermatan Sulfate DS)，最初由猪皮细胞中萃取得到，故称为硫酸皮肤素。除具有硫酸软骨素的一般特点外，还 有研宄发现一定浓度的硫酸软骨素 B能抑制癌细胞的生长。硫酸软骨素 B作为硫酸软骨素 的一种能在体内外激活B细胞。硫酸软骨素 B还能成为自身抗原引起固有免疫应答。CD5+ B细胞通过表达固有免疫B细胞受体和产生自身抗原调节固有免疫，⑶5+ B细胞对于固有 免疫至关重要，而硫酸软骨素 B能激活CD5+ B细胞，从而提高固有免疫应答。 [0006] 通过以上推断，硫酸软骨素 B具有免疫增强作用，有必要研发硫酸软骨素 B在疫苗 中的应用。


[0007] 为解决现有疫苗佐剂存在种类少、毒副作用大等问题，本发明提供一种安全、有 效、稳定、经济的硫酸软骨素 B佐剂以及含有硫酸软骨素 B佐剂的疫苗剂。
[0008] 本发明通过下列技术方案实现：硫酸软骨素 B作为佐剂在疫苗中的应用。
[0009] 所述硫酸软骨素 B为市购产品，分子式为（C14H21NO14S)n，分子量约为41KDa。结构 式如图1所示。
[0010] 本发明提供一种含有硫酸软骨素 B的疫苗剂，其特征在于：每单份疫苗剂中含有 5?105 μ g的硫酸软骨素 B。
[0011] 所述每单份疫苗剂为临床使用的常规单次注射参考量。
[0012] 所述硫酸软骨素 B的含量优选65 μ g。
[0013] 本发明的还提供一种含有硫酸软骨素 B疫苗剂的制备方法，其特征在于经过下列 步骤：按每单份疫苗剂加入5?105 μ g硫酸软骨素 B的量，在抗原剂中加入硫酸软骨素 B， 再加生理盐水至注射所需量，按常规混合均匀，即得含有硫酸软骨素 B的疫苗剂。
[0014] 所述抗原剂为常规甲肝抗原、乙肝抗原或狂犬病毒抗原中的一种。
[0015] 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：（1)硫酸软骨素 B佐剂是人体组织 中的成分，是普遍使用的药物，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的；（2)硫 酸软骨素 B佐剂能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且其所诱导的体液免疫应答 效果优于无佐剂组；（3)硫酸软骨素 B佐剂能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，且 一定剂量时其所诱导的体液免疫应答效果优于铝佐剂组；（4)硫酸软骨素 B佐剂原料易得， 为市售产品，制备工艺简单，成本低，性能稳定，生物学效价较高、无毒害作用，可添加于多 种传统疫苗和基因工程疫苗中作为疫苗佐剂；（5)硫酸软骨素 B佐剂与疫苗联合应用能有 效增强疫苗体液免疫应答，免疫效果优于无佐剂的疫苗。




[0016] 图1为硫酸软骨素 B的分子结构式。


[0017] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限 制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂 商所建议的条件。文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。
[0018] 实施例1 本实施例提供的硫酸软骨素 B佐剂用量为5 μ g。
[0019] 本例提供的含有硫酸软骨素 B佐剂的甲肝疫苗是：按每单份疫苗剂加入5 μ g硫酸 软骨素 B的量，在甲肝（HAV)抗原中加入硫酸软骨素 B，再加生理盐水至200 μ L，按常规混 合均匀，即得含有硫酸软骨素 B的甲肝疫苗剂。
[0020] 其中，硫酸软骨素 B为市购产品，分子式为（C14H21NO14S)η，分子量约为41KDa，购自 购自美国SiGM公司；HAV抗原为市购的滴度为256EU/ml的18EU HAV抗原液，购自中国医 学科学院北京协和医学院医学生物学研宄所。
[0021] 本实施例1所得含有硫酸软骨素 B佐剂的甲肝疫苗的免疫试验和效果如下： A、免疫 将6?8周龄、18?22g的清洁级ICR小鼠随机分为硫酸软骨素 B佐剂组、氢氧化铝佐 剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组8只；所用氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，其 制法参照《中国药典(三部)》，（国家药典委员会.北京：人民卫生出版社.2005:118-119)， 在人体中的剂量为1. 8?2. 7mg。
[0022] 硫酸软骨素 B佐剂组：注射实施例1的含有硫酸软骨素 B佐剂的甲肝疫苗至小鼠 体内，注射剂量为每只小鼠200 μ L，其中200 μ L疫苗中含有硫酸软骨素 B 5 yg，甲肝抗原 18EU。
[0023] 氢氧化铝佐剂组：将氢氧化铝0.5mg与甲肝抗原18EU混合后加生理盐水至 200 μ L，经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200 μ L。
[0024] 无佐剂组：将甲肝抗原18EU与生理盐水混合至200uL，再经腹腔皮下多点注射到 小鼠体内，注射剂量为每只小鼠200 μ L。
[0025] 空白组：仅注射生理盐水，注射剂量为每只小鼠 200uL。
[0026] 免疫方案：在第0周经腹腔皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
[0027] B、ELISA检测血清抗一 HAV IgG水平 在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗一 HAV IgG水平，按KPL公司生产的小鼠 IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
[0028] C、数据分析 对所获得的实验数据以SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，以P < 0.05为差异 的统计学意义。
[0029] 表1为使用实施例1提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG水平 (抗体效价值)。
[0030] 表 1