Abc群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法[0002]脑膜炎球菌感染所致的侵袭性败血症、脑膜炎、肺炎等疾病在世界各地均有发生，并引起很高的病死率和致残率，严重地威胁着人类健康。根据脑膜炎球菌荚膜多糖组成的差异，可将其分成13个血清群，且所有血清群均致病。其中尤以A、B、C群病例最多，占脑膜炎球菌病例的90%以上。[0003]目前，国内外已有多种不同种类和不同组合的脑膜炎球菌疫苗上市，其中荚膜多糖疫苗包括A群、C群、AC群和ACYW135群；多糖-蛋白结合疫苗包括A群、C群、AC群、ACYffl35 群。[0004]脑膜炎球菌疾病的高危人群主要是婴幼儿，在早期研发的各血清群多糖疫苗中其细菌荚膜多糖是一种T细胞非依赖性抗原，也是一种半抗原，因婴幼儿免疫系统发育尚不完善，故而不能有效识别荚膜多糖抗原而产生有效抗体，故而预防效果不理想。在Hib结合疫苗成功上市的启迪下，脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗也相继研发成功并上市，但目前国内外的各种组合的脑膜炎球菌结合疫苗，所用蛋白载体均为破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)或白喉无毒变异株蛋白(CRM197)。这些蛋白载体虽也能刺激机体产生相应抗体，但这种抗体与脑膜炎球菌疾病的预防无关。并且尤其是TT和DT，是由各自细菌毒素经甲醛或戊二醛脱毒而来的，在百白破三联疫苗中为了维持其脱毒效果的稳定，避免出现毒性逆转现象，需要加入微量的甲醛或戊二醛。而在以TT或DT为蛋白载体的结合疫苗中是不加微量甲醛或戊二醛的，因而存在着蛋白载体毒性逆转的风险。并且破伤风毒素是高致敏原性物质，虽经脱毒后的破伤风类毒素(TT)也存在着导致过敏发生的高风险。这些因素，均构成了疫苗接种的安全隐患。
[0005]本发明的目的是提供一种针对ABC群脑膜炎球菌感染性疾病均有效的预防用疫苗，并能有效规避由TT或DT为蛋白载体而引起的毒性逆转、过敏反应等不安全风险。[0006]为了实现本发明目的，本发明的一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其由A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖(CPS)分别与B群血清型4型脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)共价结合的多糖-蛋白偶联物，以及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌外膜蛋白囊(OMV)组成。[0007]前述的联合疫苗，所述A群脑膜炎球菌荚膜多糖分离自菌株编号为CMCC29201的A群脑膜炎球菌，所述C群脑膜炎球菌荚膜多糖分离自菌株编号为CMCC29205的C群脑膜炎球菌，所述B群血清型4型脑膜炎球菌OMV分离自菌株编号为CMCC29356的B群脑膜炎球菌，所述B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV分离自保藏编号为CGMCC N0.8982的B群脑膜炎球菌。[0008]前述的联合疫苗，其所用A、B、C群脑膜炎球菌菌株包括但不限于其他来源的不同血清型和基因型、克隆群的筛选株。
[0009]前述的联合疫苗，所述疫苗中游离多糖的含量< 15%，游离蛋白的含量< 3%。
[0010]前述的联合疫苗，用所述疫苗免疫动物后，血清抗体阳转率> 90%。
[0011]前述的联合疫苗，每毫升疫苗中含有A群脑膜炎球菌荚膜多糖8-40 μ g，C群脑膜炎球菌荚膜多糖8-40 μ g，B群ST-4821基因型脑膜炎球菌0MV10-80 μ g。将疫苗分装于西林瓶或预充式注射器内密封保存。例如，每剂分装量为0.5ml。
[0012]前述的联合疫苗，所述疫苗为液体剂型或冻干剂型。
[0013]当所述疫苗为液体剂型时，任选含有铝佐剂，所述铝佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝等。
[0014]当所述疫苗为冻干剂型时，任选含有赋形剂，所述赋形剂包括但不限于乳糖、蔗糖、明胶、山梨醇或人血白蛋白等。用于冻干剂型疫苗的稀释液时，其稀释液可以是磷酸盐缓冲生理盐水或生理盐水，也可以采用含铝佐剂的缓冲液或生理盐水，其中，每毫升稀释液中铝含量为0.05-0.80mg。
