专利名称：甲型肝炎－戊型肝炎联合疫苗及其制备方法近年来随着我国经济的快速发展，人员流动日益增加，多种传染病的发生也日益频繁，严重威胁公众的健康，并给国家造成了巨大的经济负担。因此为了有效控制传染病的流行，研究和开发预防性疫苗具有重要的理论意义和现实意义。甲型肝炎(甲肝)和戊型肝炎(戊肝)是经粪-口途径传播的急性病毒性肝炎，我国常见的甲肝和戊肝地发病形式有流行和散发两种。1988年上海因食用毛蚶导致甲肝急性大流行，出现30余万例甲肝病例；1986-1988年新疆发生戊肝大流行，12万余人受到感染，是世界上最大的一次戊肝爆发性流行。据我国2004年的统计报告表明，在各种肝炎的发病率中，戊肝发病率有上升趋势，甲肝发病率基本维持往年水平。甲肝疫苗已经上市多年，戊肝疫苗则尚在研制中。甲肝疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗两种，前者安全性好，后者生产成本较低。发达国家主要使用灭活疫苗，我国以减毒活疫苗为主，两者的生产技术已经非常成熟。而戊型肝炎病毒由于细胞培养非常困难，因此目前难以研制灭活疫苗或减毒活疫苗，国内外的研究大都集中于通过基因重组技术来研制基因工程亚单位疫苗。含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗的研究一直受到众多学者关注，并以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的热点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下。而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。百日咳-白喉-破伤风三联疫苗在计划免疫中已使用多年即为一成功之例。近年来一些新的联合疫苗如甲肝和乙肝联合疫苗也已经获得专利(欧洲专利0339667)。但是，同作为肠道传播性肝炎的甲肝和戊肝的联合疫苗，迄今为止其研制在国内外尚未见报道。
本发明提供一种方便、多效、低成本、并能够有效预防人及动物甲型肝炎和戊型肝炎的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗及其制备方法。本发明采用如下技术方案一种甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗，包括戊型肝炎病毒重组蛋白以及甲型肝炎减毒活疫苗或甲型肝炎灭活疫苗。所说的甲型肝炎减毒活疫苗，其病毒滴度为5-10LogCCID50/ml，或甲型肝炎灭活疫苗，其病毒抗原含量为250-1000U/ml，戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-50ug/ml。
一种用于制备上述甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗的方法
(a)在制备最终的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗之前，将甲型肝炎减毒活疫苗病毒和/或甲型肝炎灭活疫苗病毒吸附于氢氧化铝凝胶，将戊型肝炎病毒重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5-9.6；
(b)将调整了pH的上述组份混合。
与现有技术相比，本发明具有如下优点
本发明的联合疫苗可以有效的用于预防人及动物的甲型肝炎和戊型肝炎。动物实验表明，甲型肝炎减毒活疫苗和/或甲型肝炎灭活疫苗能够明显增加戊型肝炎病毒重组蛋白的免疫原性，戊型肝炎病毒重组蛋白(≤40ug/ml)与甲型肝炎减毒活疫苗和/或甲型肝炎灭活疫苗制备的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗的免疫效果优于高剂量的戊型肝炎病毒重组蛋白(＞40ug/ml)与甲型肝炎减毒活疫苗和/或甲型肝炎灭活疫苗制备的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗的免疫效果。因此本发明提供的联合疫苗具有单价疫苗同样甚至更好的免疫原性。
含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的热点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下。而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。
由于本发明的联合疫苗中使用了已经充分证明具有良好安全性及免疫原性的甲型肝炎减毒活疫苗和/或甲型肝炎灭活疫苗，所以能够大大降低联合疫苗的生产成本和市场价格。
本发明也提供了联合疫苗的贮藏方法，包括将明胶加入甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗，或使用硅涂层的玻璃瓶作为联合疫苗的贮藏瓶。优选明胶的浓度范围为0.5-0.7w/v％。
本发明的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗中，使用的氢氧化铝凝胶可以购买或采用已知方法进行制备。该佐剂为本领域技术人员所熟知的，易于获得和制备。
根据本发明联合疫苗的优选实施方案，联合疫苗中所含的甲型肝炎减毒活疫苗的病毒滴度为5-10LogCCID50/ml和/或甲型肝炎灭活疫苗的病毒抗原含量为250-1000U/ml，戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-50ug/ml，氢氧化铝凝胶浓度为0.6-1.5mg/ml。
动物实验表明，根据本发明联合疫苗的优选实施方案制备的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗能够诱导机体产生针对甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒的高滴度、特异性抗体，而且体外实验证实，该联合疫苗所诱导的抗体具有明确的中和作用。特别是，甲型肝炎减毒活疫苗和/或甲型肝炎灭活疫苗能够明显增加戊型肝炎病毒重组蛋白的免疫原性，戊型肝炎病毒重组蛋白(≤40ug/ml)与甲型肝炎减毒活疫苗和/或甲型肝炎灭活疫苗制备的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗的免疫效果优于高剂量的戊型肝炎病毒重组蛋白(＞40ug/ml)与甲型肝炎减毒活疫苗和/或甲型肝炎灭活疫苗制备的甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗的免疫效果。因此本发明提供的联合疫苗具有单价疫苗同样甚至更好的免疫原性。
