专利名称：用于治疗呼吸道病毒性感染的ev576的制作方法与SARS和大流行性流感有关的死亡率与快速进展的呼吸衰竭有关，其引起急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在某些情况下，多器官衰竭也是一个特征。在大流行性H5N1流感的情况下，由于呼吸衰竭和多器官衰竭引起的死亡率大约为60%。最近已经描述了致死的HlNl流感的主要肺部病理，并且通过坏死性肺泡炎和密集的嗜中性 粒细胞浸润来表征[I]。最初，假定与SARS和大流行性流感有关的呼吸衰竭归因于快速的病毒复制，其导致了呼吸道靶细胞例如肺泡上皮细胞的细胞溶解破坏，或导致了病毒逸出到远离呼吸系统的组织和器官中，例如中枢神经系统。但是，最近的证据已经表明呼吸衰竭的发展实际上与高病毒滴度无关。而研究人员已经发现呼吸衰竭与前炎症细胞因子如TFNa和IFNP的明显升高有关。这导致专家提出，这些并发症的发病机理是对先天免疫系统不恰当的刺激触发了所谓的“细胞因子风暴”[2，3]。目前对呼吸衰竭的治疗包括使用氧气面罩来提高患者的氧水平，使用通风机进行机械氧合，或在最严重的情况下，进行体外膜式氧合(ECMO)，其包括将患者的血液在体外进行循环并向其中人工加氧。人们亟需一种制剂，用于改进目前能够使用的对于呼吸道病毒性感染的炎症效应引起的呼吸衰竭的治疗。
因此，本发明提供一种治疗或预防呼吸道病毒性感染的炎症效应的方法，其包括给需要其的对象施用治疗或预防有效量的制剂，该制剂能抑制补体经典途径、补体替代途径和补体凝集素途径。本发明还提供一种用于治疗或预防呼吸道病毒性感染的炎症效应的治疗或预防有效量的制剂，其能抑制补体经典途径、补体替代途径和补体凝集素途径。补体系统是身体自然防御外来入侵机制的主要部分，并且还与炎症过程有关。在血清中和细胞表面有30多种蛋白与补体系统功能和调节有关。最近已经变得更清楚与补体系统的约35种可能与有益过程和病理过程均有关的已知成分一样，补体系统本身与至少85种生物途径相互作用并具有如血管新生、血小板活化、葡萄糖新陈代谢和精子生成的多种功能。补体系统通过外来抗原活化。存在三种活化途径(I)经典途径，其通过IgM和IgG复合物或通过碳水化合物的识别来活化；(2)替代途径，其通过非自表面(缺乏特异性调节分子)和通过细菌内毒素来活化；和(3)凝集素途径，其通过将甘露聚糖结合凝集素(MBL)结合到病原体表面上的甘露糖残基上来活化。这三种途径包含平行级联的事件，其通过在细胞表面上形成类似的C3和C5转化酶导致急性炎症调节因子(C3a和C5a)的释放和形成膜攻击复合物(MAC)，而导致补体活化的产生。图I所示为经典途径和替代途径中所包括的平行级联。补体系统被认为是先天免疫应答的早期活化剂，其引发许多炎症级联反应。但是，以前没有暗示其为引起呼吸系统病毒性感染的呼吸并发症的原因。令人惊讶的是，本申请所给出的数据第一次表明，抑制补体替代途径、补体经典途径和补体凝集素途径的制剂降低了呼吸道病毒性感染的炎症效应。呼吸道病毒性感染炎症效应的降低可以通过遭受这种病毒性感染的对象的炎症细胞因子和/或嗜中性粒细胞的降低来评价。在本发明的一个方面中，与未治疗的对象相t匕，施用抑制补体替代途径、补体经典途径和补体凝集素途径的制剂可因此降低遭受呼吸道病毒性感染的对象中的炎症细胞因子如CXCL2、IL-1 P和/或IL-6的水平。与未治疗的对象相比，将抑制补体替代途径、补体经典途径和补体凝集素途径的制剂施用于遭受呼吸 道病毒性感染的对象还可降低嗜中性粒细胞的水平。细胞因子水平和嗜中性粒细胞水平例如可以在来自该对象的支气管肺泡灌洗(BAL)液中进行评价。在本发明的一个方面中，该制剂可以结合补体C5。该制剂可以用于阻止补体C5通过C5转化酶而裂解成补体C5a和补体C5b-9。与未治疗的对象相比，该制剂可以用于降低遭受呼吸道病毒性感染的对象中的C5a水平，例如在来自这样的对象的BAL液中进行。令人惊讶的是，本申请所给出的数据首次表明，在呼吸道病毒性感染之后，BAL液中的C5a明显升闻。补体C5蛋白(在此也称作C5)通过C5转化酶来裂解，它本身由C3a形成，其是替代途径的早期产物(图I)。这种裂解的产物包括过敏毒素C5a和裂解复合物C5b-9 (也称作膜攻击复合物(MAC))。