专利名称：促进hgf产生的含肝素类寡糖的药剂的制作方法对HGF(肝细胞生长因子)作为再生因子或治疗因子给予了很大关注。HGF是基于其对肝细胞的促有丝分裂活性而发现的一种蛋白质，但是，后来的研究表明，除肝细胞外，HGF还对许多上皮细胞和一些种类的间充质细胞具有促有丝分裂活性。还知道HGF不仅具有促有丝分裂活性，而且还具有各种活性如动力产生(motogenic)、形态发生(morphogenic)、抗凋亡和新血管形成的活性(Matsumoto，K等人，Kidney Int.，2001，vol.59，2023-2038页)。根据HGF的这些药理作用，已期望将它开发为以下药剂肝硬变治疗药、肾病治疗药、上皮细胞生长促进药、抗癌药、癌症治疗中的副作用预防药、肺病治疗药、胃或十二指肠损伤治疗药、脑神经病治疗药、免疫抑制的副作用预防药、胶原降解促进药、软骨病治疗药、动脉病治疗药、肺纤维化治疗药、肝病治疗药、血液凝固异常治疗药、血浆低蛋白治疗药、伤口愈合药、神经病改善药、造血干细胞增加药或毛发生长促进药(参见JP-A-18028/1992、JP-A-49246/1992、EP-A-492614、JP-A-25010/1994、WO 03/8821、JP-A-172207/1994、JP-A-89869/1995、JP-A-40934/1994、WO 94/2165、JP-A-40935/1994、JP-A-56692/1994、JP-A-41429/1995、WO 93/3061和JP-A-213721/1993)。HGF主要由间充质细胞产生，它的产生量随器官损害而增加。例如，当损伤发生在肝脏中时，HGF产生量在肝血管内皮细胞和非肝细胞如Kupffer细胞和Ito细胞中增加。另一方面，此时，HGF的表达量也在其它器官如未损伤的肺、脾和肾中增加，因此血液中的HGF水平增加。这意味着在血液中存在响应器官损伤来诱导HGF表达的因子，这种因子被共同命名为“损伤因子(injurin)”(Matsumoto，K等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1992，vol.89，3800-3804页)。损伤因子不是单一物质，例如，细胞因子如白细胞介素-1、FGF(成纤维细胞生长因子)和PDGF(血小板衍生生长因子)和自身活性物质如前列腺素都被确定为损伤因子。这些因子通过增加HGF mRNA的表达来促进HGF产生。另一方面，在损伤因子的研究过程中，发现肝素和硫酸乙酰肝素也对促进HGF产生有活性(Matsumoto，K.等人，J.Biochem.，1993，vol.114，820-826页)。据认为，肝素和硫酸乙酰肝素不会增加HGF mRNA的表达，但对转录过程后的步骤起作用。但是，详细的机理是未知的。肝素和硫酸乙酰肝素是被称为糖胺聚糖(GAG)的多糖族的成员。肝素和硫酸乙酰肝素为通过重复二糖单元构建的多糖，所述二糖单元由D-葡糖胺和糖醛酸组成(Sugahara，K等人，IUBMB Life，2002，vol.54，163-175页)。肝素和硫酸乙酰肝素的分子量不是一致的，其中分子量为大约5000至30000的物质以混合形式存在。D-葡糖胺残基的6-位碳原子部分地发生O-硫酸化，D-葡糖胺残基的氨基可发生N-乙酰化或N-硫酸化。糖醛酸残基以L-艾杜糖醛酸或D-葡糖醛酸存在。大多数糖醛酸残基在肝素中以L-艾杜糖醛酸存在，而在硫酸乙酰肝素中，大多数糖醛酸残基以D-葡糖醛酸存在。糖醛酸残基的2-位碳原子部分地进行O-硫酸化。另外，硫酸化有时发生在另一部位，发生硫酸化的位置的这种多样性提供了分子的结构多样性。肝素总体上以比硫酸乙酰肝素高的程度进行硫酸化。但是，从组织中提取的肝素和硫酸乙酰肝素制备物是不一致的，这使得难以在两个种类之间区分。肝素在临床上主要用作抗凝血药。例如，肝素用于预防体外血液循环中的凝血，或用于治疗或预防血栓形成疾病，包括弥漫性血管内凝血综合症(DIC)和心肌梗死。肝素本身没有抗凝血活性，但是，通过结合到抗凝血酶III(ATIII)或肝素辅因子II，它使用作凝血因子的各种丝氨酸蛋白酶失去活性，从而强烈抑制了凝血(Bourin，M.C.等人，Biochem.J.，1993，vol.289(Pt2)，313-330页)。
尽管肝素已被用作类似这样的药物，但希望其另外用作促进HGF产生的药剂(JP-A-312941/1994)。
如果肝素可用作促进HGF产生的药剂，则通过HGF的上述药理作用可预计到对各种疾病的治疗效果。但是，当肝素用于促进HGF产生时，以前利用的肝素的抗凝血活性将导致出血倾向，这可能导致副作用。当对人施用肝素时，必须通过监测抗凝血活性来小心地控制剂量，以预防在给药过程中出血。特别地，由于未分级的高分子量肝素具有很强的抗凝血活性，因此在使用时应给予最小心的注意。因此，当用作促进HGF产生的药剂时，肝素的抗凝血活性是一个缺陷。
另外，肝素还具有通过释放血管壁中存在的LPL来增加脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性(Olivecrona，T.等人，Haemostasis，1993，vol.23(Suppl.1)，150-160页)。
LPL活性的增加通过脂肪降解来促进血液澄清，但LPL活性的持续增加提高了血液中的游离脂肪酸水平，并可能导致心律失常。
因此，强烈需要一种制备无抗凝血活性和LPL释放活性、而只具有促进HGF产生活性的肝素或硫酸乙酰肝素的方法。
作为降低肝素抗凝血活性的方法，将肝素解聚至低分子量片段是已知的(Linhardt，R.J.等人，Semin.Thromb.Hemost.，1999，vol.25，Suppl.3，5-16页)。如上所述，未分级的高分子量肝素具有很强的抗凝血活性，对于其实际使用需要小心注意。为了克服高分子量肝素的这种缺陷，使用低分子量肝素。如上所述，肝素的抗凝血活性归因于肝素-ATIII复合物的形成。肝素-ATIII复合物结合到凝血酶(凝血因子IIa)或其它凝血因子(Xa、XIIa、XIa、IXa等)上，并使它们失去活性。为了抑制因子IIa，需要不小于十八糖的肝素分子大小。因此，高分子量肝素的主要作用特别归因于因子IIa的失活，但也涉及到反因子Xa的作用。另一方面，当肝素被解聚至不大于十六糖的低分子大小时，已知抗凝血活性降低，因为在不小于十八糖的多糖中观察到的反因子IIa活性被降低。(Holmer，E.等人，Haemostasis，1986，vol.16，Suppl.2，1-7页；和Lane D.A.等人，Biochem.J.，1984，vol.218，725-732页)。
另外，在低分子量肝素中，还已知LPL释放活性被降低(Nasstrom，B.et al.，J.Lab.Clin.Med.，2003，vol.142，90-99页)。
