专利名称：人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型及其构建和评价的制作方法肿瘤转移的过程是复杂而难以控制的，临床肿瘤病人的90%死亡率是由肿瘤转移导致的。某种程度上说，防止肿瘤转移即能控制肿瘤所致的死亡。肿瘤侵袭与转移是肿瘤细胞的恶性生物学行为，肿瘤侵袭也称为肿瘤直接扩散(direct spread)，瘤细胞不连续性播散，并在远隔部位生长的过程为转移(metastasis)。上述过程是一个复杂的、多步骤的过程，大致包括肿瘤细胞从原发肿瘤灶脱离；降解基底膜，向外浸润、迁移并粘附于血管内皮细胞；进入循环系统随着血流，到达并停留于远处的血管壁；穿过血管侵入细胞外基质，最后在特定的组织或器官形成转移灶。近年来随着分子生物学的发展，发现此过程分别受“转移相关基因”和“转移抑制相关基因”的调控，并且转移过程与各种细胞因子的功能失调密切相关。由于转移过程的复杂性，肿瘤转移的分子和细胞机制尚未真正阐述清楚。肿瘤转移复发的发生与癌细胞的生物学行为(黏附、运动、增殖、侵袭)、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成及靶器官性质等许多因素有关，而对于肿瘤转移机制以及抗肿瘤转移的评价手段的研究，不可能完全利用人体活检和尸检材料去完成，必需建立相应的动物和人类肿瘤的转移模型。对于肿瘤转移机制，实验治疗的探索是重要的工具和手段。在体外肿瘤侵袭转移模型中，传统的平面培养 的转移性人肿瘤细胞系已经无法满足肿瘤侵袭转移分子病理机制的实验解析，且目前报道的大量平面培养的细胞系的表达与行为方面与体内癌细胞真实病理情况相差甚远[参考文献:Pampaloni, F.，E.G.Reynaud, et al.(2007)." The thirddimension bridges the gap between cell culture and live tissue." Nature ReviewsMolecular Cell Biology8(10):839-845.]，而三维培养的类组织细胞球更接近体内肿瘤微环境内细胞的表达与行为，又因为体外三维培养易于大规模操作等优点，应用体外三维模型来探索和建立新型体外侵袭转移模型或转移研究体系可以为肿瘤转移新理论、新机制提供指导。传统的平面培养细胞性状均一无极性，细胞形态影响细胞骨架，由此影响细胞的分泌功能及部分关键基因的异常表达，且平面培养细胞无法反映细胞与细胞之间，细胞与基质之间等相互作用，从而缺少有利的实验证据对细胞间粘附、信号转导、细胞运动侵袭转移等生物学过程进行体外模拟研究。体外三维培养技术克服了上述平面培养的不足，较好的模拟再现细胞在组织体内接近真实的生存状况，在细胞功能研究上，体外三维培养技术具有明显的优势，主要包括(I)简化体内复杂微环境，提供易于重复、规模化研究的特定体外模拟培养环境，有利于三维状态下细胞的分化，生长等生理病理特征解析。(2)在特定培养体系中，提高了同种细胞、异种细胞间的相互作用，结构上易于建立起与肿瘤转移密切相关的细胞间连接特性，比如缝隙连接，桥粒连接。⑶增强胞外基质的产量，易于观察胞外基质对细胞生长、分化、迁移等细胞生物学特征的影响。(4)体现出肿瘤细胞的肿瘤恶性度相关基因表达状况和相关功能特征。
本发明的目的是构建既可以较好的模拟体内肿瘤的生存环境，也有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为实验解析的理想体外转移性肿瘤组织模型，解决体外研究肿瘤组织细胞病理特征缺少理想具有转移特性的实验模型问题以及肿瘤临床药物治疗缺少理想体外实验评估体系问题，提供可规模化的，易于重复研究又相对简化的肿瘤生长并具有转移特性的特定体外模拟培养环境。