以往大量的研究证实，位于戊型肝炎病毒开放阅读框架2羧基端2/3端的氨基酸含有戊型肝炎病毒特异性的中和抗原表位。在此研究的基础上，本发明发现戊型肝炎病毒第4基因型毒株开放阅读框架2中编码的474-619位氨基酸为含有戊型肝炎病毒中和抗原表位的最小片段，进而还发现编码453-631位氨基酸的优选蛋白片段能够在大肠杆菌中获得高效表达，能够诱导机体产生特异性中和抗体。


实施例中甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗以HAV-HEV或HAV-HEV联合疫苗表示。
实施例1
一种HAV-HEV联合疫苗，包括戊型肝炎病毒重组蛋白以及甲型肝炎减毒活疫苗或甲型肝炎灭活疫苗，所说的甲型肝炎减毒活疫苗，其病毒滴度为5-10LogCCID50/ml，或甲型肝炎灭活疫苗，其病毒抗原含量为250-1000U/ml，戊型肝炎病毒重组蛋白的含量为5-50ug/ml。
本实施例还包括免疫佐剂，该免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液，氢氧化铝凝胶的浓度范围调整为0.6-1.5mg/ml，
上述甲型肝炎减毒活疫苗是甲型肝炎减毒活疫苗L-A-1、H2疫苗株或其他可用疫苗株；甲型肝炎灭活疫苗是甲型肝炎病毒HM175株或其他可用疫苗株；戊型肝炎病毒重组蛋白的氨基末端位于戊型肝炎病毒开放阅读框架2编码的380位至480位氨基酸之间，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之间或由此氨基酸产生的衍生物，其所述的序列为RGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLMTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYPARAHTFDDFCPECRALGLQ
优先选用第453位至631位氨基酸序列(p179)。其所述的序列如下VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP
本发明的HAV-HEV联合疫苗还含有0.5-0.7w/v％用量的明胶。
实施例2
一种用于制备上述HAV-HEV联合疫苗的方法
(a)在制备最终的HAV-HEV联合疫苗之前，将甲型肝炎减毒活疫苗病毒和/或甲型肝炎灭活疫苗病毒吸附于氢氧化铝凝胶，将戊型肝炎病毒重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5-9.6；
(b)将调整了pH的上述组份混合。
下面进一步举例说明。
实施例3甲型肝炎减毒活疫苗病毒原液的制备
以含有10％小牛血清的基本培养基(MEM)(pH 7.2-7.6)培养人二倍体成纤维细胞MRC5，细胞形成致密单层后弃去生长培养液，并以Hanks’液反复洗涤细胞后，接种预先制备的甲型肝炎病毒种子液。34-36℃吸附2小时后，向培养物中补加细胞生长维持液，并于34-36℃培养4周，每周换液1-2次。培养后弃去维持液和残留的小牛血清，直接加入含3mM NaCl但不含酚红的199综合培养液34-36℃继续培养3-4天。然后收集细胞，经过反复冻融和细胞破碎后离心，收集的上清液即为甲型肝炎减毒活疫苗病毒原液。
实施例4甲型肝炎灭活疫苗病毒原液的制备
按照疫苗制备要求，采用人二倍体成纤维细胞MRC5进行甲型肝炎疫苗株HM175的细胞培养，将培养所得的病毒纯化后用福尔马林灭活，具体制备方法和技术路线如下
(1)培养人二倍体成纤维细胞MRC5，待细胞长成单层后，用Hanks’液充分洗涤细胞单层，除去残留的小牛血清，接种甲型肝炎疫苗株HM175，37℃吸附2小时，弃去接种物，再洗涤，然后加入不含小牛血清的培养液，37℃培养，待细胞病变达“+++”时收获，冻融3次后离心，制备HAV种子批，用空斑试验滴定其感染滴度，分装后低温保存；
(2)如上所述，大量培养甲型肝炎疫苗株HM175，收获后加入终浓度为1％NP40，冻融3次后离心，收集冻融上清液；
(3)用超滤法浓缩病毒，再用葡聚糖柱层析或密度梯度离心法纯化病毒；
(4)纯化病毒经纯度鉴定后，用终浓度1∶4000的福尔马林灭活，37℃作用15天；
(5)用细胞培养多次传代的方法检测有无残留活病毒，同时对灭活病毒进行蛋白浓度和抗原滴度的测定。
实施例5戊型肝炎病毒重组蛋白的表达和纯化
(1)以戊型肝炎病毒IV型中国株基因序列为模板，用引物1(5’-CCC CCCATG GTT ATC CAG GAC TAT GAT AAT C-3’)和引物2(5’-CCC CTC GAG TCAAGG GTA ATC AAC AGT GTC CTC CA-3’)扩增ORF2编码多肽453-631(p179)的基因片段。PCR条件为94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入质粒载体pET28(a)+中。
(2)将表达质粒转化入表达菌株E.coli BL-21(DE3)中，挑取单菌落，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基培养至OD550＝0.6～0.8，用终浓度为0.2～1.0mMIPTG进行诱导，诱导温度为37℃，摇床摇速为200rpm，3-4小时后离心收集菌体，用细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.2，300mM NaCl)悬浮菌体沉淀，冻融6次后超声破碎菌体，离心收集上清液，再用离子交换、葡聚糖层析等方法进行纯化，最后使用UV280、SDS-PAGE等方法进行检测。
实施例6制备甲型肝炎减毒活疫苗病毒和戊型肝炎重组蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液
为了增加免疫原性，分别将甲型肝炎减毒活疫苗的病毒原液和戊型肝炎病毒重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶(1)将甲型肝炎减毒活疫苗的病毒原液和氢氧化铝凝胶搅拌混合；(2)将戊型肝炎重组蛋白和氢氧化铝凝胶搅拌混合。再将(1)和(2)所得的溶液混合，调整甲型肝炎减毒活疫苗的病毒滴度为6.5LogCCID50/ml，戊型肝炎重组蛋白浓度为20ug/ml，氢氧化铝凝胶的浓度为1.0mg/ml；所得的混合溶液即为甲型肝炎减毒活疫苗和戊型肝炎病毒重组蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液。
实施例7制备甲型肝炎灭活疫苗和戊型肝炎病毒重组蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液
为了增加免疫原性，分别将甲型肝炎灭活疫苗的病毒原液和戊型肝炎重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶(1)将甲型肝炎灭活疫苗的病毒原液和氢氧化铝凝胶搅拌混合；(2)将戊型肝炎重组蛋白和氢氧化铝凝胶搅拌混合。再将(1)和(2)所得的溶液混合，调整甲型肝炎灭活疫苗的病毒抗原含量为500U/ml，戊型肝炎重组蛋白浓度为20ug/ml，氢氧化铝凝胶的浓度为1.0mg/ml；所得的混合溶液即为甲型肝炎灭活疫苗和戊型肝炎病毒重组蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液。