[0015]本发明还提供所述联合疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0016]1)A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖的制备:分别向A、C群脑膜炎球菌液体培养上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵沉淀多糖，离心获得荚膜多糖复合物，再向复合物中加入氯化钙或氯化钠解聚，然后用乙醇分步沉淀，获得粗制多糖，经脱氧胆酸钠处理，用CaptoAdhere和Capto DEAE凝胶层析，收集流穿液，再经G25凝胶脱盐，或用苯酚抽提，超滤，除菌过滤后即得纯化的荚膜多糖，置_20°C以下或冻干后保存。
[0017]2) B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV的制备:分别对B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌的液体培养液进行连续流离心，收获菌体，菌体经抽提分离出OMV复合物，经脱氧胆酸钠处理后，再依次经硫酸铵分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等电点沉淀，离子交换凝胶层析和疏水凝胶层析，G25凝胶层析，分子筛层析等，超滤，除菌过滤后即得纯化的0MV，置2-8°C避光保存。
[0018]3)荚膜多糖-蛋白偶联物的制备:将步骤I)中制备的A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖，分别经溴化氰活化后，在活化的糖链上连接已二酰肼，超滤去除游离的溴化氰、已二酰肼，然后加入步骤2)中制备的B群血清型4型脑膜炎球菌OMV作为蛋白载体，在ADH的桥联作用下分别形成A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物，经分子筛凝胶层析收集所述偶联物，除菌过滤后，置2-8 °C避光保存。
[0019]4)疫苗配制:根据A群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物的磷含量计算A群脑膜炎球菌荚膜多糖含量，根据C群群脑膜炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物的唾液酸含量计算C群脑膜炎球菌荚膜多糖含量，根据B群ST-4821基因型脑膜炎球菌OMV的含量，配制ABC群脑膜炎球菌联合疫苗毫升。
[0020]在A、C群CPS与B群血清型4型OMV共价偶联物的制备中，A、C群CPS可分别经酸水解，形成分子量较均一的I X IO3-1 X IO6道尔顿的CPS，经高碘酸氧化，硼氢化合物作用而形成。
[0021] 本发明还提供一株新分离的B群ST-4821基因型脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningococcus) xrsw341215 (即B群ST-4821基因型脑膜炎球菌)，来源于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者血液标本分离株，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC N0.8982，保藏日期2014年4月I日。
[0022]本发明涉及ABC群脑膜炎球菌联合疫苗的研发、质量标准建立和规模化生产，用于适龄人群接种，预防疫苗型血清群脑膜炎球菌感染所致的侵袭性疾病。
[0023]本疫苗由三种抗原成分经疫苗相融性研究等确定配伍，组合而成。三种抗原成分别为=A群脑膜炎球菌CPS与B群脑膜炎球菌(CMCC29356株)OMV共价结合的A群偶联物；C群脑膜炎球菌CPS与B群脑膜炎球菌(CMCC29356) OMV共价结合的C群偶联物；B群脑膜炎球菌(xrsw341215株，保藏编号CGMCC N0.8982) 0MV。疫苗分装于2ml西林瓶或预充式注射器中，每剂疫苗0.5ml，含分别结合到载体蛋白上的A群CPS:4-20 μ g, C群多糖4_20 μ g和xrsw341215株B群0MV5-40 μ g，铝佐剂0.025-0.4mg。检定合格后，于2_8°C避光保存，效期为24个月。