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，具体步骤为:第一步:将人肿瘤细胞混悬在8_40g/L海藻酸钠溶液中，利用锐孔挤压法使液滴喷射入含CaCl2凝胶浴，室温下反应10-40min生成粒径为200-800 μ m水凝胶微球，具有良好的单分散性；第二步:将上述水凝胶微球自然沉降3-10min，沉降后按照5_15%的体积接种到含体积浓度8-15%胎牛血清的人肿瘤细胞培养基中，静置3-10min后，于培养箱中培养，在37°C，含体积分数5% CO2的空气饱和湿度条件下培养人肿瘤细胞，培养基的种类依据所选定的肿瘤细胞确定。所述对构建的肿瘤体外侵袭转移模型鉴定的指标特征是:①平面培养细胞逐渐伸展，铺成单细胞层，而三维培养细胞为球形生长，细胞与细胞之间连接紧密，随着时间的增加细胞团粒径越来越大，成为细胞类组织体；②在培养一段时间之后，利用实时定量PCR(聚合酶链式反应)检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的转移相关的基因表达有显著上调在培养一段时间之后，利用明胶酶谱检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的转移相关的蛋白表达有显著上调在培养一段时间之后，利用细胞侵袭转移实验检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的侵袭转移能力有显著增强；⑤在培养一段时间之后，利用裸鼠体内 成瘤实验检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的体内成瘤能力有显著增强。所述的海藻酸钠溶液的粘度为40_380pas。所述的凝胶浴条件为0.01-1.0mol/L CaCl2溶液。所述的锐孔挤压法为一种公知的技术，比如静电液滴法或气动液滴法。为简明起见，本发明对这些公知技术不作详细描述。有关这些公知技术的详细报道可参阅:静电液滴法[参阅文献:HommelM, Sun AM, Goosen MFA.Droplets generation.Canadian patent N0.1241598,1988]；气动液滴法[参阅文献:MiyawakiO, Nakamura K, Yano T.Agric.Biol.Chem.1980,44:2865-2870]；所述水凝胶微球在培养3天后，半数换液，之后每两天半数换液，培养基的种类依据所选定的肿瘤细胞确定，培养10-20天后三维培养结束，得到海藻酸钙凝胶微球中类组织体的粒径在50-200 μ m。本发明技术方案中转移性肿瘤类组织体形成的时间周期为10-20天，该时间段的界定主要来自组织病理、光学显微形态学观察，肿瘤特异基因和蛋白表达，细胞侵袭转移实验，裸鼠成瘤动物实验，对化疗药物的敏感程度。肿瘤侵袭转移类组织形成中，细胞增殖相对缓慢，有潜伏期，而且由单个细胞增殖造成，而非细胞聚集造成，这与体内情况十分相似。白蛋白表达比平面细胞高，说明该类组织体在适宜其生长的微环境中具有部分肝组织的特性。肿瘤及其转移相关基因的表达或肝脏特异基因的表达是评价类组织体能否成为体外肿瘤模型的关键。对转移相关基因MMP2(基质金属蛋白酶2)，MMP7(基质金属蛋白酶7) ,MMP9 (基质金属蛋白酶9) ,MTl-MMP (基质金属蛋白酶14)等表达进行检测，对粘附相关基因E-cadherin(E I丐粘蛋白)，Integrin (整合素)，⑶44等表达进行检测,对胞外基质相关基因CollagenI (I型胶原)，Collagen IV(IV型胶原)，VCAN(硫酸软骨素)等表达进行检测，发现与平面培养相比，转移相关基因基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶7，基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶14,粘附相关基因E I丐粘蛋白，整合素和CD44,胞外基质相关基因I型胶原，IV型胶原和硫酸软骨素在三维类组织体中的表达均有不同程度的上调。上述基因的表达模式与发生转移侵润的恶性肿瘤组织中的表达模式基本一致，说明体外三维培养的肿瘤类组织体可以作为一种新型肿瘤体外组织模型用于肿瘤转移机制的基础研究。