专利名称：结合框运输蛋白abc1的调节作用的制作方法本申请请求下列申请的优先权1999年6月18日提交登记号为60/140264的美国临时申请、1999年9月14日提交登记号为60/153872的美国临时申请以及1999年11月19日提交登记号为60/166573的美国临时申请。乳糜微滴、VLDLs、IDLs、以及LDLs将外源及内源胆固醇和三酰甘油运输到外周部位，在此处脂类参与各种代谢途径，作为细胞膜的组要成分。乳糜微粒由小肠粘膜合成，是将食物中胆固醇和三酰甘油运输到各种组织中的工具。VLDLs在肝中生成，负责将肝中合成的胆固醇和三酰甘油运输到肝外组织，例如肌肉和脂肪组织。空腹血清中，VLDLs含有占总血清胆固醇总量10-15％的血清胆固醇和大部分的甘油三酯。循环系统中，VLDLs通过脂蛋白脂酶的作用转化为LDLs。LDLs是将胆固醇分送到所有组织的主要血浆载体，一般含有60-70％的总空腹血清胆固醇。相反，HDLs参与“反向胆固醇运输”，通过该途径外周部位的过量胆固醇被运回到肝中，以胆盐的形式排泄出去(Glomset，J.A.，J.LipidRes.，9，155-167(1968))。初生的HDLs在肝和小肠中从头合成，以富含蛋白的碟状颗粒的形式存在，其中不含胆固醇和胆固醇酯。实际上，HDLs的主要功能是作为载脂蛋白的循环储备，主要为apo C-I，aco C-II及apo E。通过积累细胞来源的胆固醇酯新生或富含蛋白的HDLs转化为球形脂蛋白颗粒。通常，HDL含有20-30％的总空腹血清胆固醇。根据当前理论，细胞胆固醇向HDL的反向流动是通过下述两机制介导的水扩散途径和载脂蛋白介导途径。这些不同途径之间的相对重要程度取决于细胞类型和代谢状态(Oram等.，脂类研究杂志J LipidRes.，372743-2491(1996)；Rothblat等人，J.LipidRes.，407g1-796(1999)；SteinCt al.，Atherosclerosis，144285-301(1999))。对于多数细胞而言，水扩散途径是胆固醇排放的主要途径(Johnson等人，Biochim.Biophys.Acta，1085273-298(1991))。在细胞外空间内通过被动运输，该途径可实现胆固醇在细胞膜和脂蛋白受体之间的双向交换，例如HDL，(Remaley等人，Arterioscier.Thromb.Vasc.Biol.，171813-1821(1997)；Rothblat等人，JLip.Res.，40781-796(1999))。上述交换也可发生在称为小窝的表面微区(Fielding等人.Biochemistry，3414288-14292 91995))。网状流动通过在LCAT的作用将细胞外腔室中的胆固醇转化为胆固醇酯来实现驱动。或者，在巨噬细胞和成纤维细胞中，胆固醇和磷脂流动主要是通过脂蛋白介导的，例如，apo A-I，apo A-Il，和Apo E(Remaley，swpvu(1997)；Fmncis，等人.J. Clin.Invest.，9678-87(1995)；Vega等人，.J Intern.Med.，2265-15(1989)；Sakar等人，Biochim.Biophys.Acta，143885-98(1999)；Hara等人，BioL Chem.，2663080-3086(1991)；Fielding等人，.J LiptdRes.4 38，1503-1521(1997)；Oram等人，J.Lipid Res.，374.2743-2491(1996)).上述脂蛋白介导的脂类排放途径在巨噬细胞及其他清除细胞中占绝对主导地位，尤其是当这些细胞承载胆固醇和/或生长停滞时。载脂蛋白-介导的流动是一种活性运输途径，需要载脂蛋白与细胞表面间的直接相互作用，载脂蛋白的脂化以及随后来自细胞的脂类-载脂蛋白颗粒的解离(Oram，supnz(1996)；Mendez，A.，J Lipid Re，38，1807-1821(1997)；Remaley，supra(1997)；Mendcz，AJ.