C5a是一种高反应性肽，与许多病理炎症过程有关，包括嗜中性粒细胞和嗜曙红细胞趋化性、嗜中性粒细胞活化、毛细管渗透性增加和嗜中性粒细胞凋亡的抑制[4]。MAC与其他重要的病理过程有关，包括风湿性关节炎[5 ；6]、增生性血管球性肾炎、原发性膜性肾病[8]、蛋白尿[9]、急性轴索损伤后的脱髓鞘[10]，以及导致异种器官移植后的急性移植排斥[11]。C5a已经成为与补体有关的病症领域中的一种特别令人感兴趣的靶标[12]。尽管C5a具有许多公知的病理关联，但它在人体中的消耗产生的影响似乎是有限的。已经开发了结合和抑制C5a或C5a受体的单克隆抗体和小分子以治疗各种自体免疫疾病。但是，这些分子不能阻止MAC的释放。相反，本发明所用的制剂抑制C5a肽和MAC 二者的形成。因为C5是补体经典途径和补体替代途径的后产物，C5的抑制不太可能与当靶向级联中早期产物时存在的伴随感染风险有关[13]。制剂结合C5的能力可通过本领域已知的标准体外检测来确定，例如将蛋白和标记的C5在凝胶上孵育后，通过蛋白免疫印迹技术来确定。优选地，本发明的制剂与C5结合的IC5。值小于0. 2mg/ml,优选小于0. lmg/ml,优选小于0. 05mg/ml,优选小于0. 04mg/ml,优选小于0. 03mg/ml,优选0. 02mg/ml,优选小于I y g/ml,优选小于100ng/ml,优选小于IOng/ml,仍然更优选小于lng/ml。根据本发明的一个实施方案，结合C5的制剂不是抗-C5单克隆抗体。本发明还提供一种治疗或预防呼吸道病毒性感染的炎症效应的方法，其包括给需要其的对象施用治疗或预防有效量的能抑制类花生酸活性的制剂。本发明还提供一种用于治疗或预防呼吸道病毒性感染的炎症效应的治疗或预防有效量的制剂，其能抑制类花生酸活性。根据本发明的这个方面，所述制剂可抑制白三烯B4(LTB4)活性。具体地，根据本发明的这个方面，该制剂能够结合LTB4。该制剂结合LTB4的能力可以通过本领域已知的标准体外检测来确定，例如将该蛋白和标记的LTB4在凝胶上孵育后，使用蛋白免疫印迹技术来确定。本发明的制剂可与LTB4结合,其IC5tl值小于0. 2mg/ml,优选小于0. lmg/ml,优选小于0. 05mg/ml,优选小于0. 04mg/ml,优选小于0. 03mg/ml,优选0. 02mg/ml,优选小于I ii g/ ml,优选小于100ng/ml,优选小于10ng/ml,仍然更优选小于lng/ml。在一个方面中，本发明提供一种治疗或预防呼吸道病毒性感染的炎症效应的方法，其包括给需要其的对象施用治疗或预防有效量的制剂，该制剂a)抑制补体经典途径、补体替代途径和补体凝集素途径；和b)抑制类花生酸活性。本发明还提供一种治疗或预防有效量的制剂，其抑制a)补体经典途径、补体替代途径和补体凝集素途径；和b)类花生酸活性，该制剂用于治疗或预防呼吸道病毒性感染的炎症效应。根据本发明该方面的一个实施方案，该制剂结合C5和LTB4 二者。该实施方案的制剂因此能够用于阻止补体C5通过C5转化酶而裂解成补体C5a和补体C5b_9 (MAC)，以及抑制LTB4活性。这里所描述的本发明的方法和用途可以用于治疗或预防上或下呼吸道病毒性感染的炎症效应。具体地，此处所描述的本发明的方法和用途可以用于治疗或预防病毒性感染引起的呼吸衰竭，包括急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征。本发明的方法和用途还可以用于治疗或预防病毒性感染引起的呼吸衰竭后遗症，包括多器官衰竭。炎症可以是由于上或下呼吸道的任何病毒性感染引起的。具体地，本发明的方法和用途可治疗或预防大流行性流感病毒感染引起的炎症效应，例如流感A H5N1 (禽流感)和流感A H1N1(猪流感)。本发明的方法和用途还可以用于治疗或预防SARS冠状病毒感染引起的炎症效应。优选地，本发明的制剂源自吸血性节肢动物。术语“吸血性节肢动物”包括所有从合适的宿主上取食血液的节肢动物，如昆虫、蜱虫、虱子、跳蚤和螨虫。优选地，该制剂源自蝶虫，优选源自非洲毛白钝缘蝶(Ornithodoros moubata)。根据本发明的一个实施方案，该制剂是包含如图2所示的氨基酸序列中氨基酸19-168的蛋白或这种蛋白的功能性等价物。