象这样，通过将肝素解聚至低分子大小，可以降低抗凝血活性和LPL释放活性，但本文中，如果肝素被解聚至低分子大小，则能否保持促进HGF产生的活性是未知的。已知被称为低分子量肝素的达肝素钠(Fragmin静脉内注射；Kissei Pharmaceutical Co.，Ltd.)具有HGF产生促进活性(Matsumoto，K.等人，J.Biochem.，1993，vol.114，820-826页)。
但是，达肝素钠具有5000的平均分子量、和从2000到9000的分子量分布。其中，造成促进HGF产生活性的分子大小是未知的。特别地，分子大小不大于十六糖(分子量为5000或更小)的寡糖是否能保持促进HGF产生活性是重要的，但这一点是完全未知的。
此外，还没有已知的方法能降低肝素的抗凝血活性和LPL释放活性，而不会将肝素解聚至低分子大小，且同时保持HGF产生促进活性。


本发明的一个目的是提供一种促进HGF产生的药剂，该药剂包括具有肝素结构但没有或具有降低的肝素或肝素硫酸盐抗凝血活性和LPL释放活性的糖链化合物如寡糖、或其盐。
为了解决上述问题，本发明人对肝素和硫酸乙酰肝素促进HGF产生的作用进行了深入研究。
结果，本发明人发现，具有如下结构的二至十六糖的寡糖具有促进HGF产生的活性，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，可通过将肝素或硫酸乙酰肝素解聚至低分子大小而得到所述寡糖。
另外，本发明人还发现，上述寡糖的抗凝血活性和脂蛋白释放活性降低。
迄今为止，根本不知道在肝素或硫酸乙酰肝素被解聚成不大于十六糖的低分子寡糖时是否能保持促进HGF产生的活性。尤其令人惊奇地发现，甚至由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成的二糖化合物也具有促进HGF产生的活性。本发明人还发现，肝素或硫酸乙酰肝素中葡糖胺残基6-位羟基或葡糖胺残基2-位氨基的硫酸化增强了促进HGF产生的活性。因此，本发明人发现，当改变肝素或肝素硫酸盐的结构使得仅仅葡糖胺残基6-位羟基被硫酸化或使得仅仅葡糖胺残基2-位氨基被硫酸化时，抗凝血活性和LPL释放活性就会降低，而不用将肝素或硫酸乙酰肝素解聚至低分子大小，同时保持了HGF产生促进活性。基于这些发现，本发明人进一步扩展了研究并完成了本发明。
也就是说，本发明涉及(1)一种促进HGF产生的药剂，该药剂包括二糖或具有如下结构的三糖至十六糖或其盐作为有效成分，其中所述二糖由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含义)和葡糖胺残基组成，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中糖醛酸残基和/或葡糖胺残基的至少一个羟基可被硫酸化、烷基化、酰化或胺化，和/或至少一个葡糖胺残基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或酰化；(2)如上面(1)所述的促进HGF产生的药剂，其中至少一个糖醛酸残基的2-位羟基和/或至少一个葡糖胺残基的3-位和/或6-位羟基可被硫酸化；(3)如上面(1)或(2)所述的促进HGF产生的药剂，其中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基被硫酸化，(4)如上面(1)至(3)中任一项所述的促进HGF产生的药剂，其中寡糖为二糖至十糖；(5)如上面(1)至(4)中任一项所述的促进HGF产生的药剂，其中寡糖为通过用肝素酶或乙酰肝素酶(heparitinase)消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解产物；(6)如上面(1)至(4)中任一项所述的促进HGF产生的药剂，其中寡糖为通过用亚硝酸降解、过氧化氢降解或β-消除中的任意一种方式消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解产物；(7)如上面(1)所述的促进HGF产生的药剂，其中寡糖为用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一种
(a)式(I) 其中R1表示氢、硫酸基、烷基、酰基或任选取代的氨基，R2表示氢、硫酸基、烷基或酰基，R3和R4彼此不同，并表示氢或任选取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符号分别与上面的定义相同，(c)式(III) 其中所有符号分别与上面的定义相同，(d)式(IV) 其中所有符号分别与上面的定义相同，
(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(8)一种促进HGF产生的药剂，该药剂包括具有如下结构的糖链化合物或其盐作为有效成分，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基被硫酸化；
(9)一种促进HGF产生的药剂，该药剂包括具有如下结构的糖链化合物或其盐作为有效成分，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中至少一个葡糖胺残基的2-位氨基被硫酸化；(10)一种促进HGF产生的药剂，该药剂包括二糖化合物或其盐作为有效成分，所述二糖化合物由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成，其中葡糖胺残基的6-位羟基和/或葡糖胺残基的2-位氨基被硫酸化；和(11)如上面(1)至(10)中任一项所述的促进HGF产生的药剂，其中糖链化合物或其盐没有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶释放活性。
另外，本发明涉及(12)一种促进HGF产生的方法，其特征在于，对哺乳动物施用有效量的二糖或具有如下结构的三糖至十六糖或其盐，其中所述二糖由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含义)和葡糖胺残基组成，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中糖醛酸残基和/或葡糖胺残基的至少一个羟基可被硫酸化、烷基化、酰化或胺化，和/或至少一个葡糖胺残基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或酰化；(13)如上面(12)所述的促进HGF产生的方法，其中至少一个糖醛酸残基的2-位羟基和/或至少一个葡糖胺残基的3-位和/或6-位羟基可被硫酸化；(14)如上面(12)所述的促进HGF产生的方法，其中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基被硫酸化；