，J.LtpidRes..，37，2510-2524(1996))。一旦被清除出细胞，富含胆固醇的HDL颗粒就被运输到肝，或如上所述排出体外。遗传缺陷或者作为另一疾病的次级效应而引发的脂蛋白功能和/或异常，能够导致严重的生物学后果。除饮食外，糖尿病、甲状腺机能减退以及肝病都能导致LDL-胆固醇和甘油三酯血浆水平的提高。LDL-胆固醇和甘油三酯水平的提高已被视为引发冠心病的主要危险因素，而冠心病是美国及其他发达国家死亡的主要原因(Hokanson等人，J Cardiovasc.Risk.，3213-219(19％)；The Expert Panel，JAAM，2693015-3023(1993))。过量LDL-胆固醇积聚在动脉壁上会引发动脉粥样硬化病变的出现，而该病变在心脏病的发病过程中起着主要作用。病变的形成是由于动脉壁释放出的基团氧化LDL而形成。根据该理论，LDL的氧化激发炎症应答，将循环细胞吸引到病发部位。在这些细胞中包括巨噬细胞和其他含有清除受体的细胞，该受体以非调控的方式积累胆固醇(Brown等，Ann.Rev.Biochem.，52223-261(1986))。内源胆固醇的大量储存导致泡沫细胞表型的转化，该转化是引发血管病变的主要原因。随着噬斑的增大，动脉壁收缩，流向心脏的血排放量减小。但是，令人惊奇的是，约有60％的心脏病发生在LDL-胆固醇并未升高的人群中。这些人当中，约有45％的血中HDL-胆固醇低于平均水平，这表明低的HDL-胆固醇水平是引发心脏病的重要因素。实际上，近来研究发现HDL-胆固醇水平的降低是早期冠心病患者中最常见的脂蛋白异常(Genest J，Circulation，852025-2033(1992)；Genest等人，Arterioscier.Thromb.，131728-1737(1993))。尽管HDL-胆固醇与冠心病之间的反向联系尚不清楚，但是已经说明，HDL的心脏保护作用来自于其下述活性即能加速胆固醇从动脉粥样硬化病变中巨噬细胞泡沫细胞的排放。与低HDL相关的心血管病的一个实例是丹尼尔病(TD)，这是一种罕见的遗传疾病，特征为循环HDL近乎或完全缺乏。除近乎为零的HDL水平外，TD患者的另一特征是胆固醇大量沉积及累积在几种组织中，包括扁桃体、淋巴结、肝、脾、胸腺、肠及神经膜细胞(Fredrickson，D.S.，J.Clin InvesL.43，228-236(1964)；Assmann等人，The Metabolic Basisofinherited Dis ease，(Mcraw-Hill，New York，1995))。尽管此前未鉴定出该细胞机制，但是近来的研究表明，TD患者的细胞有着脂蛋白介导的胆固醇及磷脂清除途径的缺陷(Remaley等人，Arterioscier.Thromb.Vasc.BioL，17，1813-1821(1997)；Francis等人，1C1b～Im～es.，96，78-87(1995)；Rogler等人，Arten.oscle Thnomb.Vasc.BioL，15，683-690(1995))。这些结果导致这样的观点TD患者中HDL的严重缺陷是由于新生apo A-I无法获得脂类。因为新生的HDL无法成熟为富含脂的颗粒，因而就被快速代谢并清除出血浆，导致循环HDL水平近乎为零(Rem aley，supra(1997)；Francis，supra(1995)；Horowitz等人，)Clin.hivest.，91，1743-1752(1993)；Schaefer等人，i Lip.Res.，22217-228(1981))。其他与严重早期动脉粥样硬化及起因于HDL-胆固醇水平降低的冠心病高度危险相关的疾病是低α脂蛋白血症及家族性HDL缺陷综合征(FHA)。患有这些疾病的病人通常具有正常水平的LDL-胆固醇及甘油三酯。此外，糖尿病、酒精中毒、甲状腺机能减退、肝病以及高血压等疾病也能导致血浆HDL-胆固醇水平的降低，尽管这些疾病中多数也还伴有LDL-胆固醇及甘油三酯水平的升高。目前，冠心病的治疗主要集中在饮食操控和/或旨在通过抑制LDL分泌及促进LDL更新来降低LDL-胆固醇血浆水平的药物治疗。