实施例8减毒HAV-HEV联合疫苗的免疫原性实验
A实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠240只(扬州大学比较医学实验中心提供)，随机分为24组，每组10只。A组空白对照组，注射氢氧化铝凝胶(浓度为1.0mg/ml)，0.1ml/只；B组甲肝减毒活疫苗组，注射甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；C组甲肝减毒活疫苗组，注射甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；D组甲肝减毒活疫苗组，注射甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；E组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)，0.1ml/只；F组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)，0.1ml/只；G组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)，0.1ml/只；H组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)，0.1ml/只；I组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)，0.1ml/只；J组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；K组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；L组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；M组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；N组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；O组减毒HAV-HEY联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；P组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；Q组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；R组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；S组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；T组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；U组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；V组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；W组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；X组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)+甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；各组实验动物分别于0、4、6周注射相应疫苗三次，其中0周背部皮下多点注射0.1ml相应疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相应疫苗。
B检测方法
B-1甲肝抗体体外中和实验
采用快速空斑中和实验法检测甲肝抗体。将1∶1000稀释的抗血清100ul与含100TCID50/100ul甲肝病毒悬液混合，同时设对照组，37℃作用1小时后，加入24孔细胞培养板，并加入含10％小牛血清的FRHK4细胞悬液0.4ml/孔(约4×105细胞)，混匀，置CO2培养箱37℃孵育60-90分钟后吸尽液体，加入含10％小牛血清营养凝胶(含1％琼脂糖)0.5ml/孔，倒置孵育72小时，再加入中性红凝胶0.25ml/孔，继续孵育72小时，计数空斑，最后将能减少病毒空斑数目90％的抗血清判为阳性血清。
B-2戊肝抗体体外中和实验
采用基于PCR的体外中和实验方法，将1∶40稀释的抗血清100ul与含100TCID50/100ul戊肝病毒悬液混合，37℃作用1小时后接种PLC/PRF/5细胞，37℃培养2小时后，Hank’s液洗涤细胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCCAAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)进行逆转录-巢式PCR检测戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR条件为第一轮94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35个循环，引物为引物3和引物6；第二轮94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30个循环，引物为引物4和引物5；PCR阴性判为中和试验阳性，最后将能中和病毒的抗血清判为阳性血清。
C结果
C-1如表一所示，使用不同剂量的甲肝减毒活疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随甲肝减毒活疫苗免疫剂量的提高而升高。
表一 不同剂量的甲肝减毒活疫苗诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-2如表二所示，使用不同剂量的戊肝疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随戊肝重组蛋白免疫剂量的提高而升高，当戊肝重组蛋白免疫剂量≥20ug/ml时，全部小鼠均能产生阳性血清。