(15)如上面(12)所述的促进HGF产生的方法，其中寡糖为二糖至十糖；(16)如上面(12)所述的促进HGF产生的方法，其中寡糖为通过用肝素酶或乙酰肝素酶消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解产物；(17)如上面(12)所述的促进HGF产生的方法，其中寡糖为通过用亚硝酸降解、过氧化氢降解或β-消除中的任意一种方式处理高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解产物；(18)如上面(12)所述的促进HGF产生的方法，其中寡糖为用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一种(a)式(I) 其中R1表示氢、硫酸基、烷基、酰基或任选取代的氨基，R2表示氢、硫酸基、烷基或酰基，R3和R4彼此不同，表示氢或任选取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符号分别与上面的定义相同，
(c)式(III) 其中所有符号分别与上面的定义相同，(d)式(IV) 其中所有符号分别与上面的定义相同，(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，
(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同；(19)一种促进HGF产生的方法，其特征在于，对哺乳动物施用有效量的具有如下结构的糖链化合物或其盐，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基被硫酸化；(20)一种促进HGF产生的方法，其特征在于，对哺乳动物施用有效量的具有如下结构的糖链化合物或其盐，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中至少一个葡糖胺残基的2-位氨基被硫酸化；(21)一种促进HGF产生的方法，其特征在于，对哺乳动物施用有效量的二糖化合物或其盐，所述二糖化合物由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成，其中葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基被硫酸化；和(22)如上面(12)至(21)中任一项所述的促进HGF产生的方法，其中糖链化合物或其盐没有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶释放活性。
此外，本发明涉及(23)二糖或具有如下结构的三糖至十六糖或其盐在制备促进HGF产生的药物中的用途，其中所述二糖由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含义)和葡糖胺残基组成，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中糖醛酸残基和/或葡糖胺残基的至少一个羟基可被硫酸化、烷基化、酰化或胺化，和/或至少一个葡糖胺残基的2-位氨基可被硫酸化、烷基化或酰化；(24)如上面(23)所述的用途，其中至少一个糖醛酸残基的2-位羟基和/或至少一个葡糖胺残基的3-位和/或6-位羟基可被硫酸化；(25)如上面(23)所述的用途，其中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基被硫酸化；(26)如上面(23)所述的用途，其中寡糖为二糖至十糖；(27)如上面(23)所述的用途，其中寡糖为通过用肝素酶或乙酰肝素酶消化高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解产物；(28)如上面(23)所述的用途，其中寡糖为通过用亚硝酸降解、过氧化氢降解或β-消除中的任意一种方式处理高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素而制得的降解产物；(29)如上面(23)所述的用途，其中寡糖为用下面(a)至(h)表示的化合物中的任意一种
(a)式(I) 其中R1表示氢、硫酸基、烷基、酰基或任选取代的氨基，R2表示氢、硫酸基、烷基或酰基，R3和R4彼此不同，并表示氢或任选取代的羧基，n表示0至7，(b)式(II) 其中所有符号分别与上面的定义相同，(c)式(III) 其中所有符号分别与上面的定义相同，(d)式(IV) 其中所有符号分别与上面的定义相同，
(e)式(V) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(f)式(VI) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，(g)式(VII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同，和(h)式(VIII) 其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面的定义相同；(30)具有如下结构的糖链化合物或其盐在制备促进HGF产生的药物中的用途，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基被硫酸化；
(31)具有如下结构的糖链化合物或其盐在制备促进HGF产生的药物中的用途，在所述结构中通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中葡糖胺残基的至少一个2-位氨基被硫酸化；(32)二糖化合物或其盐在制备促进HGF产生的药物中的用途，所述二糖化合物由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成，其中葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基被硫酸化；和(33)如上面(23)至(32)中任一项所述的用途，其中糖链化合物或其盐没有或具有降低的抗凝血活性和/或脂蛋白脂酶释放活性。
尽管在本发明的促进HGF产生的药剂中使用的糖链化合物如寡糖具有由重复二糖构建的肝素结构，所述二糖由通过α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成，但它们可促进HGF产生，且没有或具有很少的出血倾向副作用。糖链化合物具有促进活体的组织和器官损伤愈合的作用。更具体地说，糖链化合物可用于治疗肝病、肾病、皮肤病、血液病、眼病、肺病、胃或十二指肠病、癌症和其相关病症、骨病和中枢病。
附图简述

图1显示了凝胶过滤柱上解聚肝素产物的分离图。
图2显示了肝素片段促进HGF产生的活性。
图3显示了阴离子交换柱上肝素十糖片段的分离图。
图4显示了通过阴离子交换色谱法分离的肝素十糖片段的HGF产生促进活性。
图5显示了通过阴离子交换色谱法分离的肝素十糖片段的MALDI-TOF/MS分析的结果。
图6显示了在不同位置被硫酸化的各种二糖的HGF产生促进活性。
