专利名称：用于再生脊椎与管状骨的植入物的制作方法图1为与未治疗的样本相比，使用活性物质复合物的兔新骨生成作用图示；图2为与纯的磷酸三钙相比，使用活性物质复合物并以磷酸三钙作为支撑材料的绵羊新骨生成作用图示；图3为与纯的胶原相比，使用活性物质复合物并以不同的胶原作为支撑材料的大鼠新骨生成作用图示；图4为无晶格结构的由碳纤维制成的中空体图示，具有两个腔，供活性物质复合物与自体海绵物质之间的对比；图5a-c为具有晶格结构的由钛制成的中空体图示，它充满活性物质复合物，用于连锁椎体；图6显示笼式插入装置，它具有有两个腔的碳笼；图7a-b显示手术前大为减少的L5/S1段腰椎间距的X-射线；图8a-b显示腰椎L4与L5椎骨之间的植入物的X-射线，安装有用于保持稳定的内部固定器；和图9显示安装碳笼植入物后三、六和九周通过计算机X线断层扫描所得一系列图片，植入物具有活性物质复合物和自体海绵物质。I、活性物质复合物的制备制备活性物质复合物的主要步骤描述如下清洗小牛、绵羊、兔或大鼠管状骨，尤其除去骨髓，然后将骨冷冻。将冷冻的骨研磨成粒径小于2mm。将研磨后的骨碎片在丙酮中脱脂，在0.6N盐酸中脱钙。然后将产物冷冻干燥，得到脱矿质的骨基质，在4摩尔盐酸胍溶液中萃取。将萃取溶液对蒸馏水透析，离心，冷冻干燥沉淀，得到活性物质复合物。这种基本制备方法以下列流程图表示。图1表示活性物质复合物制备的流程图屠宰后的新鲜管状骨骨干↓研磨成粒径＜2mm↓在丙酮中脱脂↓在0.6N HCl中脱钙↓洗涤，冷冻干燥↓脱矿质的骨基质↓在4M GuHCl中萃取↓ ↓残余物 上清液↓对蒸馏水透析↓沉淀含有活性物质复合物II、不使用支撑材料的活性物质复合物的功效为了说明活性物质复合物本身是有效的，首先进行这样一种试验，其中在植入活性物质复合物时没有另外的支撑物或支撑材料。1、试验用动物使用平均体重为3089g的雌性毛丝鼠兔。它们随意摄入兔日常饲料和用盐酸酸化至pH4.5的双臭氧化自来水。皮下注射氯胺酮与赛拉嗪的混合物，使动物麻醉。2、兔骨缺损的制备使用内部冷却钻在兔膝关节内(股骨远端)制备直径4mm、深约9mm的植入床。然后在每种情况下，向所形成的孔洞内各自装入30与90mg已如I下所述制备的活性物质复合物。在每种情况下，另有一个孔洞不作处理，充当新骨生成的对照。图1显示手术后28天未经处理的孔洞和植入活性物质复合物后的孔洞内的新骨生成作用，以及周围预先存在的海绵物质的密度(n＝2/活性物质量)。
试验结果分析揭示了植入30mg活性物质复合物后孔洞周围的海绵物质的密度比未处理孔洞高45％，植入90mg活性物质复合物后比未处理孔洞高69％。预先存在的海绵物质的量对缺损的再生作用完全没有影响，因为插入活性物质复合物之后的新骨生成作用不是从孔洞外周开始的，而是均匀分布在缺损部位中的。
III、使用磷酸三钙(TCP)生成绵羊下颌骨1、试验用动物在下述试验中使用来自Viehzentrale Sudwest AG，Stuttgart的成熟驯养绵羊。向它们供应干草和水，在手术前三天供应Altromin颗粒浆液。
向动物预先i.m.给以1ml赛拉嗪/1ml氯胺酮。然后用戊巴比妥钠麻醉绵羊。
