专利名称：一种分离原代成人肝细胞的专用一次性无菌器械盒的制作方法目前，针对成人肝细胞分离尚没有专用的器械盒，在肝细胞分离操作前，通常遵照 Seglen两步灌流法的要求准备灌流装置，相应灌流管道，高压灭菌手术器械以及各种可能需要的耗材，准备工作非常繁琐，耗费的时间远远大于细胞分离操作的时间，浪费了大量人力。而且由于成人供体肝组织的获取具有很大的随机性，经常因为分离器械准备不及时而影响细胞分离操作的进行。因此，迫切需要能够一种长期保存，并可即拆即用的分离原代成人肝细胞的一次性无菌器械盒。发明内容本实用新型的目的在于提供一种分离原代成人肝细胞的专用一次性无菌器械盒， 该无菌器械盒可以即拆即用。本实用新型的目的是通过以下技术措施来实现的一种分离原代成人肝细胞的专用一次性无菌器械盒，其包括盒体和操作器械，所述的操作器械包括无菌培养皿、无菌烧杯、无菌血清瓶、无菌三角烧杯、两个无菌滤网、无菌注射器、无菌15ml离心管、无菌镊子和无菌剪刀；所述盒体内设置多个与所述各个操作器械的形状、体积吻合的凹槽，所述的各个操作器械对应嵌装在相应盒体内的凹槽中。所述盒体为塑料一体注塑成型的一次性盒。所述的两个无菌滤网分别为100目滤网和200目滤网。所述的无菌滤网呈皿状，其底部为滤网，其采用硬质材料做成的上缘向外凸出，且上缘外径略大于三角烧杯口的外径，上缘内径略小于三角烧杯口的内径，方便所述的滤网安装于三角烧杯之上进行过滤操作。为节约成本，所述的滤网采用尼龙滤网，即其底部为尼龙滤网。在所述盒体中对应各个操作器械位置处标注序号，并且所述的各个操作器械在所述盒体中的排列顺序也基本按照其使用的先后顺序，在使用过程中可以方便取用。本实用新型的一次性无菌器械盒，所述盒体外轮廓上覆盖一层外包装袋，可保持盒体及操作器械的无菌状态，可以长期保存，并实现即拆即用。所述的外包装袋采用塑料袋。以下结合试验进行阐述本实用新型与现有技术相比的有益效果(1)本实用新型提供获取原代成人肝细胞的无菌器械盒，基本囊括获取原代成人肝细胞所需的全部器械，使用本无菌器械盒将不需使用特殊的灌流装置便可完成成人原代肝细胞的分离操作，减少了细胞分离前的繁琐准备工作，而且可以实现即拆即用。(2)本实用新型结构非常简单，一方面便于加工生产，成本低廉，另一方面使用者容易掌握操作，可以在普通实验室普及使用。[0014](2)本实用新型适合非楔形切除，形状不规则，重量在1克至5克之间，且无法找到可供灌流血管的小块不规则成人肝组织的细胞分离，从而保证大部分因肝脏疾病而进行的肝切除操作中回收的肝组织都可进行细胞分离操作，扩大了肝细胞的获取来源。 图1是本实用新型的分离人原代肝细胞专用的一次性无菌器械盒的结构示意图。图1所示的分离人原代肝细胞专用的一次性无菌器械盒的一个优先实施例，其由外包装袋1、盒体4和操作器械构成，盒体4设置于外包装袋1内。操作器械包括IOcm无菌培养皿2、IOOml无菌烧杯7、20ml无菌烧杯8、25ml无菌血清瓶3、50ml无菌三角烧杯9、 50ml无菌三角烧杯10、200目无菌尼龙滤网14、100目无菌尼龙滤网5、IOml无菌注射器15、 20ml无菌注射器11、无菌镊子6、无菌剪刀13、两个15ml离心管12。在盒体4内设置有多个与上述各操作器械形状、体积吻合的凹槽，上述各个操作器械对应嵌装在相应盒体4内的凹槽中。各个操作器械在盒体4中均标注有序号，操作器械在盒体4中基本按照其使用的先后顺序进行排列。盒体4左半区域的操作器械无菌培养皿2标注①、IOOml无菌烧杯标注②、20ml无菌烧杯标注③、25ml无菌血清瓶标注④、50ml无菌三角烧杯9和50ml无菌三角烧杯10分别标注为⑤和⑥、200目无菌尼龙滤网14和100目无菌尼龙滤网5分别标注为 ⑦，这些操作器械从盒体4内左上角的培养皿开始从上到下、从左到右依次取用。