表二 不同剂量的戊肝重组蛋白诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-3如表三所示，甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，B、J、K、L、M组有60％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清，N组有30％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表三 甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为3.25LogCCID50/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-4如表四所示，甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，C、O、P、Q、R组的动物均能诱导出抗HAV的阳性血清，S组只有60％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表四 甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-5如表五所示，甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，D、T、U、V、W组的动物均能诱导出抗HAV的阳性血清，X组只有60％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表五 甲肝减毒活疫苗(病毒滴度为10LogCCID50/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-6如表六所示，戊肝重组蛋白(5ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，E组有80％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清，J、O、T组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表六 戊肝重组蛋白(5ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-7如表七所示，戊肝重组蛋白(10ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，F组有80％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清，K、P、U组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表七 戊肝重组蛋白(10ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-8如表八所示，戊肝重组蛋白(20ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，G、L、Q、V组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表八 戊肝重组蛋白(20ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-9如表九所示，戊肝重组蛋白(40ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，H、M、R、W组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表九 戊肝重组蛋白(40ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-10如表十所示，戊肝重组蛋白(80ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，I、N、S、X组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表十 戊肝重组蛋白(80ug/ml)与不同剂量的甲肝减毒活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
以上的实施例结果表明，不同剂量的甲肝减毒活疫苗与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠时，不同剂量的甲肝减毒活疫苗均能增强戊肝重组蛋白的免疫效果(表六、表七)；戊肝重组蛋白剂量≤40ug/ml时，对甲肝减毒活疫苗的免疫效果无影响(表三、表四、表五)。
实施例九灭活HAV-HEV联合疫苗的免疫原性实验
A实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠240只(扬州大学比较医学实验中心提供)，随机分为24组，每组10只。A组空白对照组，注射氢氧化铝凝胶(浓度为1.0mg/ml)，0.1ml/只；B组甲肝灭活疫苗组，注射甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)，0.1ml/只；C组甲肝灭活疫苗组，注射甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)，0.1ml/只；D组甲肝灭活疫苗组，注射甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)，0.1ml/只；E组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)，0.1ml/只；F组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)，0.1ml/只；G组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)，0.1ml/只；H组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)，0.1ml/只；I组戊肝疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)，0.1ml/只；J组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)，0.1ml/只；K组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)，0.1ml/只；L组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)，0.1ml/只；M组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)，0.1ml/只；N组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