2、植入物的制备将TCP悬浮在100mg活性物质复合物的10ml水溶液中，在恒定搅拌下用液氮深度冷冻。冷冻干燥24小时后，气体灭菌(环氧乙烷)，将掺有活性物质复合物的TCP植入绵羊下述下颌骨缺损内。另外，向出于对照目的的另一下颌骨缺损内装入经过高压釜内灭菌的未掺杂TCP。
3、绵羊下颌骨缺损的制备适当地制备绵羊下颌骨，以生理盐水作为冷却剂，用直径5mm的环锯切断，分别取骨的标准柱体。然后向所形成的孔洞之一装入TCP，按照试验操作1该TCP已经掺有活性物质复合物，第二个孔洞装入未经掺杂的TCP。
为清楚起见，下颌骨缺损内的骨生长结果以图面形式如图2所示。试验的持续时间分别为26天和41天。
发现在最初阶段，掺有活性物质复合物的TCP促进No.811和No.86绵羊下颌骨缺损的骨再生作用达约100％。41天后，对骨再生作用的促进率仍有10％。因此特别是在开始阶段，骨的愈合要比没有掺有活性物质复合物的植入物的成骨作用更加迅速。
IV、用胶原作为支撑材料的试验在活性物质复合物的制备中，具有所需程度纯度的定量收率是非常低的。我们因此检查了是否存在这样的支撑材料，它们能够与活性物质复合物结合，以便减少特定目的所需活性物质复合物的量，但又不会降低它的骨生成效率。
1、活性物质复合物用于下述试验目的的活性物质复合物完全按I下所述方式制备，并使用来自小牛的管状骨。
2、试验用动物使用体重在350与400g之间的雄性Wistar大鼠，饲养在带空调的动物房内，温度23℃，相对湿度50％。对它们给以大鼠与小鼠日常饲料。
将两个相同支撑材料的植入物植入每只试验动物的腹部肌肉系统，其中一个植入物涂有活性物质复合物，而另一个保持未涂状态，充当对照植入物。21天后处死动物，移出植入物在腹部肌肉系统内的作用区域，进行组织学评价。
3、所用支撑材料这些试验中，所用胶原材料都是商业上可得到的。胶原A是纯的、无菌的、天然的、可吸收的牛皮肤胶原，不含任何外来的添加剂，例如稳定剂或消毒剂。
胶原B是经过纯化的、冷冻干燥的、轻微交联的、无菌与无热原的牛皮肤胶原，具有弱抗原的性质。胶原的螺旋结构得以保留。
胶原C包含纯的、天然的和可吸收的牛胶原纤维。
所有所用的胶原都是网状。切成胶原网的切片，各重50mg，分别加入1ml活性物质复合物溶液(3mg/ml)。在对照植入物中，代之以加入1ml蒸馏水。将处理后的胶原网切片冷冻在-20℃下，冷冻干燥，得到直径约10mm、厚约5mm的植入物。图3显示在21天后，关于涂有和未涂有活性物质复合物(环孢菌素A)的胶原植入物A、B和C对免疫抑制动物与非免疫抑制动物的骨生成结果。这里，评价数值(BZ)相当于每组三人对六个植入物的评价数值的算术平均值。
涂有活性物质复合物的胶原A在该时间阶段之后对免疫抑制动物显示骨生成作用，而这种作用在胶原B中没有得到证明。不过相形之下，胶原C显示非常显著的骨生成作用。
由此可见，这取决于所用特定胶原的制剂，并且显示了作为支撑材料的适应性。致免疫性胶原不适合用作支撑材料。
IV、试验金属与陶瓷材料的生物可相容性使用来自Friedrichsfeld公司的具有不同表面粗糙度(100、20和0.5μm)的钛盘、TiAl6V4合金(0.5μm)和Al2O3盘，和来自FeldmühleAG公司的羟基磷灰石盘。