体外验证肿瘤侵袭转移蛋白表达的实验(明胶酶谱实验):取平面培养细胞与三维培养细胞的 培养上清，4C，2000rpm离心lOmin，取上清分装后-70C保存备用；制备分离胶和浓缩胶，加入电泳缓冲液，上同样蛋白含量的样品，电泳结束后，切去合适大小的凝胶放置于洗脱液中震荡洗脱4次，每次15min ;漂洗液中震荡漂洗2次，每次20min ;孵育液中，37C水浴锅中孵育48小时；染色液中摇床上震荡染色3小时；将凝胶置于脱色液中，震荡脱色0.5小时；在蓝色背景上可见白色条带，用凝胶图像分析系统分析条带的光密度值。与平面培养细胞相比，肿瘤类组织体外泌的基质金属蛋白酶2表达量发生显著性上调。体外肿瘤侵袭转移实验:将体外培养15天形成的肿瘤类组织体回收计数，按照IO5细胞/孔接种于铺有Matrigel的0.8 μ m孔径的Transwell膜上,利用含10%胎牛血清的培养基做诱导剂，48小时后发现肿瘤类组织体细胞的侵袭能力明显高于平面培养细胞。类组织体裸鼠成瘤实验:将体外培养10天形成的肿瘤类组织体直接接种于4-6周龄裸鼠背部两侧皮下，皮下皮丘有血管连接，42天取出，皮丘内肿瘤类组织体经病理学分析发现有诱导淋巴细胞侵袭现象。本发明的原理如下:体外多次传代的平面培养细胞易改变或丢失肿瘤细胞的某些关键的生物学特征，也有研究证明体外平面培养细胞在基因水平表达，对药物处理的敏感性与临床体内情况相差甚远。而三维状态下的肿瘤细胞在形态结构、基因表达、蛋白分泌、侵袭转移能力、裸鼠成瘤性等方面明显优于平面培养细胞，三维细胞的生物学特征与体内癌细胞真实的病理情况更接近，更能模拟肿瘤细胞生存的微环境。由海藻酸钠与钙离子螯合形成海藻酸钙凝胶微球的反应是迅速的，材料是生物相容性好的，可以最大限度的保持细胞活性，技术是适合大规模培养进行高通量筛选的，所以本发明利用海藻酸钙凝胶微球体系来进行体外三维培养形成侵袭转移型肿瘤类组织体外模型，通过对平面培养的高转移人肿瘤细胞系生物学特征比较，发现三维培养条件下形成的肿瘤类组织体在组织形态结构、特异基因表达、蛋白分泌情况等方面具有更接近体内转移性肿瘤组织的特征，较好的模拟和再现了体内转移性肿瘤实体瘤的生长特征及病理改变,对现有化疗药物的敏感性降低，显示出优于平面培养的高转移人肿瘤细胞模型，可成为肿瘤研究较理想的一种新型体外实验模型。本发明的优点如下:该新型肿瘤类组织体外模型在模拟体内转移性肿瘤生物学特征方面明显优于平面培养肿瘤细胞，更接近在体组织，提供了易于重复研究又可控性强的肿瘤生长的特定体外模拟培养环境，有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为的实验解析，可解决体外研究肿瘤组织细胞病理特征缺少理想实验模型问题，同时该发明应用方便规模放大，可进行高通量药物筛选，解决肿瘤临床药物治疗缺少理想体外实验评估体系问题。本发明主要用于评估三维生长状态下肿瘤细胞的恶性生物学行为改变包括生长、增殖、迁移、侵袭、凋亡、特异性基因表达、分泌等；可进行肿瘤放疗、化疗等治疗效果的体外实验评价，提供接近体内真实生理病理状况的实验数据，指导临床肿瘤的治疗。图1为海藻酸钙凝胶微球体系中培养不同天数形成细胞类组织体图；图2为海藻酸钙凝胶微球体系中培养15天形成的肿瘤类组织体组织化学结果图；图3为肿瘤类组织体在平面培养和三维培养不同天数转移相关基因表达图；图4为肿瘤类组织体在平面培养和三维培养一定时间后侵袭转移相关蛋白变化图；图5为肿瘤类组织体在平面培养和三维培养后侵袭转移能力变化图；图6为肿瘤类组织体裸鼠体内成瘤实验结果图。以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。