该制剂可以是由如图2所示氨基酸序列中氨基酸19-168组成的蛋白或是这种蛋白的功能性等价物。根据一个替代性实施方案，本发明该实施方案所用的蛋白可以包含或由如图2所示氨基酸序列中氨基酸1-168组成，或是其功能性等价物。图2给出的蛋白序列中第一批18个氨基酸形成了信号序列，其不需要C5结合或LTB4结合活性，因此例如为了提高重组蛋白生成的效率，可以任选地省掉这些氨基酸。具有图2给出的氨基酸序列的蛋白(在此也称作EV576蛋白)是从非洲毛白钝缘蝶(Ornithodoros moubata)的唾液腺中分离的。EV576是脂质运载蛋白(Iipocalin)家族的远亲成员，并且是第一种显示出抑制补体活化的脂质运载蛋白家族成员。EV576蛋白通过结合C5并阻止其通过C5转化酶而裂解成补体C5a和补体C5b_9来抑制补体替代途径、补体经典途径和补体凝集素途径，从而抑制C5a肽和MAC 二者的作用。EV576蛋白还结合LTB4。如本文所用，术语“EV576蛋白”是指图2给出的序列，其具有或不具有信号序列。 EV576蛋白和这种蛋白抑制补体活化的能力已经公开在[14]中，这里EV576蛋白被称作“OmCI蛋白”。EV576蛋白也还显示出可有效治疗重症肌无力[15]，呼吸紊乱[16]和末梢神经紊乱[17]。EV576蛋白结合类花生酸(包括LTB4)的能力和它在治疗由白三烯(Ieukotriene)或羟基类花生酸调节的疾病中的作用已经在[18]中提到。这些公开文献都没有提出EV576蛋白能够用于治疗或预防病毒性感染，特别是治疗或预防呼吸道病毒性感染的炎症效应。现在已经发现EV576蛋白在治疗和预防呼吸道病毒性感染的炎症效应方面令人惊讶地有效。这里所提供的数据表明，在人类呼吸道HlNl流感感染的鼠科模型中，与载体治疗的小鼠相比，用EV576治疗的小鼠具有明显更低水平的蛋白和总细胞，更低水平的补体C5a，更低水平的炎症细胞因子IL-6、IL-1 ^和CXCL2，明显低得多的嗜中性粒细胞。因此EV576代表了一种潜在的人类治疗，用于治疗和预防呼吸道病毒性感染的炎症效应。EV576在治疗呼吸疾病方面令人惊讶的效果可以归因于这样的事实，即，它通过结合C5起作用而抑制C5a和MAC的形成，或归因于它的LTB4结合活性。根据本发明的另一实施方案，该制剂可以是编码EV576蛋白或其功能性等价物的核酸分子。例如，可在体内或体外实施基因治疗，通过对象的相关细胞影响EV576蛋白的内源性生成。另一方案是施用“裸DNA”，其中将治疗基因直接注入到血流中或肌肉组织中。优选地,这样的核酸分子包含或由如图2所示核苷酸序列中的碱基53-507组成。该核苷酸序列编码如图2所示的EV576蛋白，其无信号序列。如图2所示核苷酸序列中第一批54个碱基编码了该信号序列，其不需要补体抑制活性或LTB4结合活性。或者，该核酸分子可包含或由如图2所示核酸序列中的碱基1-507组成，其编码具有信号序列的蛋白。EV576蛋白已经被证实能够结合到C5上并阻止它通过C5转化酶而裂解，在大鼠、小鼠和人类血清中其IC5tl值为约0. 02mg/ml。优选地，保持结合C5能力的EV576蛋白的功能性等价物的IC5tl值小于0. 2mg/ml，优选小于0. lmg/ml，优选小于0. 05mg/ml，优选小于0. 02mg/ml，优选小于I y g/ml，优选小于100ng/ml，优选小于10ng/ml，仍然更优选小于lng/mlo此外，已经证实EV576蛋白结合LTB4。该EV576蛋白的功能性等价物同样也可以保持结合LTB4的能力，具有类似于EV576蛋白的亲和力。在一个方面中，术语“功能性等价物”在此用于描述EV576蛋白的同源物和片段，其a)保持了它结合C5的能力并阻止补体C5通过C5转化酶而裂解成补体C5a和补体C5b-9 ;和/或b)保持了它结合LTB4的能力。术语“功能性等价物”还指结构类似于EV576蛋白的分子或包含类似或相同的三级结构的分子，特别是在EV576蛋白结合到C5和/或LTB4的一个或多个活性位点的环境中，如合成分子。在[18]中描述了 EV576中很可能是LTB4结合所需的氨基酸。