纤维酸(fibric acid)的衍生物，例如clofibrate、gemfibrozil和fenofibrate，能够通过活化脂蛋白脂酶促进VLDL的快速更新。烟酸可以通过抑制肝VLDL分泌降低VLDL和LDL的血浆水平。此外，HMG-CoaA还原酶抑制剂，例如mevinolin、mevastatin、pravastatin、simvastatin、fluvastatin、和lovastatin通过抑制胆固醇的胞内合成来降低血浆LDL水平，从而增加了LDL的细胞摄入量。此外，胆酸-结合树脂，例如cholestyrine、colestipol和probucol通过增加肝中LDL-胆固醇的代谢来降低LDL-胆固醇的水平。
但是，这些治疗方法多数具有低效和/或可能妨碍长期使用的副作用。例如，使用HMG-CoaA还原酶抑制剂会带来严重的的毒性，因为其会抑制甲羟戊酸的合成，而该物质是除胆固醇外其他重要类异戊二烯化合物合成必不可少的。另外，吉非贝齐和烟酸具有严重的副作用，包括肾损伤、肌病、肌球蛋白尿和难以忍受的皮肤发红及瘙痒。此外，普罗布考在治疗冠心病中的作用还不确定，这是由于使用它降低LDL-胆固醇的同时会带来导致HDL-胆固醇水平更低的副作用。
另外，治疗已经离析且具有低HDL-胆固醇水平的患者会带来特别困难的治疗难题。例如即使TD病患者的LDL-胆固醇已经降低了约50％，他们还是在心血管疾病发生上增加了4-6倍。尽管有证据显示吉非贝齐和烟酸可以同时增加HDL，但是通常，由于HDL水平的降低，旨在降低血浆LDL胆固醇水平的治疗对于患有冠心病的丹尼尔患者来说不起作用。类似地，低α脂蛋白血症、家族性HDL缺陷综合征、或者其他低水平HDL引发的心血管疾病都不会从旨在降低血浆LDL的治疗方法中获益。
与当前心血管疾病治疗相关的问题部分起因于对胆固醇出入细胞的运动过程还没有完全理解。另外，在胆固醇运动中其作用的蛋白质也还未完全认知。因此，仍有必要对胆固醇细胞生物学以及用于治疗心血管疾病及其他高胆固醇血症相关疾病的新方法做进一步的理解。此外，还有必要发展一种新方法，用于诊断心血管疾病以及用来筛查心血管疾病高危人群的新方法。
涉及胆固醇运输的基因及蛋白的鉴定可以用来开发用于治疗心脏病及其他高胆固醇血症和动脉粥样硬化的药物。此外，这类基因的鉴定还有助于开发筛选方法，筛选出可调控胆固醇运输相关基因表达的化合物。这类调控化合物的鉴定还有助于其他治疗药物的开发。另外，参与胆固醇运输的基因及蛋白的鉴定还可以用作心血管疾病及其他高胆固醇血症相关疾病的诊断指示剂。


本发明提供了参与胆固醇排放的新的多肽及多核苷酸。具体而言，本发明提供了新的ATP-结合框(ABC1)多肽及编码ABC1多肽新的多核苷酸。术语“ABC1”和““ABCA1”为同一ATP-结合框蛋白及基因的别称。本发明还提供了ABC1多肽、多肽片段及多态变体。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种包括SEQ ID NO2的分离多肽。另一个优选实施方案中，本发明提供了一种分离多态，其氨基酸序列与SEQ IDNO2有至少98％的同源性。本发明还提供了来自丹尼尔疾病患者的ABC1多肽。一个优选实施方案中，本发明提供了一种包括SEQ ID NO8的分离多肽。另一个优选实施方案中，本发明提供了一种包括SEQ ID NO10的分离多肽。
此外，本发明还提供了ABC1多核苷酸、多核苷酸片段、以及多核苷酸变体。在一个优选实施方案中，本发明提供了编码包括SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸。另一优选实施方案中，本发明提供了编码包括与SEQID NO2至少98同源的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。另外，另一个优选实施方案中，本发明提供了一分离多核苷酸，其中包括与编码包括SEQ IDNO2的多肽的多核苷酸互补的核苷酸序列，或者另一分离多核苷酸，其中包括与编码多肽的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述多肽含有与SEQID NO2至少98％同源的氨基酸序列。