盒体4内右半区域的操作器械为多次使用的器械无菌镊子6和无菌剪刀13标注A、两个离心管12 标注B、10ml无菌注射器15和20ml无菌注射器11标注C。本实用新型中涉及的各个操作器械，如培养皿、烧杯、血清瓶、三角烧杯、两个滤网、注射器、15ml离心管、镊子和剪刀的数量都可以是一个以上，培养皿、烧杯、血清瓶、三角烧杯和注射器也可以采用大容量的培养皿、烧杯、血清瓶、三角烧杯和注射器。下面介绍本实用新型优先实施例的具体操作方式(1)先打开制冰机制冰，摇床调到38°C，将IV型胶原酶溶液预热至38°C，专用器械盒拆包后置于生物安全柜中备用。(2)取新鲜无菌的离体不规则小块成人肝组织放置于冰袋之上的无菌培养皿2 中，清洗血污，用无菌剪刀13去除不需要的结缔组织，并修剪组织块，之后称取肝组织重量，约为2g。在去除结缔组织、修剪组织块和冲洗组织块表面血液时，盛装离体成人肝组织的无菌培养皿2始终放置在冰袋之上。(3)取100ml4°C冰箱保存的前灌流液至IOOml烧杯7中，用20ml无菌注射器11 吸取前灌注液，然后在肝组织表面取约20个穿刺点，依次穿刺注射4°C的前灌流液，灌注时间为15分钟，此时肝组织已由暗红色变为灰白色且流出的前灌流液变清亮。灌注时压力、 流速要恒定，不能有气泡，且前灌流液只一次性使用。(4)用IOml无菌注射器15吸取38°C的IV型胶原酶溶液，然后在肝组织表面取约 20个穿刺点，依次穿刺注射38°C的IV型胶原酶溶液，IV型胶原酶溶液循环使用，灌注时间为15分钟，使组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙。在本操作步骤中，为保持IV型胶原酶溶液的温度，将培养皿2置于热水袋之上。(5)将消化后的肝组织转移至20ml无菌烧杯8中，用无菌剪刀13剪开组织块，用无菌镊子6钝性分离肝组织，并去除残存的包膜和纤维结缔组织，然后移入25ml血清瓶3 中，加入IV型胶原酶溶液15ml，置于37°C的恒温箱中以120转/分钟的速度震荡消化15 分钟；(6)用粗口吸管将消化物吹打成为细胞悬液，加入IOml含10%胎牛血清的DMEM 培养基终止消化。在冰浴条件下，用三角烧杯收集经100目尼龙滤网5过滤后的肝细胞悬液，移至两只15ml离心管12中，4°C下，1000转/分钟，离心5分钟，然后去上清液，得到底层沉淀的肝细胞。(7)在所得的肝细胞加入红细胞裂解液1. 5ml室温静置3分钟后，加入6mlDMEM培养基混勻，4°C下，1000转/分钟，离心5分钟，收集底层沉淀，用30ml含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，用三角烧杯收集经200目尼龙滤网14过滤的肝细胞悬液，再移至两只15ml离心管12中，4°C下，1000转/分钟，离心5分钟，弃上清液， 收获沉淀于底层的肝细胞。(8)步骤(7)中得到的的肝细胞用IOml无血清DMEM培养基重悬，在4°C下，1000 转/分钟，离心5分钟，重复3次，得到成人原代肝细胞。所得的原代成人肝细胞用细胞培养基重悬，调节细胞浓度为lX106/ml，置冰浴中备用。上述实施例只是本实用新型的其中优先实施方式，然而本实用新型的实施方式不限于此，根据本实用新型的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本实用新型上述基本技术思想前提下，本实用新型做出其它多种形式的修改、替换或变更，均实现本实用新型的目的。