图7显示了肝素片段的抗凝血活性，其通过活化部分凝血活酶时间(下文中缩写为APTT)来评价。
图8显示了肝素片段的LPL释放活性。
图9显示了在不同位置硫酸化的各种二糖化合物的抗凝血活性，其用APTT评价。
图10显示了在不同位置硫酸化的各种二糖化合物的脂蛋白脂酶(下文中缩写为LPL)释放活性。
图11显示了其中只有葡糖胺残基的2-位氨基被硫酸化的修饰肝素的HGF产生促进活性。
图12显示了其中只有葡糖胺残基的2-位氨基被硫酸化的修饰肝素的抗凝血活性。
本发明的最佳实施方式在本发明中，肝素结构是指在该结构中，用α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基。
糖醛酸残基可以是L-艾杜糖醛酸残基(以下简写为IdoA)或D-葡糖醛酸残基(以下简写为GlcA)。糖醛酸残基可以仅作为IdoA或仅作为GlcA存在，或者作为IdoA和GlcA两者存在，对IdoA和GlcA的比例没有具体限定。
而且，本发明的寡糖是指由糖醛酸和葡糖胺两种不同糖组成的杂寡糖，具体为由用α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成的二糖化合物；由用α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基或葡糖胺残基与所述二糖化合物组成的三糖化合物；或具有如下结构的四糖至十六糖的糖链化合物，在该结构中，用α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基。
此外，在本发明中，烷基化是指用烷基、优选低碳烷基取代糖醛酸残基中羟基的氢，或/和取代葡糖胺残基中羟基或/和氨基的氢。
酰化是指用式-(C＝O)-R5、-(C＝O)-OR5、-(C＝O)-NR5R6、-(C＝S)-NHR5、-SO-R5、-SO2-R5或-SO2-NHR5(其中R5和R6表示氢原子或烃基)表示的酰基取代糖醛酸残基中羟基的氢，或/和取代葡糖胺残基中羟基或/和氨基的氢。在上述式中，由R5和R6表示的烃基例子包括链烃基(例如烷基、烯基、炔基等)。对于烷基，优选低碳烷基。对于烯基，优选例如C2-6烯基(例如乙烯基、烯丙基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基等)。对于炔基，优选例如C2-6炔基(例如乙炔基、炔丙基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-己炔基等)。
氨基化是指用氨基取代糖醛酸残基中羟基的氢，或/和取代葡糖胺残基中羟基的氢。可以进一步用硫酸基、烷基或酰基取代氨基。
在本发明中，“低碳烷基”是指具有1至6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
在构成糖链化合物如用于本发明药剂的寡糖的糖醛酸残基中，可以将2-位和3-位的至少一个羟基硫酸化、烷基化、酰化或胺化。优选硫酸化，特别优选将2-位羟基硫酸化。
在构成糖链化合物如用于本发明药剂的寡糖的葡糖胺残基中，可以将2-位氨基硫酸化、烷基化或酰化，优选硫酸化或酰化，更优选硫酸化。在酰化时，更优选用-(C＝O)-R5酰化，特别是，用乙酰基酰化是特别优选的。
此外，在葡糖胺残基中，可以将3-位和6-位的至少一个羟基硫酸化、烷基化或酰化，优选硫酸化。特别优选将6-位羟基硫酸化。
随着由糖醛酸残基和葡糖胺残基组成的二糖的重复数量增加，促进HGF产生的本发明寡糖的活性也增加。另一方面，随着二糖重复数量减少，抗凝血活性和LPL释放活性也降低。考虑这些事实，从能够促进HGF产生，且没有或具有更少的抗凝血活性和LPL释放活性副作用的观点，在本发明中使用二糖至十六糖，优选二糖至十糖。
关于本发明的促进HGF产生的药剂中所使用的二糖至十六糖，促进HGF产生的活性随着每分子硫酸化程度的增加而增加。优选的硫酸化程度为每两个糖残基约1至3个硫酸基。
虽然对二糖至十六糖中硫酸基的位置没有限定，但优选将糖链化合物中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基硫酸化。当象这样硫酸化糖链化合物时，可以不必在糖链化合物的其它位置硫酸化。对于二糖化合物，优选将葡糖胺残基中6-位羟基和/或2-位氨基中的至少一个硫酸化。
对于本发明的促进HGF产生的药剂中所使用的寡糖，其优选例子包括下面所示的化合物和其盐。
(a)式(I) (其中R1表示氢、硫酸基、烷基、酰基或任选取代的氨基，R2表示氢、硫酸基、烷基或酰基，R3和R4彼此不同，表示氢或任选取代的羧基，n表示0至7)；
(b)式(II) (其中所有符号分别与上面定义的相同)；(c)式(III) (其中所有符号分别与上面定义的相同)；(d)式(IV) (其中所有符号分别与上面定义的相同)；(e)式(V) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面定义的相同)；
(f)式(VI) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面定义的相同)；(g)式(VII) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面定义的相同)；(h)式(VIII) (其中m表示0至6，R1、R2、R3和R4分别与上面定义的相同)；(i)由用α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成的二糖化合物，其中仅葡糖胺残基的6-位羟基被硫酸化；(j)由用α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键连接的糖醛酸残基和葡糖胺残基组成的二糖化合物，其中仅葡糖胺残基的2-位氨基被硫酸化。
对于上述式(I)至(VIII)中所示由R1和R2表示的烷基，优选具有1至6个碳原子的低碳烷基，其例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。由R1和R2表示的酰基例子包括由式-(C＝O)-R3、-(C＝O)-OR3、-(C＝O)-NR3R4、-(C＝S)-NHR3、-SO-R5、-SO2-R5或-SOX-NHR3(其中R3和R4分别表示氢原子或烃基，R4表示氢原子或具有1至6个碳原子的低碳烷基，R5表示任选地具有取代基的烃基)表示的那些。在酰基中，优选-(C＝O)-R3，特别优选乙酰基。在上述式中，由R3和R5表示的烃基例子包括链烃基(例如烷基、烯基、炔基等)。对于烷基，优选具有1至6个碳原子的低碳烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等)。对于烯基，优选例如C2-6烯基(例如乙烯基、烯丙基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基等)。对于炔基，优选例如C2-6炔基(例如乙炔基、炔丙基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-己炔基等)。