)，0.1ml/只；O组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)，0.1ml/只；P组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)，0.1ml/只；Q组灭活HAV-HE联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)，0.1ml/只；R组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)，0.1ml/只；S组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)，0.1ml/只；T组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(5ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)，0.1ml/只；U组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(10ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)，0.1ml/只；V组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)，0.1ml/只；W组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(40ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)，0.1ml/只；X组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊肝病毒重组蛋白(80ug/ml)+甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)，0.1ml/只；各组实验动物分别于0、4、6周注射相应疫苗三次，其中0周背部皮下多点注射0.1ml相应疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相应疫苗。
B检测方法
B-1甲肝抗体体外中和实验
采用快速空斑中和实验法检测甲肝抗体。将1∶1000稀释的抗血清100ul与含100TCID50/100ul甲肝病毒悬液混合，同时设对照组，37℃作用1小时后，加入24孔细胞培养板，并加入含10％小牛血清的FRHK4细胞悬液0.4ml/孔(约4×105细胞)，混匀，置CO2培养箱37℃孵育60-90分钟后吸尽液体，加入含10％小牛血清营养凝胶(含1％琼脂糖)0.5ml/孔，倒置孵育72小时，再加入中性红凝胶0.25ml/孔，继续孵育72小时，计数空斑，最后将能减少病毒空斑数目90％的抗血清判为阳性血清。
B-2戊肝抗体体外中和实验
采用基于PCR的体外中和实验方法，将1∶40稀释的抗血清100ul与含100TCID50/100ul戊肝病毒悬液混合，37℃作用1小时后接种PLC/PRF/5细胞，37℃培养2小时后，Hank’s液洗涤细胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCCAAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)进行逆转录-巢式PCR检测戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR条件为第一轮94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35个循环，引物为引物3和引物6；第二轮94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30个循环，引物为引物4和引物5；PCR阴性判为中和试验阳性，最后将能中和病毒的抗血清判为阳性血清。
C结果
C-1如表一所示，使用不同剂量的甲肝灭活疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随甲肝灭活疫苗免疫剂量的提高而升高。
表一 不同剂量的甲肝灭活疫苗诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-2如表二所示，使用不同剂量的戊肝疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随戊肝重组蛋白免疫剂量的提高而升高，当戊肝重组蛋白免疫剂量≥20ug/ml时，全部小鼠均能产生阳性血清。
表二 不同剂量的戊肝重组蛋白诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-3如表三所示，甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，B、J、K、L、M组有60％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清，N组有30％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表三 甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为200U/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-4如表四所示，甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，C、O、P、Q、R组的动物均能诱导出抗HAV的阳性血清，S组只有60％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表四 甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-5如表五所示，甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，D、T、U、V、W组的动物均能诱导出抗HAV的阳性血清，X组只有60％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表五 甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/ml)与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