术语“同源物”表示包括所指的图2中明确确认的EV576序列的旁系同源物和直系同源物，包括例如来自其他蜱虫物种的EV576蛋白序列，包括具尾扇头蜱(Rhipicephalus appendiculatus)、血红扇头蜱(R. Sanguineus)，囊形扇头蜱(R. bursa)、美洲花蜱(A. americanum)、卡宴花蜱(A. cajennense)、希伯来花蜱(A. hebraeum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、环形牛蜱(B. annulatus)、消色牛蜱(B. decoloratus)、网纹革蜱(Dermacentor reticulatus)、安氏革蜱(D. andersoni)、边缘革蜱(D. marginatus)、变异革蜱(D. variabilis)、无角血蜱(Haemaphysalis inermis)、犬血蜱(Ha. Leachii)、长棘血蜱(Ha. Punctata)、小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、嗜骑璃眼蜱(Hy. Dromedarii)、边缘璃眼蜱(Hy. marginatum marginatum)、菌子硬蜱(Ixodes ricinus)、全沟硬蜱(I. persulcatus)、肩突硬蜱(I. scapularis)、六角硬蜱(I. hexagonus)、波斯隐_蜱(Argaspersicus)、翅缘锐缘蜱(A. refIexus)、游走鸟壁風(Ornithodoros erraticus)、非洲毛白钝缘蜱(0. moubata moubata)、非洲嗜猪钝缘蜱(0. m. porcinus)和萨氏钝缘蜱(O.savignyi)。术语“同源物”还表示包括源自蚊子物种的EV576蛋白序列等价物，包括库蚊属、按蚊属和伊蚊属的蚊子，特别是致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae);跳蚤物种例如猫柿首蚤(Ctenocephalides felis)(猫跳蚤)；马蝇；白蛉；黑蝇；釆釆蝇；風子；螨虫；水蛭和扁形虫。天然EV576蛋白被认为以另外三种大约18kDa的形式存在于非洲钝缘蜱(0. moubata)中，并且术语“同源物”表示包括这些替代形式的EV576。鉴别图2给出的EV576序列同源物的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，同源物可以通过对公共和私人的序列数据库进行同族检索来鉴别。尽管私人的或商业的数据库同样是有用的，特别是在它们包含公共数据库不具有的数据时更是如此，但可便利地使用公众能够利用的数据库。主要的数据库是主核苷酸或氨基酸序列数据存放的位置，并且可以是公共的或商业的。公共可用的主数据库的实例包括 GenBank 数据库(http://www.ncbi.nlm.mh.gov/)，EMBL 数据库(http://www.ebi.ac.uk)，DDBJ 数据库(http://www. ddbj. nig. ac. jp/)，SWISS-PROT 蛋白质数据库(http://expasy. hcuge. ch/)，PIR(http://pir. georgetown. edu/)，TrEMBL (http: //www. ebi. ac. uk)，TIGR 数据库(参见 http://www. tigr. org/tdb/index, html)， NRL-3D 数据库(http://www. nbrfa. georgetown. edu)，蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)，NRDB数据库(ftp://ncbi. nlm. nih. gov/pub/nrdb/README)，0WL数据库(http://www. biochem. ucl. ac. uk/bsm/dbbrowser/OWL/)和次要数据库PR0SITE(http://expasy.hcuge. ch/sprot/prosite. html)， PRINTS (http: //iupab. leeds. ac. uk/bmb5dp/prints. html)，