[0024]本发明提供一种以ABC群脑膜炎球菌抗原成分所组成的联合疫苗，其中，A、C群荚膜多糖分别与B群血清型4型菌体OMV载体偶联，用国内优势致病的另一株B群ST-4821基因型脑膜炎球菌菌株0MV，组成由A、C荚膜多糖-蛋白偶联物和B群OMV的三价联合疫苗。该疫苗可同时预防A、B、C群脑膜炎球菌侵袭性疾病，尤其针对2岁以下流脑高危人群预防，具有更好的保护效果，并且针对自然界A、B、C群脑膜炎球菌侵袭具有更好的特异性，更好的保护作用。
[0025]本发明具有以下优点:
[0026](一)采用同一致病菌、不同血清群的B群脑膜炎球菌OMV为蛋白载体，分别与A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖共价结合，是多糖-蛋白结合疫苗、载体蛋白应用的最佳组合。
[0027]( 二)B群脑膜炎球菌CMCC29356株OMV是血清型4型，而A群流脑的蛋白分型也均为血清型4型，因而，该B群脑膜炎球菌OMV产生的抗体具有辅助、增强针对A群预防效
果O
[0028](三)有效规避了TT、DT为载体蛋白的毒性逆转、过敏反应等不安全风险。
[0029](四)筛选国内优势致病的B群脑膜炎球菌菌株xrsw341215，纯化的OMV抗原，针对国内B群流脑疾病的预防，具有更好的专一性、针对性和较广泛的保护范围。
[0030](五)B群脑膜炎球菌(OMV)制备工艺具有独创性、新颖性，因而，有效保持了菌体OMV的天然构象，所产生的抗体针对自然界致病菌的侵袭具有更好的特异性。
[0031](六)本疫苗含有针对优势致病的A、B、C群脑膜炎球菌抗原成分，可同时预防ABC群脑膜炎球菌侵袭。

[0032]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0033]实施例1ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备工艺
[0034]本实施例由来自于四株脑膜炎球菌的纯化组分抗原组成，具体的血清群及抗原成分如下:[0035]A群脑膜炎球菌菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号CMCC29201，组分抗原是荚膜多糖(CPS)。
[0036]C群脑膜炎球菌菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号CMCC29205，组分抗原是荚膜多糖(CPS)。
[0037]B群脑膜炎球菌菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号CMCC29356，组分抗原是外膜蛋白囊(OMV)。
[0038]B群脑膜炎球菌菌株来源于国内B群流行性脑脊髓膜炎患者血液标本分离菌株xrsw341215，保藏编号为CGMCC N0.8982，组分抗原是外膜蛋白囊(OMV)。
[0039]生产工艺包括以下步骤:
[0040]1、A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖的制备
[0041]分别向A、C群脑膜炎球菌液体培养上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵而沉淀多糖，经离心获得荚膜多糖(CPS)复合物，再经加入氯化钙或氯化钠解聚，乙醇分步沉淀，获得粗制多糖，经脱氧胆酸钠处理，用Capto Adhere和Capto DEAE凝胶层析,收集流穿液，再经G25凝胶脱盐，或苯酚抽提，超滤，去除杂质成分，除菌过滤，而获得纯化的CPS，检定合格，储存于_20°C以下保存，有效期5年。
[0042]2、B群血清型4型及B群ST-4821基因型脑膜炎球菌(OMV)的制备
[0043]分别将二株B群脑膜炎球菌液体培养液经连续流离心，收获菌体，从菌体经抽提液溶出膜蛋白复合物，再依次经脱氧胆酸钠处理，硫酸胺分步沉淀，乙醇分步沉淀，三氯醋酸沉淀，等电点沉淀，离子交换凝胶层析，疏水凝胶层析，分子筛凝胶层析，G25凝胶层析，超滤，除菌过滤，而获得纯化的0MV，经检定合格，储存于2-8°C避光保存，有效期I年。
[0044]3、荚膜多糖-蛋白偶联物的制备
[0045]A、C群脑膜炎球菌CPS，分别经溴化氰(CNBr)活化后，再在活化糖链连接上已二酰肼(ADH)，经超滤去除游离的CNBr、ADH,加入CMCC29356株B群脑膜炎球菌OMV为蛋白载体，经加入的碳二亚胺(EDAC)缩合作用，在ADH的桥联作用下形成多糖-蛋白间的共价结合键，制备得到荚膜多糖-蛋白偶联物。在此偶联物中含有四种不同成分，分别是大分子量的荚膜多糖-蛋白偶联物，小分子量多糖-蛋白偶联物，未结合到蛋白载体的游离多糖，未结合到多糖的游离蛋白。经分子筛凝胶层析，收集大分子量荚膜多糖-蛋白偶联物，收获除菌过滤原液，经检测合格，于2-8°C避光保存，有效期为6个月。