C-6如表六所示，戊肝重组蛋白(5ug/ml)与不同剂量甲肝灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，E组有80％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清，J、O、T组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表六 戊肝重组蛋白(5ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-7如表七所示，戊肝重组蛋白(10ug/ml)与不同剂量甲肝灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，F组有80％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清，K、P、U组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表七 戊肝重组蛋白(10ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-8如表八所示，戊肝重组蛋白(20ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，G、L、Q、V组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表八 戊肝重组蛋白(20ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-9如表九所示，戊肝重组蛋白(40ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，H、M、R、W组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表九 戊肝重组蛋白(40ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
C-10如表十所示，戊肝重组蛋白(80ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，I、N、S、X组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表十 戊肝重组蛋白(80ug/ml)与不同剂量的甲肝灭活疫苗进行联合免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
以上的实验结果表明，不同剂量的甲肝灭活疫苗与不同剂量的戊肝重组蛋白进行联合免疫小鼠时，不同剂量的甲肝灭活疫苗均能增强戊肝重组蛋白的免疫效果(表六)；戊肝重组蛋白剂量≤40ug/ml时，对甲肝灭活疫苗的免疫效果无影响(表三、表四、表五)。
实施例10减毒HAV-HEV联合疫苗和灭活HAV-HEV联合疫苗的免疫原性比较
A实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄雌性BALB/C纯系小鼠20只(扬州大学比较医学实验中心提供)，随机分为2组，每组10只，A组减毒HAV-HEV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲型肝炎减毒活疫苗(病毒滴度为6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；B组灭活HAV-HEV联合疫苗组，注射戊型肝炎病毒重组蛋白(20ug/ml)+甲型肝炎灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/ml)，0.1ml/只。各组实验动物分别于0、4、6周注射相应疫苗三次，其中0周背部皮下多点注射0.1ml相应疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相应疫苗。
B检测方法
B-1甲肝抗体体外中和实验
采用快速空斑中和实验法检测甲肝抗体。将1∶1000稀释的抗血清100ul与含100TCID50/100ul甲肝病毒悬液混合，同时设对照组，37℃作用1小时后，加入24孔细胞培养板，并加入含10％小牛血清的FRHK4细胞悬液0.4ml/孔(约4×105细胞)，混匀，置CO2培养箱37℃孵育60-90分钟后吸尽液体，加入含10％小牛血清营养凝胶(含1％琼脂糖)0.5ml/孔，倒置孵育72小时，再加入中性红凝胶0.25ml/孔，继续孵育72小时，计数空斑，最后将能减少病毒空斑数目90％的抗血清判为阳性血清。
B-2戊肝抗体体外中和实验
采用基于PCR的体外中和实验方法，将1∶40稀释的抗血清100ul与含100TCID50/100ul戊肝病毒悬液混合，37℃作用1小时后接种PLC/PRF/5细胞，37℃培养2小时后，Hank’s液洗涤细胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCCAAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)进行逆转录-巢式PCR检测戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR条件为第一轮94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35个循环，引物为引物3和引物6；第二轮94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30个循环，引物为引物4和引物5；PCR阴性判为中和试验阳性，最后将能中和病毒的抗血清判为阳性血清。
C结果
结果如表一、表二所示，使用该方案中的减毒HAV-HEV联合疫苗(A组)和灭活HAV-HEV联合疫苗(B组)的免疫结果表明，A组和B组的实验动物均能诱导出抗HAV、抗HEV的阳性血清。
表一 不同组进行免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
表二 不同组进行免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
实施例11明胶的使用
为了增加所制备的HAV-HEV联合疫苗的稳定性，加入终浓度为0.5-0.7w/v％的明胶，结果在2-8℃贮藏3个月后没有观察到疫苗的聚集和对贮存用玻璃瓶的黏附。


本发明公开了一种甲型肝炎－戊型肝炎联合疫苗，包括戊型肝炎病毒重组蛋白以及甲型肝炎减毒活疫苗或甲型肝炎灭活疫苗；一种用于制备上述甲型肝炎－戊型肝炎联合疫苗的方法在制备最终的甲型肝炎－戊型肝炎联合疫苗之前，将甲型肝炎减毒活疫苗病毒和/或甲型肝炎灭活疫苗病毒吸附于氢氧化铝凝胶，将戊型肝炎病毒重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，将调整了pH的上述组份混合。本发明具有方便、多效、低成本、并能够有效预防人及动物甲型肝炎和戊型肝炎等优点。