专利名称：一种桡足类中昆布多糖酶活力的测定方法桡足类动物是一类小型低等甲壳动物，是海洋浮游动物的重要组成部分。它既是浮游植物的摄食者，又是鱼类的饵料基础，在海洋食物链、次级生产力和能量流动中占有关键性位置。桡足类动物的研究中经常涉及到桡足类动物摄食消化能力、对周围环境食物浓度适应能力和营养状况等的分析，消化酶活力是反映桡足类动物对饵料等营养物质利用能力的重要指标，由于桡足类动物体形微小，对环境因子影响较为敏感，所以消化酶活力也可以作为指示环境质量的指标之一；这就需要通过测定桡足类动物的消化酶活力来加以判断。传统分析消化酶活力的方法，由于需要样品量较大，操作复杂，测试周期较长，所以误差较大，这对于个体小，室内难以大量长期培养的桡足类动物来说，造成测试困难，所以建立独立的桡足类动物的消化酶活力的测定方法尤其重要。
本发明所要解决的技术问题是提供一种桡足类中昆布多糖酶活力的测定方法，该方法操作简便，样品量少，测试时间短，测试效率高。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种桡足类中昆布多糖酶活力的测定方法，其步骤如下 a、将5-15只桡足类动物置于研钵中，加入浓度为ImM的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液(Tris_HCl)500 μ 1，冰浴研磨成勻衆液，在15000 rpm、0_4°C下,冷冻离心机离心IOmin,取上清液待用； b、将2mg昆布多糖加入到I毫升浓度为IOOmM的醋酸溶液中，加热溶解得到昆布多糖醋酸液，取上述上清液40μ I与460μ I昆布多糖醋酸液混匀，在20°C水浴温育lh，然后在95°C水浴2min，终止反应得到水浴产物； C、取上述水浴产物40 μ 1，与Iml浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液，O. 5ml浓度为ImM的MgCl2液，O. 5ml浓度为O. 5mM的二硫苏糖醇液，Iml浓度为I μ g /ml的己糖激酶液，Iml浓度为30 μ M的氧化型辅酶II液(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，NADP+)，Iml浓度为300 μ M的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)液，Iml浓度为O. 02U/ml的6-磷酸葡萄糖脱氢酶液混合，搅拌均匀，酶促反应lOmin，得到含还原型辅酶II (NADPH)的酶促产物； d、用移液器吸取上述酶促产物置于荧光分光光度计中，在激发波长为340nm，发射波长为450nm下测量还原型辅酶II的吸光值，根据公式O. 2737 X吸光值-O. 4518计算得到还原型辅酶II的总浓度(Ug πιΓ1)； e、根据下述公式计算样品中每只浮游动物的昆布多糖酶活力，昆布多糖酶活力(ygglucose · incf1 · IT1) = AX6 + 833. 35X 180X500 + 40X500 + 40 + B，公式中 A 为还原型辅酶II的总浓度，B为桡足类动物的只数。式中833. 35为NADPH的分子量，180为葡萄糖的分子量，6为酶促反应试剂的体积，首个500 + 40为500 μ I匀浆液取40 μ I上清液，第二个500 + 40为500 μ I水浴反应中取40 μ I水浴产物。与现有技术相比，本发明的优点在于一种桡足类中昆布多糖酶活力的测定方法，对5-15只桡足类动物在缓冲液下研磨、离心，再与底物昆布多糖水浴反应得到水浴产物，然后水浴产物与Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇、己糖激酶、NADP+、ATP、6-磷酸葡萄糖脱氢酶混合进行酶促反应，再以酶促产物中还原型辅酶II的吸光值和浮游动物只数为参数，根据公式计算得到每只桡足类动物中昆布多糖酶的活力；本发明的方法只要几只到十几只桡足类动物就可完成消化酶活力的测定，解决了由于桡足类个体小，室内难以大量长期培养，很难获得用于酶活力测定样品量的这一问题，只是对桡足类动物中昆布多糖酶进行水浴和酶促二步反应就可以得出还原型辅酶II的吸光值，操作简便，反应时间短，误差 也较少，因此本发明具有操作简便，样品量少，测试时间短，测试效率高的优点。

挑出培养的中华哲水蚤5只个体于研钵中，加入500 μ I ImM Tris-HCl缓冲液，冰浴研磨成勻衆液，在15000 rpm、0-4°C下,冷冻离心机离心IOmin,取上清液待用。将2mg昆布多糖加入I毫升浓度为IOOmM的醋酸溶液中，加热溶解得到昆布多糖醋酸液，取上述上清液40μ I与460μ I昆布多糖醋酸液混匀，在20°C水浴温育lh，然后在95°C水浴2min，终止反应得到水浴产物。在40 μ I水浴产物中，加入50mM的Tris-HCl缓冲液lml，ImM的MgCl2液 O. 5ml，O. 5mM 的二硫苏糖醇液(C4H10O2S2) O. 5ml, Iyg ml-1 的己糖激酶液 Iml，30 μ M 的NADP+液Iml，300 μ M的ATP液Iml，O. 02U πιΓ1的6-磷酸葡萄糖脱氢酶液Iml，酶促反应lOmin，得到酶促产物。用移液器吸取酶促产物，置于HITACHI 4500荧光分光光度计中，在激发波长340nm，发射波长450nm下测量还原型辅酶II的吸光值，得到吸光值为3. 352，代入公式NADPH浓度=O. 2737 X吸光值-O. 4518，计算得到NADPH总浓度A为O. 4656424 ( μ gι Γ1) ο再根据公式昆布多糖酶活力=AX 6 + 833. 35 X 180 X 500 + 40 X 500 + 40 + Β，计算得到每只中华哲水蚤中昆布多糖酶活力为18.86 ( μ g glucose · incf1 · IT1)。实施例2
与实施例I基本相同，所不同的只是中华哲水蚤由墨氏胸刺水蚤替代，其只数B为10只，该墨氏胸刺水蚤的酶促产物还原型辅酶II的吸光值为2. 576，总浓度A为O. 2532512 ( μ g πιΓ1)，每只墨氏胸刺水蚤中昆布多糖酶活力为5. 13 ( μ gglucose · ind 1 · h O。实施例3
与实施例I基本相同，所不同的只是中华哲水蚤由太平洋纺锤水蚤替代，其只数B为15只，该太平洋纺锤水蚤的酶促产物还原型辅酶II的吸光值为2. 238，总浓度A为O. 1607406(yg πιΓ1)，每只太平洋纺锤水蚤中昆布多糖酶活力为2. 17(ygglucose · ind 1 · h O。


本发明公开了一种桡足类中昆布多糖酶活力的测定方法，对5-15只桡足类动物在缓冲液下研磨、离心，再与底物昆布多糖水浴反应得到水浴产物，然后水浴产物与Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇、己糖激酶、NADP+、ATP、6-磷酸葡萄糖脱氢酶混合进行酶促反应，再以酶促产物中还原型辅酶Ⅱ的吸光值和浮游动物只数为参数，根据公式计算得到每只桡足类动物中昆布多糖酶的活力；本发明的方法只要几只到十几只桡足类动物就可完成消化酶活力的测定，只是对桡足类动物中昆布多糖酶进行水浴和酶促二步反应就可以得出还原型辅酶Ⅱ的吸光值，操作简便，反应时间短，误差也较少，因此本发明具有操作简便，样品量少，测试时间短，测试效率高的优点。