另一优选实施方案中，本发明还提供了一包括SEQ ID NO1的分离ABC1多核苷酸。另一优选实施方案中，本发明提供包括SEQ ID NO1中第291-7074位核苷酸的分离多核苷酸。另一优选实施方案中，本发明提供了包括与SEQ ID NO1至少90％同源的核苷酸序列的多核苷酸。更优选地，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO1至少95％同源的核苷酸序列。另一优选实施方案中，所述多核苷酸包括与SEQ ID NO1至少96％、97％、98％或99％同源的核苷酸序列。另外，其他优选实施方案中，本发明提供了具有下述特征的分离多核苷酸其中包括与含SEQ ID NO1的多核苷酸互补的核苷酸序列、其中包括与含SEQ ID NO1中第291-7074位核苷酸的多核苷酸互补的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO1至少90％同源的核苷酸序列的多核苷酸互补。
本发明还提供了与ABC1基因5′端侧翼区对应的ABC1多核苷酸。一个优选实施方案中，本发明提供了一包括SEQ ID NO3的分离多核苷酸。另一实施方案中，本发明提供了含有SEQ ID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532核苷酸的分离多核苷酸。优选地，包括SEQ ID NO3中第1394-1532位核苷酸的多核苷酸。另一优选实施方案中，本发明提供了即能在严格条件下与含SEQ ID NO3的多核苷酸杂交的分离多核苷酸。另外，其他优选实施方案中，本发明提供了具有下述特征的多核苷酸即能在严格条件下与含SEQ ID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532的核苷酸的多核苷酸杂交。本发明的另一优选实施方案中，提供了包括与含SEQ ID NO3的多核苷酸至少80％同源的分离多核苷酸。更优选地，所述多核苷酸与含SEQ IDNO3的多核苷酸至少90％同源。甚至更优选，与含SEQ ID NO3的多核苷酸至少95％同源。另外的优选实施方案中，本发明提供了与含SEQ IDNO3第1-1532，1080-1643，181-1643，1292-1643，或1394-1532核苷酸的多核苷酸至少80％同源的分离多核苷酸。更优选地，所述多核苷酸与含SEQ ID NO3第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532核苷酸的多核苷酸至少90％同源，甚至更优选地，所述多核苷酸与含SEQID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532核苷酸的多核苷酸至少95％同源。此外，本发明提供了包括与上述ABC15′侧翼区互补的核苷酸序列的多核苷酸。一个优选实施方案中，本发明提供了一分离的多核苷酸，其中包括与含SEQ ID NO3多核苷酸互补的核苷酸序列。另一优选实施方案中，本发明提供了一具有下述特征的分离核苷酸即其中包括与含SEQ ID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532核苷酸的多核苷酸互补的核苷酸序列。