利用浸涂法涂以已用上述通用操作从小牛的管状骨制备的活性物质复合物。浸涂法被理解为这样一种涂层方法，其中将所要涂覆的对象——在这种情况下是盘片——浸入具有所需预定浓度的涂覆剂溶液中，在这种情况下是活性物质复合物。然后冷冻干燥。得到薄薄的覆盖层或涂层。测定指定材料、特别是关于表面粗糙度的生物可相容性(n＝20；各四只盘片)。表1显示所得结果。
所研究材料的这种生物可相容性试验揭示了钛作为支撑材料是非常适合的，具有最高数量的活细胞和最佳的活细胞与死细胞之比。羟基磷灰石得到近似好的结果，TiAl6V4相当差。
至于表面粗糙度，一般发现最光滑的表面、也就是孔径为0.2-0.5μm的表面获得最佳结果，TiAl6V4例外。随着粗糙度或孔径的增加，活细胞数及活细胞与死细胞之比下降。约0.5μm的孔径使活体(骨)组织与盘片表面直接接触的比例最高。
表1
V、钛体和碳笼由于IV下所述试验已经证明了钛的必要的生物可相容性，这指出了活性物质复合物在尺寸稳定的钛笼中的特定用途，用于连锁椎体(脊椎融合术)。另外发现碳笼也适合于该目的。
关于脊椎融合术，能够对人体脊柱进行手术干预，这有利于在自体海绵物质与活性物质复合物之间进行对比。
为此使用具有两个腔的碳笼。这样一种碳笼如图4所示。代替该碳笼的，使用钛中空体也是同样可能的，后者如图5a、b和c所示。图5a-5c显示充满活性物质复合物的钛中空体的不同视图。
关于这里所涉及的试验，使用无晶格结构的碳笼，因为它有两个腔(I，II)可用，一个接受活性物质复合物，另一个接受自体海绵物质作为对比。
所用活性物质复合物是从小牛骨得到的，如I下所述，加入到碳笼的一个腔(I)中，另一个腔(II)填充来自所治疗患者的自体海绵物质。利用笼插入药具，将如此制得的碳笼安装在脊柱L5/S1段(椎间盘区域中的腰椎)。已经带有碳笼的插入药具如图6所示。图中右手腔(I)含有活性物质复合物，左手腔(II)含有自体海绵物质。
图7a和7b显示在L5与S1之间插入植入物之前间距大为减少。图8a和8b显示在椎骨L4与L5之间插入植入物所得支撑物，和出于稳定目的而引入的内部固定器。
图9显示安装笼植入物后三、六和九周的计算机X线断层扫描图序列，从左至右看。笼的左手腔含有自体海绵物质，右手腔含有活性物质复合物。可以清楚地看到，含有海绵物质的左手腔内X-射线密度连续减少，这是骨损失的迹象，而含有活性物质复合物的右手腔内X-射线密度在整个阶段内都是增加的，这是骨生长的迹象。九周后，按照现有技术关于骨损失的“黄金标准”进行评估，根据本发明的植入物在骨生成作用中显示至少与自体移植相同的结果。当使用根据本发明的植入物时，伴有风险的二次干预是不必要的，原发性骨损失也不需要时间。
表3显示图9所示试验的光密度测量结果。
表3植入物中矿化骨的光密度(％)


本发明涉及植入物,用于至少部分地形成、再生或稳定椎体或管状骨。所述植入物中,金属、非金属或陶瓷的中空体涂有活性成分复合物或者包含所述活性成分复合物。该活性成分复合物具有下列成分,这些组分是彼此不同的,特异性地适应于形成骨,即,至少一种基于细胞外物质的结构组分,它特异性地适应所要形成的骨细胞,至少一种补充组分,至少一种粘连组分,和至少一种生长和/或成熟组分。金属中空体优选地由钛或钛合金组成,是包含晶格结构的圆柱体形状。非金属中空体由碳纤维组成,陶瓷中空体由磷酸钙、氧化铝或羟基磷灰石陶瓷组成。活性成分可以涂在选自聚合物和胶原的支撑材料上,目的是减少必要的活性成分的量。