可取代在式(I)至(VIII)中所示的R2中所用的氨基的取代基例子包括硫酸基、烷基和酰基，优选硫酸基和酰基，更优选硫酸基。对于酰基，更优选-(C＝O)-R5，特别优选乙酰基。烷基和酰基是指与关于在R1和R2使用的烷基和酰基所述相同的取代基。
作为R1和R2的优选组合，R1为氢或硫酸基，R2为氢、硫酸基或酰基。在这种情况下，作为酰基，优选-(C＝O)-R3，特别优选乙酰基。
n为0至7，优选0至4，m为0至6，优选0至4。
作为上述寡糖如由式(I)至(VIII)表示的化合物的盐，包括碱金属盐如锂盐、钠盐和钾盐；碱土金属盐如钙盐；酸的盐如无机酸盐(例如盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐等)和有机酸盐(例如乙酸盐、三氟乙酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、丙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、草酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等)。
通常可以由肝素或硫酸乙酰肝素制备在本发明的促进HGF产生的药剂中所使用的寡糖或其盐。肝素可以是高分子量肝素或低分子量肝素，硫酸乙酰肝素可以是高分子量硫酸乙酰肝素或低分子量硫酸乙酰肝素。可以通过碎裂高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素来获得用于本发明的寡糖或其盐。起始高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素可以是从生物材料中提取获得的那些，或通过化学合成制备的那些或其类似物。
为了通过从生物材料中提取来产生高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素作为原材料，可以使用包括人体组织在内的各种哺乳动物组织(例如脾、肺、肌肉等)，通常，使用源自猪或绵羊的肠粘膜或源自牛肺的那些组织。肝素的优选来源是猪的肠粘膜。通常，可以按如下所述从经选择的组织来源中制备肝素。使组织材料自溶，从中用碱制备组织提取物，使蛋白质凝固，通过氧化从上清液中沉淀肝素-蛋白质复合物。使用极性非水溶剂如乙醇、丙酮及其混合物，通过再沉淀回收该复合物，用有机溶剂如乙醇通过提取除去脂肪。然后用蛋白酶如胰蛋白酶处理复合物，以除去蛋白质。制备肝素的方法描述于例如日本药典(第十四版)或Charles，A.F.等人的论文(Biochem.J.，1936，vol.30，p.1927-1933)中，改进方法也是已知的，如“肝素的化学和生物学”(Chemistry and Biology of Heparin)(1981)(由Lundblad，R.L.等人编辑，Elsevier Publishers，North Holland，New York)中所公开的。通常，可以用常规方法从组织中获得高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素，通过该方法将肝素制成为抗凝血药(Linhardt，R.J.等人，Semin.Thromb.Hemost.，1999，vol.25，Suppl.3，p.5至16)。
如上所述，通过从生物材料提取而获得的高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素是由作为构成单元的二糖重复组成的多糖，该二糖包括糖醛酸(IdoA或GlcA)和葡糖胺。在肝素和硫酸乙酰肝素两者中都存在GlcA和IdoA。在肝素中更富含IdoA作为糖醛酸，而硫酸乙酰肝素中富含GlcA。GlcA和IdoA作为混合物存在，因为GlcA残基的5-位碳原子发生了部份差向异构化，因此使GlcA转化为IdoA。相应地，随着硫酸乙酰肝素变得更类似肝素，IdoA/GlcA的比率增加。
或者，可以化学合成高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素或它们的类似物作为原材料。在这种情况下，它们的组成可以不等于上述天然产物的组成，但是，通常所称的“肝素”或“硫酸乙酰肝素”或它们的类似物可以用作寡糖或其盐的原材料，所述寡糖或其盐用于本发明的促进HGF产生的药剂中。
此外，在本发明中，可以使用分子量为3000至6000的低分子量肝素或低分子量硫酸乙酰肝素作为原材料。在分子量为3000至6000的低分子量肝素中，抗Xa因子的活性很强，而其抗凝血酶活性很弱，因为其出血的危险较小，所以在临床上使用这种低分子量肝素。分子量为3000至6000的低分子量肝素的血小板聚集作用很弱，从血管壁释放LPL等的作用也很弱。此外，低分子量肝素显示了通过皮下注射可被充分吸收。由于这些因素，近年来开发了对低分子量肝素的利用。在在本发明的促进HGF产生的药剂中使用的寡糖或其盐的分子大小可以进一步低于分子量为3000至6000的低分子量肝素或低分子量硫酸乙酰肝素的分子大小。因此，即使通常称为低分子量肝素或低分子量硫酸乙酰肝素的那些物质也可以用作在本发明的促进HGF产生的药剂中寡糖或其盐的原材料。
为了使高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素或分子量为3000至6000的低分子量肝素片段化，使用酶方法或化学方法裂解糖苷键。对于酶消化，使用酶如肝素酶和乙酰肝素酶。例如，可以通过使用能将肝素解聚为低分子片段的肝素降解酶如乙酰肝素酶I、乙酰肝素酶II和肝素酶，来降解高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素，从而制备本发明的寡糖。通常，酶促反应在约20℃至45℃、优选约30℃至40℃下进行3小时或更长时间，优选6小时或更长时间，更优选约8小时至12小时，每100mg起始高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素的酶用量为约0.02U至2.0U，优选约0.1U至1.0U。但是，反应条件不限于上述条件，而是可以适当改变。对于化学降解，可以使用已知方法如硝酸降解法、过氧化氢降解法、和β-消除法(Linhardt，R.J.等人，Semin.Thromb.Hemost.，1999，vol.25，Suppl.3，p5至16)。