Profiles (http://ulrec3.unil. ch/software/PFSCAN form, html),Pfam (http: //www. sanger. ac. uk/software/pfam)，Identify (http: //dna. Stanford, edu/identify/)和Blocks (http://www. blocks, fhcrc. org)数据库。商业可用的数据库或私人数据库的实例包括PathoGenome (基因组治疗公司(Genome Therapeutics Inc.))和PathoSeq(之前属英赛特制药公司(Incyte Pharmaceuticals Inc.))。通常，两种多肽之间大于30%的同一性(优选在特定区域如活性位点)被认为是 功能性等价的指示，因此是两种蛋白同源的指示。优选地，作为同源物的蛋白与图2所示的EV576蛋白序列所具有的同一性大于60%。更优选地，同源物分别与图2给出的EV576蛋白序列所具有的同一性大于70%、80%、90%、95%、98%或99%。此处所述的同一性百分比是使用BLAST2. I. 3版，并使用通过NCBI (the National Center for Biotechnology Information http://www. ncbi. nlm. nih. gov/) [Biosum 62 矩阵；缺口出现罚分=11 和缺口延伸罚分=1]系统设定的默认参数来确定的。图2给出的EV576蛋白序列的同源物包括来自野生型序列的含有氨基酸替换、插入或缺失的突变体，其涉及例如1、2、3、4、5、7、10或更多氨基酸，前提是这些突变体保持了结合C5的能力。因此，突变体包括含有保守氨基酸替换的蛋白，该替换不以不利的方式影响蛋白的功能或活性。该术语也旨在包括天然生物变体(例如在EV576蛋白源自的物种中的等位基因变体或地理变体)。具有增强的结合C5和/或LTB4能力的突变体也可以通过在蛋白序列中对特定残基进行系统或定向的变异来设计。EV576蛋白的片段和EV576蛋白同源物的片段也包括在术语“功能性等价物”中，前提是这样的片段保留了结合C5和/或LTB4的能力。片段可以包括例如衍生自EV576蛋白序列的多肽，其小于150个氨基酸，小于125个氨基酸，小于100个氨基酸，小于75个氨基酸，小于50个氨基酸，或甚至25个氨基酸或更少，前提是这些片段保留了结合到补体C5上的能力。作为这样的片段不仅包括本文图2中明确确认的非洲钝缘蜱(0. moubata)EV576蛋白的片段，而且还包括如上所述的该蛋白的同源物的片段。这样的同源物的片段通常与图2的EV576蛋白序列片段具有大于60%的同一性，尽管更优选同源物的片段将表现出分别与图2的EV576蛋白序列片段具有大于70%、80%、90%、95%、98%或99%的同一性。改进的片段当然可以对野生型序列进行系统的突变或片段化来合理地设计，随后进行适当的活性检验。片段可以表现出对于C5和/或LTB4具有类似于EV576或更大的亲和力。本发明所用的功能性等价物可以是融合蛋白，其例如通过在编码异源蛋白序列的框架中克隆编码EV576蛋白的多核苷酸来获得。术语“异源的”用于本文旨在表示除了EV576蛋白或其功能性等价物以外的任何多肽。可包含在可溶性融合蛋白的N-或C-末端的异源序列的实例如下膜结合蛋白的胞外区、免疫球蛋白恒定区(Fe区)、多聚化区、胞外蛋白区、信号序列、输出序列，或允许通过亲和层析来纯化的序列。这些异源序列中多数是在表达质粒中市售的，因为这些序列通常包括在融合蛋白中以提供另外的性能，而不明显地削弱与之融合的蛋白的特定生物活性[19]。这类另外性能的实例是，在体液中更长的持续半衰期、胞外定位，或允许通过标记例如组氨酸或HA标记的更简易纯化方法。