本发明还提供了与ABC1基因3′端侧翼区对应的ABC1多核苷酸。一个优选实施方案中，本发明提供了一包括SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQID NO6的分离多核苷酸，及其互补序列。其他优选实施方案中，本发明提供了一分离多核苷酸，其能在严格条件下与含SEQ ID NO4、SEQ IDNO5或SEQ ID NO6的分离多核苷酸杂交。另一优选实施方案中，本发明提供了与含SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的分离多核苷酸至少80％同源的多核苷酸，及其互补序列。更优选地，本发明提供了与含SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的分离多核苷酸至少90％同源的多核苷酸。甚至更优选地，本发明提供了与含SEQ ID NO4、SEQID NO5或SEQ ID NO6的分离多核苷酸至少95％同源的多核苷酸。
此外，本发明还提供了来自丹尼尔病患者的ABC1多肽。另一优选实施方案中，本发明提供了一编码含SEQ ID NO8多肽的分离多核苷酸。另一优选实施方案中，本发明提供了一包括SEQ ID NO7的分离多核苷酸。另一优选实施方案中，本发明提供了一编码含SEQ ID NO10多肽的分离多核苷酸。另一优选实施方案中，本发明提供了包括SEQ ID NO9的分离多核苷酸。本发明进一步还提供了含与上述核苷酸互补的核酸序列。
另一方面，本发明提供了包括任一上述多核苷酸和一合适载体的组合物。一优选实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中包括编码含SEQID NO2的多肽的分离多核苷酸、编码含SEQ ID NO1的多核苷酸、含SEQ ID NO1中第291-7074位核苷酸的多核苷酸、或编码含与SEQ ID NO2至少98％同源的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，以及适当载体。另一优选实施方案中，所述组合物包括一分离的多核苷酸和适当的载体，所述多核苷酸中包括与含SEQ ID NO1多核苷酸至少90％同源的核苷酸序列。其他优选实施方案中，所述组合物包括含SEQ ID NO3的分离多核苷酸，或者含SEQ ID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532位核苷酸的多核苷酸，以及适当载体。另一些优选实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中包括能在严格条件下与含SEQ ID NO3的多核苷酸杂交的多核苷酸，或包括SEQ ID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532位核苷酸的多核苷酸，以及这样的组合物，其中包括与含SEQ ID NO3的多核苷酸至少80％同源的多核苷酸，或者含SEQ ID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532位核苷酸的多核苷酸，以及适当载体。另外，本发明还提供了一种组合物，其中包括与上述任一多核苷酸互补的分离多核苷酸及适当载体。
此外，本发明还提供了其中含有任一上述ABC1多核苷酸序列的重组载体和宿主细胞。一个优选实施方案中，本发明提供了包含下列多核苷酸的重组载体编码含SEQ ID NO2多肽的分离多核苷酸、含SEQ ID NO1的分离多核苷酸、含SEQ ID NO1中的第291-7074位核苷酸的分离多核苷酸、或者编码含与SEQ ID NO2至少98％同源的氨基酸序列的多肽的分离多核苷酸。另一优选实施方案中，重组载体中含有一分离多核苷酸，该多核苷酸与含SEQ ID NO1的多核苷酸至少90％同源，更优选至少95％同源。另一优选实施方案中，所述重组载体包括含SEQ ID NO7或SEQ IDNO9的分离多核苷酸。本发明进一步还提供了包含这样的分离多核苷酸的重组载体，即该多核苷酸包括与任一上述核苷酸互补的多核苷酸。另一实施方案中，所述重组载体包括任一上述多核苷酸以及还包括一异源启动子多核苷酸。一适当的异源启动子为巨细胞病毒启动子。在一具体的优选的实施方案中，所述的重组启动子为pCEPhABC1。