为了从分级的高分子量肝素或高分子量硫酸乙酰肝素的混合物中获得和纯化用于本发明的寡糖或其盐，可以单独或组合使用凝胶过滤色谱法和离子交换色谱法。例如，当在凝胶过滤色谱法中使用由Amersham Bioscience制造的Superdex 30pg色谱柱(色谱柱1.6cm×60cm，流速0.4ml/min)时，可以在约135分钟至138分钟洗脱十六糖级分，在约140分钟至144分钟洗脱十四糖级分，在约146分钟至151分钟洗脱十二糖级分，在约154分钟至161分钟洗脱十糖级分，在约163分钟至172分钟洗脱八糖级分，在约175分钟至188分钟洗脱六糖级分，在约190分钟至209分钟洗脱四糖级分，在约216分钟至249分钟洗脱二糖级分。通过离子交换色谱法进一步分离上述分级获得的寡糖，可以获得包括具有均匀结构的物质的级分。当使用离子交换色谱法时，优选通过常规方法将所得级分除盐，因为级分的盐浓度经常变得很高。
在纯化过程中优选包括使用结合抗凝血酶III的树脂的柱色谱法步骤。因为，当包括该步骤时，可以通过回收没有被吸附到色谱柱上的级分来获得没有抗Xa因子活性的寡糖。因此，可以获得完全除去抗凝血活性的寡糖。因为流过抗凝血酶III色谱柱的寡糖保留了促进HGF产生的活性，所以可以将它们应用于本发明。
此外，可以用已知方法将通过上述方法获得的寡糖硫酸化、烷基化、酰化或胺化。
可以通过化学合成来人工合成在本发明的促进HGF产生的药剂中使用的寡糖或其盐。例如，可以通过从IdoA或GlcA或其衍生物、和葡糖胺或其衍生物中合成二糖单元，并聚合这些二糖单元，从而制得上述寡糖或其盐(Karst，N.A.and Linhardt，R.J.，Curr.Med.Chem.，2003，vol.10，p.1993-2031，Lee，J.C.，J.Am.Chem.Soc.，2004，vol.126，p.476-7)。或者，可以使用组合了化学反应和酶促反应的化学酶促合成来获得这些寡糖(Kuberan，B.等人，J.Biol.Chem.，2003，vol.278，p.52613-21)。上述那些化学合成和化学酶促合成对于选择性地硫酸化葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基特别有效。
此外，本发明的促进HGF产生的药剂不限于上述获得的寡糖。
具有如下结构的不小于十七糖的糖链化合物可以促进HGF产生的药剂，在该结构中，用α1，4-糖苷键或β1，4-糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中至少一个葡糖胺残基的6-位羟基或至少一个葡糖胺残基的2-位氨基被硫酸化，其它羟基或其它氨基未被硫酸化，因为与肝素相比，所述糖链化合物具有更低的抗凝血活性和更低的LPL释放活性，同时保留了促进HGF产生的活性。可以通过例如化学修饰上述肝素或硫酸乙酰肝素来制备这种糖链化合物。
不小于十七糖的糖链化合物的糖链长度通常不大于500糖，优选不大于300糖，更优选不大于200糖。
不小于十七糖的糖链化合物盐的例子包括以上述寡糖的盐为例子的盐。
可以通过比较在产生HGF的细胞培养基中添加与不添加糖链化合物如寡糖或其盐时HGF的浓度，来测定本发明药剂促进HGF产生的活性，其中可以通过ELISA测定HGF的浓度。作为产生HGF的细胞，可以使用MRC-5细胞和MRC-9细胞、人胎肺成纤维细胞。
可以按照用于测定低分子量肝素抗凝血活性的已知方法，通过测定活化部分凝血活酶时间(APTT)或抗Xa因子活性，来评价本发明的促进HGF产生的药剂中所用的糖链化合物如寡糖或其盐的抗凝血活性。
可以通过将糖链化合物或其盐施用至小鼠或大鼠，在一定时间后取出血浆，并测定血浆中LPL的量，来评价在本发明的促进HGF产生的药剂中所使用的糖链化合物如寡糖或其盐的LPL释放活性。可以通过测定LPL活性、或用ELISA测定LPL蛋白质的质量来确定血浆中LPL的量。
因为本发明的药剂能促进HGF的产生，所以它能通过HGF的药理作用有效地防止或治疗各种疾病。本发明的促进HGF产生的药剂具有各种用途，例如作为肝疾病治疗剂、肾疾病治疗剂、伤口愈合剂、皮肤溃疡治疗剂、毛根细胞增殖剂、抗癌剂、肺损伤治疗剂、和癌症治疗中的副作用防止剂。更具体地，本发明的药剂可用于防止或治疗如下疾病，例如肝疾病(例如肝炎、肝硬化、肝衰竭、外科手术后的肝再生等)、肾疾病(例如肾小球肾炎、肾功能不全、肾贫血、糖尿病性肾病、给药后的肾损伤等)、皮肤疾病(例如白斑、烧伤、褥疮、皮肤溃疡、脱发等)、血液疾病(例如血小板减少症、骨髓移植等)、眼疾病(例如角膜溃疡等)、肺疾病(例如肺炎、肺气肿、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、尘肺、肺纤维症等)、胃或十二脂肠疾病(例如胃炎、胃溃疡、十二脂肠溃疡等)、癌症疾病和相关疾病(例如各种癌症、癌症治疗中的副作用例如肝毒性、肾毒性、恶心、呕吐、血小板减少、脱发等)、骨疾病(例如骨质疏松、骨发育不良、骨关节炎等)、和中枢疾病(例如神经分化异常症等)。
本发明的促进HGF产生的药剂可以采用各种制剂形式(例如注射剂、固体制剂、胶囊等)，优选将寡糖或其盐与常规载体一起制成为注射剂。可以通过常规方法制备注射剂，可以在约0.0001w/v％至5w/v％的范围内适当调整注射剂中寡糖或其盐的浓度。可以通过例如将寡糖或其盐溶于合适的溶剂(例如无菌水、缓冲液、生理盐水等)中，在无菌条件下用过滤器过滤溶液，将溶液装入到无菌容器中，从而制得该注射剂。优选的常规载体包括稳定剂如清蛋白、球蛋白、明胶、甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷、乙二醇等。此外，可以将寡糖或其盐溶于溶液中，该溶液包含制剂所必需的可药用添加剂，例如等张剂(例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、丙二醇等)、缓冲液(例如磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、谷氨酸缓冲液、ε-氨基己酸缓冲液等)、防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯代丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢醋酸钠、依地酸钠、硼酸、硼砂等)、增稠剂(羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇等)、稳定剂(亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等)、或pH调节剂(盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等)，在无菌条件下用过滤器过滤所得溶液，然后装入到无菌容器中。此外，可以使用适当的增溶剂如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、和非离子型表面活性剂(例如聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化的蓖麻油50等)。通常将配制的注射用溶液装入到合适的安瓿或小瓶中。希望在冷冻条件或冻干条件下贮藏液体制剂如注射剂。在使用前可以将冻干制剂再溶于注射用蒸馏水中。