[0046]4、疫苗配制:根据测定A群偶联物的磷含量计算A多糖含量，C群偶联物的唾液酸含量计算C多糖含量，B群ST-4821基因型OMV的蛋白含量，配制ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，使每1ml疫苗中含有A群多糖8-40 μ g，C群多糖8_40 μ g，B群OMV蛋白10-80 μ g。再分装至西林瓶或预充式注射器内，每剂分装量为0.5ml。经检定合格，于2-8 °C避光保存，有效期为2年。
[0047]生产工艺特点:
[0048](I)采用流脑半综合液体培养基进行B群脑膜炎球菌大罐液体培养，细菌繁殖快，产率高，通常只需4.5-6h，每升培养基收获菌体12-18克。
[0049](2)蛋白产率高:从菌体纯化获得的蛋白产率达1.0-1.6%。
[0050](3)交叉保护率高 ，对AC群有显示辅助增强效应
[0051]a.B群CMCC29356株OMV抗原为血清型4型，与A群蛋白抗原的血清型同为血清型4型。根据至今的研究结果证实，A群菌蛋白抗原为单一的血清型4型，因此B群CMCC29356株OMV抗原所产生的针对血清型4型的特异性抗体，对所有A群菌具有广泛的交叉保护性；
[0052]b.从国内筛选的B群优势致病株xrsw341215，是我国独有的基因型(ST-4821)菌株，且与国内2003年春季流行的C群脑膜炎球菌菌株是同一基因型(ST-4821)，因此，其抗体针对C群保护也有效；
[0053]c.ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，各自针对A、C的抗体效价，显著高于单价A、C偶联物免后抗体，说明B群菌株编号为CMCC29356的脑膜炎球菌载体蛋白、xrsw341215株OMV抗原具有辅助增强效应。
[0054]实施例2不同生产厂家AC群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较研究
[0055]实验方案:
[0056]1、四种来源的疫苗分别是国产IAC疫苗、国产2AC疫苗、祥瑞生物AC疫苗以及实施例I中制备的ABC群脑膜炎球菌联合疫苗。
[0057]2、实验动物:BALB/C小鼠，12~14克/只体重。
[0058]3、分组:每组10只，雌、雄各半，每罐饲养5只同性小鼠。
[0059]4、免疫方式:皮下注射；免疫剂量:2.5 μ g多糖/A、C各群。
[0060]5、免疫程序:全程免疫三针次，即0、14、21天，各免疫一针。
[0061]6、血清分离及检测:每次免后二周采血，分离血清，ELISA测定单只小鼠抗体效价，计算每组几何平均滴度(GMT)，比较四种疫苗免疫原性。结果如表1所示。
[0062]7、实验结果分析
[0063]7.1AC群脑膜炎球菌结合疫苗国产1、国产2，由于载体蛋白是TT，因而免疫血清测不到B群脑膜炎球菌B4、B.ST-4821血清效价；祥瑞生物AC疫苗是以B群Nm血清型4型OMV为载体蛋白，免疫血清显示较高的血清效价，ABC群Nm疫苗中含有A、C、B.4、B.ST-4821抗原成分，并均能测到较高的抗体效价。
[0064]7.2四种来源的疫苗，不同免疫针次的血清抗体效价测定显示，有明显的免疫针次效应，免疫回忆应答明显，血清抗体效价分别三针次> 二针次 >一针次。
[0065]7.3四种来源的疫苗中，各自A、C群抗体效价测定数据显示，以B群血清型4型OMV为载体蛋白的结合疫苗的A、C群抗体效价显然高于以TT为载体的结合疫苗。这说明B群OMV有增强A、C群抗体效价的辅助效应。
[0066]7.4ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，不但产生了 B.ST-4821的较高的抗体效价，而且各针次的A、C、B.4免疫血清GMT均高于国产1、国产2、祥瑞生物的AC群脑膜炎球菌结合疫苗，说明B.ST-48210MV抗原成分可能存在较广泛的辅助增强效应。
[0067]实施例3国内B群流脑患者分离株xrsw341215免疫血清与国内、国外不同来源的优势致病B群流脑菌株的交叉抗体测定
[0068]1、国内菌株:从167株国内收集的B群流脑患者、携带者中筛选，确定的患者分离优势致菌株，共8株(表2)。
[0069]表2国内B群患者分离株
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