本发明还提供了一种包含分离多核苷酸的重组载体，该多核苷酸包含ABC15′侧翼区。一个优选实施方案中，本发明提供了包含这样的分离多核苷酸的重组载体，该分离多核苷酸包括SEQ ID NO3或者包括SEQ IDNO3中的第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532位核苷酸。其他实施方案中，本发明提供了包含这样的多核苷酸的重组载体，即该多核苷酸能在严格条件下与含SEQ ID NO3的多核苷酸杂交，或者该多核苷酸中包括SEQ ID NO3中的第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，或1394-1532位核苷酸，以及这样的重组载体，其中包括与这些多核苷酸至少80％同源的多核苷酸。本发明还包含这样的多核苷酸的重组载体，即该多核苷酸包括与上述任一多核苷酸互补的核苷酸序列。另一优选实施方案中，所述重组载体包括任一上述多核苷酸以及进一步包括至少一编码异源多肽的多核苷酸。合适的异源多肽包括荧光素酶、半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶转移酶、以及绿色荧光蛋白。优选地，该异源多肽为荧光素酶蛋白。在一具体优选的实施方案中，重组载体为pAPR1。
另外，本发明还提供了含有任一上述重组载体的宿主细胞。本发明还提供了含任一上述重组载体及适当载体的组合物。
本发明还提供了在哺乳动物宿主细胞中制备ABC1蛋白的方法以及在哺乳动物受试者体内表达ABC1蛋白的方法。所述在哺乳动物宿主细胞中制备ABC1蛋白的方法包括下述步骤(a)用含有编码ABC1的多核苷酸的重组表达载体转染哺乳动物宿主细胞，其中多核苷酸的量足以产生可检测水平的ABC1蛋白，以及(b)纯化产生的ABC1蛋白。所述在哺乳动物受试者体内表达ABC1蛋白的方法包括下述步骤向哺乳动物受试者施用含编码ABC1多核苷酸的重组载体，其中所述多核苷酸的量足以在哺乳动物受试者体内表达ABC1蛋白。
此外，本发明还提供了用于增加哺乳动物受试者细胞胆固醇排放量的组合物和方法。一个优选实施方案中，所述方法包括向哺乳动物受试者施用含编码ABC1的多核苷酸的表达载体，其中多核苷酸的量足以增加细胞的胆固醇排放量。合适的重组载体包括含有下述分离多核苷酸的载体编码含SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸、含SEQ ID NO1的多核苷酸、含SEQ ID NO1中第291-7074位核苷酸的分离多核苷酸、编码含包括与SEQID NO2至少98％同源的氨基酸序列的多肽的分离多核苷酸。优选的表达载体包括病毒载体、具体为腺病毒载体和慢病毒载体。其他实施方案中，本发明提供了非病毒递送系统，包括DNA-配体复合体、腺病毒-配体-DNA复合体、DNA直接注射、CaPO4沉淀、基因枪技术、电穿孔、脂质体和脂质转染法。
在另一优选实施方案中，提供了用于增加哺乳动物受试者细胞胆固醇排放量的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗量的化合物，该化合物能增强细胞内ABC1的表达。一种适当的方法包括向哺乳动物受试者施用cAMP类似物。适当的cAMP类似物包括8-溴cAMP、N6-苯甲酰基cAMP、及8-硫代甲基cAMP。另一适当的方法包括向哺乳动物受试者施用可增加cAMP合成的化合物，例如弗司扣林。另一合适的方法包括向哺乳动物受试者施用可抑制cAMP降解的化合物，例如磷酸二酯酶抑制剂。合适的磷酸二酯酶抑制剂包括咯利普兰、茶叶碱、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、R020-1724、长春西汀、扎普司特、双嘧达莫、米力农、氨力农、pimobendan、西浩酰胺、依诺昔酮、潘乐新针、和维司力农。