此外，可以以软膏、凝胶或液体的形式，将本发明的促进HGF产生的药剂制成为外用制剂。可以通过例如将寡糖或其盐捏合到软膏基质(例如吸收性软膏、亲水软膏、聚乙二醇、纯化羊毛脂等)中来制备外用制剂。而且，在制备这些外用制剂时，可以使用硬化剂(例如十六醇、十八醇等)，在凝胶制剂的情况下，可以使用增稠剂(例如羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)。可以根据疾病的种类和外用药剂的应用位置等，将外用制剂中有效成分的含量适当调整到约0.0001w/w％至5w/w％。
可以根据本发明的促进HGF产生的药剂的剂型，通过合适的途径来施用它们。例如，可以通过静脉内、动脉内、皮下或肌内途径等施用注射剂。可以根据患者的病症、年龄、和体重等适当调整注射剂量。注射剂量通常为0.0001mg至500mg，优选0.01mg至100mg，每天适当施用一次或以分量方式每天施用几次，但是可以根据患者的病症、年龄、和体重等适当调整注射剂量。
本发明的促进HGF产生的药剂可以是糖链化合物如寡糖或其盐与HGF的混合制剂。因为已知当HGF作为与肝素或硫酸乙酰肝素的复合物形式施用到活体体内时，HGF的血浆半衰期会延长(Kato，Y.等人，Hepatology，1994，vol.20，p.417至424)，所以将糖链化合物如寡糖或其盐与HGF制成混合制剂，这能延长混合制剂中所含HGF的血浆半衰期。在这种情况下，寡糖或其盐与HGF的混合比通常为0.00002(w/w)至50,000(w/w)(寡糖/HGF)，优选0.01(w/w)至500(w/w)。于是，因为制剂中的糖链化合物如寡糖或其盐同时促进了活体中内源性HGF的产生，所以能更有效地通过HGF的作用治疗或防止疾病。由于相同的原因，当将本发明的促进HGF产生的药剂施用到活体体内时，还可以同时施用作为另一种制剂的HGF。
下列实施例进一步更详细地说明了本发明，但本发明根本不被这些实施例所限制。
实施例中所用各个简写的含义如下HGF肝细胞生长因子FCS胎牛血清DMEM培养基Dulbecco改良Eagle培养基PBS磷酸缓冲盐水ELISA酶联免疫吸附测定MALDI-TOF/MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法LPL脂蛋白脂肪酶APTT活化部分凝血活酶时间UA糖醛酸残基GlcN葡糖胺残基Ac乙酰基Arg精氨酸Gly甘氨酸Sac糖
2S2-O-硫酸6S6-O-硫酸NSN-硫酸实施例1将100mg高分子量肝素钠(Scientific Protein Laboratories Inc.)溶于2mL 50mM乙酸钠缓冲液(包含3mM乙酸钙)(pH7.0)中，向混合物中添加0.5单位肝素酶(SEIKAGAKU CORPORATION)，使它们在37℃反应10小时。在100℃将反应混合物加热2分钟，使反应停止。将0.3ml反应混合物上清液供应到Superdex 30pg色谱柱(φ1.6cm×60cm)(Amersham Bioscience)，进行凝胶过滤色谱法。使用200mM碳酸氢铵水溶液作为流动相，使溶液以0.4ml/min的流速通过色谱柱。监测洗出液在230nm处的吸光度，将洗脱液分级。基于分子大小来分离和回收肝素片段。所得肝素片段为二糖、四糖、六糖、八糖、十糖、十二糖、十四糖和十六糖的寡糖级分(图1)。
实施例2使用MRC-9细胞、人胎肺成纤维细胞来测定实施例1获得的肝素片段(寡糖)促进HGF产生的活性。用肝素片段(寡糖)培养细胞，分析细胞产生的HGF量。首先，以5×104个细胞/cm2的密度将MRC-9细胞接种到48孔平板上，在包含10％FCS的DMEM培养基中培养一天。除去培养基后，用0.5mL PBS将细胞洗涤两次，将培养基更换为包含1％FCS的DMEM培养基。然后，继续培养。此时，以最终浓度1μg/ml将实施例1中获得的肝素片段添加到培养基中。24小时后，回收培养基上清液，通过ELISA方法测定分泌到培养基中的HGF量。当添加市售低分子量肝素(Fragmin，Kissei Pharmaceutical Co.，Ltd.)时，细胞产生的HGF量相当于添加高分子量肝素情况下产生的HGF量，HGF产生水平比没有肝素时高出约5倍。而且，当添加实施例1中制备的不大于十六糖的肝素片段时，与不添加肝素相比，在不小于六糖的肝素片段中产生的HGF增加(图2)。
实施例3将实施例1获得的肝素片段的十糖级分(以下称为肝素十糖片段)冻干，再溶于水中。将所得溶液供应到MiniQ4.5/50色谱柱(AmershamBioscience)，用阴离子交换色谱法作进一步分离。通过线性梯度洗脱法洗脱肝素十糖片段，其中用含水NaCl作为洗脱液(流速0.5ml/min)，将NaCl的浓度从0M线性增加到1M。监测洗脱液在230nm处的吸光度并分级(图3)。据推测，因为硫酸基数量和位置的变化，使肝素十糖片段分离为许多峰，回收各个峰。将回收的级分编号为1至38，用与实施例2相似的方法测定每个峰促进HGF产生的活性(图4)。结果显示，大多数级分具有促进HGF产生的活性。从这些结果中可知，在展示促进HGF产生的活性时，肝素十糖片段中的一些特定结构不太可能具有重要作用，因此可以认为，在由重复的糖醛酸和葡糖胺组成的肝素十糖片段的基本结构中，在合适位置上存在的硫酸基是充足的。但是，据认为，促进HGF产生的活性随着硫酸基数量的增加而增加，因为后面级分(级分编号24至36)促进HGF产生的活性倾向于更高。
使用质谱仪(UltraFlex；Bruker Daltonics)，通过MALDI-TOF/MS分析来估计级分编号24、26、28、31和33中所含的肝素十糖片段内硫酸基的数量。通过用透析膜(截止分子量1000)透析每个级分，使其脱盐，冻干并再溶于水中，以制得样品。为了中和肝素片段中硫酸基所致的副电荷，在样品中混合碱性肽(Arg-Gly)19Arg([M+H]+＝4226.8(理论值))，使用咖啡酸作为基质，进行MALDI-TOF/MS分析(图5)。因为在该分析中，检测到肝素片段为与(Arg-Gly)19Arg的复合物，所以可以通过从m/z(质量/电荷)检测值中减去(Arg-Gly)19Arg的分子量来计算肝素片段的分子量。在所有级分中都检测到多个m/z信号，这显示多种组分共存于级分中。随着级分编号增加(从24至33)，m/z信号模式移向更高分子一侧，因此可以证实，在编号数更大的级分内，寡糖具有更多的硫酸基。从分子量估计级分编号24至33的组成，示于表1中。
表1

实施例4测定在不同位置被硫酸化的下列二糖化合物促进HGF产生的活性2-Sac-2S(肝素二糖III-H；由Sigma制造)、2-Sac-6S(ΔDiHS-6S；由SEIKAGAKU CORPORATION制造)和2-Sac-NS(ΔDiHS-NS；由SEIKAGAKU CORPORATION制造)(表2)(图6)。使用MRC-9细胞，按实施例2所述测定它们促进HGF产生的活性。此时，二糖化合物的浓度从0变至50μg/ml。