实施例1一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，具体步骤为:第一步:将2X106人肝癌细胞混悬在Iml海藻酸钠溶液(15g/L)中，利用静电液滴法使液滴喷射入1.0mol/L的CaCl2溶液，反应20min，得到海藻酸钙凝胶微球粒径为450 μ m ；第二步:将上述水凝胶微球自然沉降4min，沉降后按照10%的体积接种到含10%胎牛血清(GIBC0公司)的高糖DMEM培养基(GIBC0公司)，静置5min后，在37°C，含体积分数5% CO2的空气饱和湿度条件下于培养箱中培养20天，可得到直径为150μπι的肿瘤类组织体，如图1所示，为肝癌细胞在海藻酸钙凝胶微球系统培养中不同天数培养形成的细胞类组织体图。。由于三维培养的细胞增殖比平面培养慢，更接近体内情况，而且经过细胞培养的培养基中含有细胞分泌的必须因子，所以选择在细胞培养过程中半数换液，培养初期在培养三天后换液，在后期细胞需要较多营养时，每两天进行一次半数换液可以获得较理想的培养结果，利于下游基因、蛋白表达的体外分析及动物移植等方面的研究。构建的肿瘤类组织体在形态结构、特异基因表达、蛋白分泌情况等有更接近体内肿瘤组织特征，可成为肿瘤研究较理想体外实验模型:(I)三维培养体系肿瘤类组织体形成的时间周期界定:5-50 X IO5肝癌细胞包埋在海藻酸钙凝胶微球体系中连续培养20天，其间分别收集不同培养天数的类组织体(daylO，day 15，day20)，-70C 保存待检。对形成的细胞类组织体的基因表达进行检测，与平面培养相比，转移、粘附、胞外基质相关基因表达均发生明显改变。体外三维培养第10、15、20天，如图2所示，肝癌细胞在海藻酸钙凝胶微球体系中形成的肝癌类组织体经过组织化学方法染色显示其具有类似肝癌肿瘤组织的特征，细胞排列紧密，细胞核具有异型性，更加接近在体肿瘤。(2)肝癌特异性基因表达情况分析:肝癌及其转移相关基因的表达是评价类组织体能否成为体外肝癌模型的关键，同时也是肝癌细胞体外三维培养优于平面培养细胞的证据之一。我们对转移相关基因MMP2(基质金属蛋白酶2)，MMP7(基质金属蛋白酶7)，MMP9(基质金属蛋白酶9)，MTl-MMP (基质金属蛋白酶14)，对粘附相关基因E-cadherin(E隹丐粘蛋白)，Integrin(整合素),⑶44,对胞外基质相关基因Collagen I (I型胶原),CollagenIVdV型胶原)，VCAN(硫酸软骨素)等表达进行检测，如图3所示，为肝癌类组织体形成不同时间点肝癌特征基因表达图，其中Adhesion为平面培养，IODIV为三维培养10天，15DIV为三维培养15天，20DIV为三维培养20天，从图中发现与肿瘤转移相关的基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶7，基质金属蛋白酶9，基质金属蛋白酶14在肝癌类组织体中均显示上调表达，而且随培养时间的延长而上升。与肿瘤粘附相关的E钙粘蛋白，整合素，CD44在肝癌类组织体中均显示上调表达，而且随培养时间的延长而上升。与肿瘤胞外基质相关的I型胶原，IV型胶原，硫酸软骨素在肝癌类组织体中均显示上调表达，而且随培养时间的延长而上升。
上述基因的表达模式与发生侵润转移的临床恶性肝癌组织中的表达模式一致，说明体外三维培养的肝癌类组织体可以作为肿瘤体外研究的模型，优于平面培养的细胞。实施例2一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，具体步骤为:第一步:将5 X IO5人乳腺癌细胞混悬在Iml海藻酸钠溶液(10g/L)中，利用静电液滴法使液滴喷射入1.0mol/L的CaCl2溶液，反应30min，得到海藻酸钙凝胶微球粒径为300 μ m ；第二步:将上述水凝胶微球自然沉降6min，沉降后按照10%的体积接种到含10%胎牛血清(GIBC0公司)的RPMI1640培养基(GIBC0公司)，静置5min后，在37°C，含体积分数5% CO2的空气饱和湿度条件下于培养箱中培养15天，可得到直径为100 μ m的肿瘤类组织体。验证肿瘤侵袭转移因子MMP2蛋白表达的实验(明胶酶谱实验):取平面培养细胞与三维培养细胞的培养上清，4C，2000rpm离心lOmin，取上清分装后-70C保存备用；制备分离胶和浓缩胶，加入电泳缓冲液，上同样蛋白含量的样品，电泳结束后，切去合适大小的凝胶放置于洗脱液中震荡洗脱4次，每次15min ;漂洗液中震荡漂洗2次，每次20min ;孵育液中，37C水浴锅中孵育48hr ;染色液中摇床上震荡染色3hr ;将凝胶置于脱色液中，震荡脱色