此外，另一适于增加哺乳动物受试者细胞胆固醇排放量的方法包括向受试者施用至少一种核受体的配体，其用量足以增加胆固醇的排放量。适当的配体包括LXR、RXR、FXR、SXR和PPAR受体的配体。一个优选的实施方案中，该方法包括向哺乳动物受试者施用LXR核受体的配体。适当的LXR配体包括20(S)羟基胆固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-羟基胆固醇和24(S)，25环氧胆固醇。优选地，所述LXR配体为20(S)羟基胆固醇。另一优选的实施方案中，所述方法包括向哺乳动物受试者施用RXR核受体的配体。合适的RXR配体包括9-顺式视黄酸、维生素A醇、视黄醛、所有反式视黄酸、13-顺式视黄酸、阿维acitretin、fenretinide、阿维A酯、CD 495、CD564、TTNN、TTNNPB、TTAB、和LGD 1069。所述RXR配体优选为9-顺式视黄酸。另一优选的实施方案中，所述方法包括向哺乳动物受试者施用PPAR核受体的配体。一合适的配体选自噻唑烷二酮。另一优选的实施方案中，所述方法包括施用至少两种核受体的配体。在一个具体的优选实施方案中，所述配体为20(S)羟基胆固醇和9-顺式视黄酸。
此外，另一适于哺乳动物受试者细胞胆固醇排放量的方法包括向哺乳动物受试者施用类二十烷酸，其用量足以增加胆固醇的排放量。合适的类二十烷酸包括前列腺素E2、前列腺素J2、和前列腺环素(前列腺素12)。
另一实施方案中，本发明提供了用于增加哺乳动物受试者细胞胆固醇排放量的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用可增强ABC1活性的化合物，其用量足以增加细胞的胆固醇排放量。
本发明还提供了适于增加哺乳动物受试者ABC1基因表达的方法。一个优选实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用至少一种核受体的配体，其用量足以增加哺乳动物受试者ABC1基因的表达。合适的配体包括LXR、RXR、FXR、SXR和PPAR受体的配体。另一优选实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用cAMP类似物，其用量足以增加ABC1的基因表达。另一优选实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用可增加cAMP合成的化合物，其用量足以增加ABC1的基因表达。
此外，本发明还提供了一种用于筛选待测化合物是否具有ABC1表达调控活性的方法，该包括下列步骤(a)可操作地将一报道cDNA与哺乳动物ABC1基因表达调控部分连接生成一重组的报道构建体；(b)将所述重组报道构建体转染入宿主细胞群；(c)测定宿主细胞样本中的报道基因表达水平；(d)将所述宿主细胞与所筛选的待测化合物接触；(e)在接触待测化合物后，测定宿主细胞样本中的报道基因表达水平；以及(f)比较暴露待测化合物后引发的报道基因表达的相对改变，从而测定出所述的ABC1表达调控活性。所述的重组报道构建体包括可操作地连接到哺乳动物ABC1基因表达调控部分的报道基因，例如本发明提供的任一ABC15′侧翼区序列。一个优选实施方案中，所述的ABC1基因表达调控部分包括SEQ ID NO3。另一优选的实施方案中，所述的ABC1基因表达调控部分包括SEQ ID NO3中的第1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643、1394-1643，或1394-1532位核苷酸。合适的报道cDNAs包括荧光素酶、p-半乳糖苷酶、氯霉素和绿色萤光蛋白cDNA。所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞。在该方法的一个具体的优选实施方案中，所述的重组报道构建体为为pAPR1。