结果证明，所有二糖化合物都具有促进HGF产生的活性，虽然活性根据硫酸基的位置而改变，而且为了展示促进HGF产生的效果，与未分级肝素相比，需要以更高的浓度添加它们。证明2-Sac-6S和2-Sac-NS具有比2-Sac-2S高的促进HGF产生的活性，这说明，将葡糖胺残基的6-位羟基和/或2-位氨基硫酸化对于展示促进HGF产生的活性很重要。
表2 实施例5对于实施例1获得的肝素片段(寡糖)，测定其抗凝血活性和LPL释放活性。通过比较活化部分凝血活酶时间(APTT)来评估抗凝血活性。使用取自Wister大鼠(雄性)的新鲜血浆和通过鞣花酸来利用活化的Dataφ·APTT试剂盒(Sysmex)测定APTT。以9μg/mL或3μg/mL的浓度将肝素片段添加到大鼠血浆中，比较APTT值(第二个值)。
APTT测定结果示于图7中。当添加生理盐水代替肝素时，血浆迅速凝固，APTT为约20秒。当以9μg/mL的浓度将未消化的高分子量肝素添加到血浆中时，血浆凝固被抑制，APTT延长到200秒或更长时间。而且，当以3μg/mL的浓度添加高分子量肝素时，APTT为160秒或更长时间，在很大程度上抑制了血浆凝固。与高分子量肝素相比，对于市售低分子量肝素(Fragmin，Kissei Pharmaceutical Co.，Ltd.)，APTT的延长被抑制，但APTT的延长仍具有显著的水平。当以9μg/mL的浓度添加实施例1的十六糖肝素片段时，APTT为约46秒。因此，与不添加肝素时相比，APTT延长，但APTT延长的程度显著短于Fragmin，这说明抗凝固活性在很大程度上减少了。此外，随着分子大小减少，APTT缩短。在9μg/mL或3μg/mL的浓度下，不大于四糖的寡糖的APTT相当于添加生理盐水时的APTT。
为了测定LPL释放活性，以0.3μg/克体重将肝素片段通过尾静脉施用到Wister大鼠(3-周大，雄性)体内，10分钟后，从腋窝静脉丛取血，通过ELISA(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)测定所得血浆中的LPL量。所释放LPL量的测定结果示于图8中。在高分子量肝素中，释放了约250ng/mL LPL，而在低分子量肝素(Fragmin，Kissei PharmaceuticalCo.，Ltd.)中，所释放的LPL量减至高分子量肝素情况下的约30％。在实施例1制备的肝素片段中，所释放的LPL量也随着肝素片段分子大小的减少而减少。尤其是，在不大于八糖的寡糖中，所释放的LPL量显著减少。
实施例6为了进一步检查实施例1中所得肝素十糖片段的抗凝血活性，测定抗Xa因子活性和抗IIa因子活性。
为了测定抗Xa因子活性，将2.5μL抗凝血酶III(2.5U)溶液添加到22.5μL样品溶液中，在37℃下将混合物培育3分钟，向其中添加12.5μL抗凝血因子Xa溶液(7.1nkat S-2222/mL)。向混合溶液中添加2.5μLS-2222溶液(0.75mg/mL)(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)，它是Xa因子的底物，在37℃下使混合物反应3分钟，通过添加37.5μL 50v/v％含水乙酸停止反应。通过分析405nm处的吸光度来测定颜色强度。因为S-2222与Xa因子反应而释放出对硝基苯胺，从而产生了颜色。与不包含具有抗Xa因子活性的物质的样品相比，包含具有抗Xa因子活性的物质的样品的颜色强度减少，这意味着，颜色强度的这种减少(ΔA405)反映了样品中的抗Xa因子活性。用标准低分子量肝素(抗Xa因子活性175U/mg，抗IIa因子活性69U/mg；National Institute of Health Science)制备抗Xa因子活性对ΔA405的校正曲线，基于校正曲线确定受试样品的抗Xa因子活性。用S-1127(0.625mg/ml；Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd)、抗凝血因子IIa(0.4U/ml)和0.01M柠檬酸分别取代S-2222、Xa因子和50％(v/v)含水乙酸，类似地测定抗IIa因子活性。
抗Xa因子活性和抗IIa因子活性的测定结果示于表3中。市售低分子量肝素Fragmin的抗Xa因子活性和抗IIa因子活性分别减至未分级肝素的75％和32％。另一方面，肝素十糖片段的抗Xa因子活性和抗IIa因子活性分别显著减至未分级肝素的12％和4％。
表3

实施例7对于实施例4所述的在不同位置被硫酸化的二糖化合物如2-Sac-2S(Sigma)、2-Sac-6S(SEIKAGAKU CORPORATION)、和2-Sac-NS(SEIKAGAKU CORPORATION)，通过与实施例5相似的方法测定它们的抗凝血活性和LPL释放活性(图9和图10)。在所有二糖化合物中，均未检测到抗凝血活性和LPL释放活性。
实施例8对于其中仅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化(仅N-硫酸化)的修饰肝素(CDSNS-肝素，由SEIKAGAKU CORPORATION制造)，通过与实施例2相似的方法，用MRC-9细胞测定其促进HGF产生的活性(图11)。在该测定中，其中仅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修饰肝素的浓度在0至50μg/mL的范围内变化。虽然其中仅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修饰肝素促进HGF产生的活性稍弱于未分级肝素，但其最大活性几乎等于普通未分级肝素的最大活性。
此外，为了检查其中仅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修饰肝素的抗凝血活性，通过与实施例5相似的方法测定APTT(图12)。在其中仅葡糖胺的2-位氨基被硫酸化的修饰肝素中，APTT没有延长，因此没有检测到抗凝血活性。
工业应用性本发明的促进HGF产生的药剂可以促进HGF的产生，并抑制出血倾向的副作用，可用于促进活体内受损的组织或器官的治愈。


本发明的目的在于提供一种促进HGF产生的药剂，该药剂包括二糖或具有如下结构的三糖至十六糖的寡糖或其盐作为有效成分，所述二糖由通过α1，4－糖苷键或β1，4－糖苷键连接的糖醛酸残基(其中糖醛酸是指艾杜糖醛酸或葡糖醛酸，并在下文中具有相同的含义)和葡糖胺残基组成，在所述结构中通过α1，4－糖苷键或β1，4－糖苷键交替并重复地连接糖醛酸残基和葡糖胺残基，其中糖醛酸残基和/或葡糖胺残基的至少一个羟基可被硫酸化、烷基化、酰化或胺化，和/或至少一个葡糖胺残基的2－位氨基可被硫酸化、烷基化或酰化。本发明的促进HGF产生的药剂可用于促进活体的受损组织或器官的愈合。