0.5hr ;在蓝色背景上可见白色条带，用凝胶图像分析系统分析条带的光密度值。如图4所示，与平面培养细胞相比，乳腺癌类组织体外泌的基质金属蛋白酶2表达量上调了 6倍。实施例3一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，具体步骤为:
第一步:将8 X IO5人头颈部鳞癌细胞混悬在Iml海藻酸钠溶液(40g/L)中，利用静电液滴法使液滴喷射入0.lmol/L的CaCl2溶液，反应40min，得到海藻酸钙凝胶微球粒径为 800 μ m ；第二步:将上述水凝胶微球自然沉降3min，沉降后按照10 %的体积接种到含8 %胎牛血清(GIBC0公司)的RPMI1640培养基(GIBC0公司)，静置3min后，在37°C，含体积分数5% CO2的空气饱和湿度条件下于培养箱中培养15天，可得到直径为50 μ m的肿瘤类组织体。体外肿瘤侵袭转移实验:将体外培养15天形成的头颈部鳞癌类组织体回收计数，按照IO5细胞/孔接种于铺有Matrigel胶的0.8 μ m孔径的Transwell膜上,利用含10%胎牛血清的培养基做诱导剂，如图5所示，48小时后发现头颈部鳞癌类组织体细胞的侵袭能力明显高于平面培养细胞。实施例4一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，具体步骤为:第一步:将5 X IO6人肺癌细胞混悬在Iml海藻酸钠溶液(8g/L)中，利用静电液滴法使液滴喷射入1.0mol/L的CaCl2溶液，反应30min，得到海藻酸钙凝胶微球粒径为250 μ m ；第二步:将上述水凝胶微球自然沉降lOmin，沉降后按照10%的体积接种到含15%胎牛血清(GIBC0公司)的RPMI1640培养基(GIBC0公司)，静置IOmin后，在37°C，含体积分数5% CO2的空气饱和湿度条件下于培养箱中培养10天，可得到直径为100 μ m的肿瘤类组织体。裸鼠体内成瘤实验:将体外培养10天形成的肝癌类组织体直接接种于4-6周龄裸鼠背部两侧皮下，皮下皮丘有血管连接，42天取出，皮丘内肿瘤类组织体经病理学分析发现有诱导淋巴细胞侵袭现象，如图6所示，为肝癌类组织体裸鼠体内成瘤实验结果图，大体观与组织病理分析，提示肝癌类组织可以作为一种诱导体内细胞侵袭转移用于动物模型的构建。本发明的使用方法如下:1、该发明的应用简单易行，制备高通量的海藻酸钙凝胶微球，等量分装于相应体系中，肝癌类组织体形成后，将待评价的不同药物依据不同剂量不同孵育时间直接溶入或加入组织培养液中混匀，通过对不同生长状态的类组织体生长及病理特征评估变化来对药物的疗效进行体外组织水平实验评估。2、对放疗效果的评估上，该发明的应用也同样简单易行，可直接对海藻酸钙凝胶微球进行照射，通过对不同生长状态的类组织体生长及病理特征评估变化来调整射线剂量、照射时间、照射周期等进行体外实验评估。3、将体外培养10天形成的肝癌类组织体直接接种于4-6周龄裸鼠背部两侧皮下，皮下皮丘有血管连接，六周后观察成瘤情况，可以作为一种诱导体内细胞侵袭转移用于动物模型的构建及相关研究。4、作为一种新三位组织模型，用于三维生长状态下肝癌细胞的恶性生物学行为解析，以及肝癌组织的体外基础实验研究。


本发明公开了一种体外模拟人肿瘤转移的体外模型，模型内细胞具有肿瘤高转移特性。由人肿瘤高转移细胞系细胞以微球形水凝胶支架的建立、肿瘤细胞体外转移模型的建立、对所构建的肿瘤体外转移模型鉴定三部分构建而成。本发明的模型在体外三维培养肿瘤细胞成团生长，可检测转移中的肿瘤细胞生物学行为。该模型对于进行临床肿瘤转移机制的研究和控制转移药物的筛选有重要价值，并可作为制备抗肿瘤转移基因疫苗及建立抗肿瘤转移药物筛选技术平台。