EV576蛋白及其功能性等价物可以以重组形式通过在宿主细胞中表达来制备。这样的表达方法是本领域技术人员公知的，在[20]和[21]中有详细描述。重组形式的EV576蛋白及其功能性等价物优选非糖基化的。本发明的蛋白和片段还可以使用常规的蛋白化学技术来制备。例如，蛋白片段可以通过化学合成来制备。产生融合蛋白的方法是本领域常规的，并且是本领域技术人员已知的。例如，大部分的普通分子生物学、微生物重组DNA技术和免疫技术可以在[20]或[22]中找到。在本发明的方法或用途中施用所述制剂的对象优选是哺乳动物，优选人类。施用所述制剂的对象还会是患有上或下呼吸道病毒性感染，如大流行性流感病毒，包括流感AH5N1 (禽流感)和流感AHlNl (猪流感)，或SARS冠状病毒。该制剂是以治疗或预防有效量来施用的。术语“治疗有效量”指的是治疗或改善与病毒性感染有关的炎症所需的制剂量。本文所用术语“预防有效量”是指预防与本发明 的病毒性有关的炎症所需的制剂量。优选该制剂的剂量足以在对象体内结合尽可能多的可利用的C5，更优选全部可利用的C5。或者，该制剂的剂量可为足以在对象体内结合尽可能多的可利用的LTB4，更优选全部的可利用的LTB4。在一些方面中，该制剂的剂量足以结合尽可能多的可利用的C5和LTB4，例如全部可利用的C5和LTB4。所提供的该制剂的剂量至少是在对象体内结合全部可利用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的两倍。所提供的该制剂的剂量可以是在对象体内结合全部可利用的C5和/或LTB4所需的摩尔剂量的2. 5倍、3倍或4倍。优选该剂量是0. 0001mg/kg(药物质量比患者体重)_20mg/kg,优选 0. 001mg/kg-10mg/kg,更优选 0. 2mg/kg-2mg/kg0施用所需剂量的频率将取决于所涉及的制剂的半衰期。在制剂是EV576蛋白或其功能性等价物的情况下，该剂量可以作为连续输入施用，以单次剂量或基于每日一次，每日两次，或每2、3、4天，5、6、7、10、15或20天或更多天一次施用。精确的剂量和剂量频率还可以取决于施用时患者的状态。在确定剂量时要考虑的因素包括患者病情的严重程度、患者一般健康状况、年龄、体重、性别、膳食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和患者对于治疗的耐受度或反应。精确的量可以通过常规试验来确定，但是最终取决于临床医生的判断。该制剂通常将作为药用载体的一部分来施用。如本文所用，术语“药用载体”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和失活病毒粒子或甚至任何其他制剂，前提是该载体本身不诱导毒性效应或导致对接受该药学组合物的个体有害的抗体产生。药用载体可以另外地包含液体如水、盐水、甘油、乙醇或辅助物质如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物等。因此所用的药用载体将根据施用途径而变化。载体能够将药物组合物配制成片剂、丸齐U、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、糖浆剂、混悬剂来帮助患者摄入。关于药用载体的详细讨论在[23]中可以找到。该制剂可以通过任何已知的施用途径来递送。该制剂可以通过经鼻吸入递送，例如使用计量吸入器、喷雾器、干粉吸入器，或经鼻吸入器。该制剂可以通过非胃肠途径来递送(例如通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射，或递送到组织的细胞间隙)。该组合物也可以施用到伤口。其他施用模式包括口服和肺部施用、栓剂和透皮或经皮应用，针和无针注射。该制剂可以单独施用或作为治疗方案的一部分施用，同时还包括施用目前治疗呼吸疾病患者所用的其他药物。例如，该制剂可以与另外的抗病毒药的输注和/或氧气治疗组合来施用。该制剂可以与其他药物同时、依次或分别施用。例如，该制剂可以在其他药物施用之前或之后施用。本发明因此提供一种结合05和/*LTB4的制剂，优选是EV576蛋白或其功能性等价物，用于治疗或预防对象的呼吸道病毒性感染的炎症效应，其中所述的对象已经用抗病毒药进行了预治疗。能够用于本发明这个方面中的抗病毒药的实例包括扎那米韦(zanamivir)(瑞乐沙(Relenza))和奥司他韦(oseltamivir)(克流感(Tamiflu))。本发明不同的方面和实施方案现将以实施例的形式来更详细地描述。应当理解，在不脱离本发明的范围下可以进行细节上的修改。


图I :补体活化经典途径和替代途径的示意图。酶成分，黑灰色。过敏毒素包括在星形符中。图2 EV576的主序列。信号序列下划线。半胱氨酸残基处于粗体类型中。核苷酸和氨基酸数目表示在右边。图3 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时嗜中性粒细胞降低。图4 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时总细胞降低。图5 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时总蛋白降低。图6 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相t匕，在IO6空斑形成单位(PFU)时嗜中性粒细胞降低。图7 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相t匕，在IO6空斑形成单位(PFU)时总细胞降低。图8 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相t匕，在IO6空斑形成单位(PFU)时总蛋白降低。图9 :将EV576(0mCI)施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时IL-6水平降低。图10 :将EV576 (OmCI)施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时CXC2水平降低。图11 :将EV576 (OmCI)施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时IL-I ^降低。图12 :将EV576 (OmCI)施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相比，在IO6空斑形成单位(PFU)时IL-6水平降低。图13 :将EV576 (OmCI)施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相比，在IO6空斑形成单位(PFU)时CXC2水平降低。图14 :将EV576 (OmCI)施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相比，在IO6空斑形成单位(PFU)时IL-I P水平降低。图15 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时嗜中性粒细胞/IOOmg肺组织相对降低。图16 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO6空斑形成单位(PFU)时嗜中性粒细胞/IOOmg肺组织相对降低。图17 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时总的组织病理学分数。 图18 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相t匕，在IO6空斑形成单位(PFU)时总的组织病理学分数。图19 :与模拟接种(mock inoculation)相比,在IO4空斑形成单位(PFU)的接种体水平时，在猪流感感染的鼠科模型中支气管肺泡灌洗液(BALF)的C5a水平。图20 :与模拟接种相比，在IO6空斑形成单位(PFU)的接种体水平时，在猪流感感染的鼠科模型中支气管肺泡灌洗液(BALF)的C5a水平。图21 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用EV131或载体相比，在IO4空斑形成单位(PFU)时C5a水平降低。图22 :将EV576施用于猪流感感染的鼠科模型之后，与在相同模型中施用载体相t匕，在IO6空斑形成单位(PFU)时C5a水平降低。

与在IO4空斑形成单位(PFU)时载体治疗的小鼠相比，用EV576治疗的小鼠具有明显更低的蛋白水平(图5)和总细胞(图4)和明显更低的嗜中性粒细胞(图3和15)。与载体治疗相比，用EV576治疗的小鼠在IO6PFU时也具有明显更低的嗜中性粒细胞。与假(模拟)治疗动物相比，在IO4PFU时载体治疗的和rEV131小鼠具有非常明显(p〈0. 001)升高的总细胞、嗜中性粒细胞和蛋白。与载体治疗的动物相比，用EV576治疗的动物具有明显较小升高的总细胞(P〈0. 05)和嗜中性粒细胞(p〈0. 01)(图3和4)。在IO6PFU时仅仅总细胞(P〈0. 05)和嗜中性粒细胞(p〈0. 001)比假治疗的动物升高，并且与载体治疗相比用EV576治疗的小鼠体内嗜中性粒细胞的升高明显更小(p〈0. 05)(图6-8和16)，但是由于BAL是在第3天而非第6天对垂死的动物进行的，因此很可能HlNl流感的呼吸并发症效应还没有时间来完全发展，所以补体抑制的任何可能的保护效应并不明显。与假(模拟)治疗的动物(图9-11)相比，已发现在载体和rEV131治疗的组中，低接种体组的BAL液中炎症细胞因子IL-I ^、IL-6和CXCL2的水平明显(p〈0. 05)或非常明显地(p〈0.01)升高，然而尽管升高了，但是EV576治疗的动物并非明显不同。按照细胞结果，在高接种体组中的差异不太明显(图12-14)。图17和18分别表示了低和高接种体小鼠的肺炎的全部组织病理学分数的总和。该组织病理学分数之和是采用气道炎症、血管炎症、间质炎症、嗜中性粒细胞炎症和上皮损伤的分数来计算的。EV576降低了低接种体组中的上皮损伤和炎症。这种组氨清除蛋白EV131不太有效。这些数据证明EV576明显抑制了 HlNl感染的炎症效应。已知EV576通过结合C5和抑制类花生酸活性而抑制补体系统。这些数据表明EV576和其他具有类似C5结合特性的制剂能够有效地降低病毒性感染的肺炎效应。实施例2将具有如图2所示氨基酸序列的EV576蛋白在人呼吸道HlNl流感感染的鼠科模型中进行测试，测试它对于补体C5a水平的作用。方法BalbC小鼠是如上述实施例I1那样进行感染和治疗的。BALF中的C5a水平基于天数在模拟接种的动物中测量，暴露于人HlNl病毒亚致死剂量(IO4PFU)的动物的第1、4、7和10天，和暴露于人HlNl病毒致死剂量(IO6PFU)的动物的第1、3和5天。在第6天，测量已经用载体、EV131或EV576进行治疗的低接种体动物的BALF中的C5a水平。在第3天，测量已经用载体或EV576进行治疗的高接种体动物的BALF中的C5a水平。结果如图19-22所示。结果在高和低接种体水平二者感染后多达10天，BAL液中的C5a明显升高(图19和20)。用EV576治疗的小鼠C5a水平的增加明显减弱。载体和EV131没有削弱C5a水平的、增加(图21和22)。这是第一次，即在由HlNIl流感感染引起的炎症中证实了补体的直接作用。补体中的这种升高可以使用补体抑制剂EV576来阻止。EV576阻止补体和相关炎症的能力表明它在治疗HlNl流感感染中是有效的。实施例3H5N1感染之后，也存在HlNl感染之后的细胞因子风暴和相关的炎症。因此可以预期HlNl感染之后，EV576阻止补体升高和相关炎症的能力在H5N1感染之后也将得到再现。具有如图2所不氣基酸序列的EV576蛋白可以使用上面和参考文献24中报道的试验方案，在人H5N1流感感染呼吸道的鼠科模型中进行测试。在H5N1或HlNl流感感染之后，还可确定奥司他韦(oseltamivir)(克流感(Tamiflu))与EV576组合的作用。方法该试验方案类似于参考文献24所报道的方案。
将20_23g标准体重、无病原体的8周龄雌性小鼠(例如FVB/J品系)用获自法国巴斯德研究所(Institut Pasteur)的人H5N1病毒或HlNl病毒经鼻感染或使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行假感染。具有如图2所示氨基酸序列的EV576蛋白通过腹膜注射施用。小鼠也可以接受奥司他韦(oseltamivir)。使用PBS作为对照。在每个感染模型中可以分为四组(I)病毒+PBS, (2)病毒+EV576，(3)病毒+EV576+奥司他韦，以及(4)病毒+奥司他韦。感染和治
疗日程如下表所示


本发明涉及治疗和预防上和下呼吸道病毒性感染的炎症效应的方法，所述感染包括SARS冠状病毒(SARS)、大流行性流感AH5N1(禽流感)和大流行性流感A H1N1(猪流感)的感染。