另外，本发明还提供了筛选待测化合物测定其是否能促进培养物细胞的ABC1-介导胆固醇排出量的方法，该方法包括(a)测定培养物中哺乳动物细胞样本的胆固醇排出水平以测定胆固醇排出的调控水平；(b)将所筛选的待测化合物与所述细胞接触；(c)测定接触待测化合物后细胞样本的胆固醇排放水平(d)测定接触待测化合物后细胞样本的ABC1-介导胆固醇排放水平，从而测定出该待测化合物是否能促进细胞培养物的ABC1-介导的胆固醇排放。上述细胞可以来自原代培养细胞或细胞系。合适的细胞系包括成纤维细胞、巨噬细胞、肝及肠细胞系。所述细胞系优选为RAW264.7。一个优选的实施方案中，用抗-ABC1抗体测定ABC1-介导的胆固醇排放，在与ABC1结合时该抗体能抑制其活性。另一优选实施方案中，用反义ABC1多核苷酸测定ABC1-介导的胆固醇排放。一个具体的优选实施方案中，所述反义多核苷酸含有SEQ ID NO57。
此外，本发明还提供了检测哺乳动物受试者细胞中ABC1相对表达水平的方法。这类方法可用来测定受试者的冠心病易感程度。一种用于检测哺乳动物受试者细胞中ABC1相对表达水平的方法，该方法包括(a)从哺乳动物受试者获得细胞样本，(b)测定该细胞样本中ABC1 mRNA表达水平；以及(c)将细胞的ABC1 mRNA表达水平与预定的ABC1 mRNA表达标准水平进行比较，从而检测出哺乳动物收受者细胞中ABC1基因表达的相对水平。适于测量ABC1 mRNA表达水平的方法包括，例如RT-PCR、RNA印迹法、以及RNAse保护测定。
本发明还提供了检测哺乳动物受试者细胞中ABC1蛋白的相对表达水平的方法。这类方法可用来测定受试者的冠心病易感程度。一种用于检测哺乳动物受试者细胞中ABC1蛋白的相对表达水平的方法。该方法包括(a)从哺乳动物受试者获得细胞样本，(b)测定该细胞样本中ABC1蛋白的表达水平；以及(c)将细胞样本ABC1蛋白的表达水平与预定的ABC1蛋白标准量进行比较，从而检测出哺乳动物受试者者细胞中ABC1蛋白的相对水平。本领域现有的各种免疫测定方法都可以用来测定ABC1蛋白的量。例如，ABC1蛋白量可以通过下述步骤测定(a)将一系列抗-ABC1抗体与细胞样本接触以及(b)检测ABC1抗体与该样本的结合。适于检测ABC1抗体的方法包括western印迹、免疫沉淀反应、及FACS。
另一方面，本发明提供了能特异性结合上述ABC1多肽的抗体。一个优选实施方案中，本发明提供了一种能够与含SEQ ID NO2的分离多核苷酸特异性结合的分离抗体。另一个优选实施方案中，本发明提供了一利可与分离多肽特异性结合的抗体，所述分离多肽包含与SEQ ID NO2至少98％同源的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体或者也可以是多克隆抗体。另一实施方案中，当所述抗体与ABC1多肽结合时，可抑制该ABC1多肽的胆固醇运输活性。
此外，本发明还提供了适于筛选化合物测定该化合物的ABC1表达调控活性的试剂盒，其中包括一可操作连接到哺乳动物ABC1基因表达调控部分的报道cDNA以及使用说明书，所述cDNA的量足以完成至少一次测定。一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测报道基因的工具。另一优选实施方案中，哺乳动物ABC1基因表达调控部分包括SEQ ID NO3。另一优选实施方案中，所述哺乳动物ABC1基因表达调控部分包括SEQID NO3中的第1-1532、1080-1643、1181-1643、1292-1643、1394-1643或1394-1532位核苷酸。合适的报道cDNAs包括荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶转移酶、以及绿色荧光蛋白cDNA。优选地，所述报道cDNA为荧光素酶蛋白。在一具体优选的实施方案中，所述的重组报道构建体为pAPR1。
本发明还提供了适于筛选化合物测定该化合物是否能调控ABC1-依赖性胆固醇排放的试剂盒。一个优选实施方案中，所述试剂盒包括一灭活的抗-ABC1抗体以及使用说明书，所述抗体的含量足以完成至少一次测定。另一个优选实施方案中，所述试剂盒包括反义ABC1寡核苷酸以及使用说明书，所述寡核苷酸的含量足以完成至少一次测定。一个具体的优选实施方案中，所述的反义ABC1寡核苷酸包括SEQ ID NO53。
本发明所述的系列证据表明ABC1是胞内胆固醇存储的载脂蛋白-介导代谢的枢纽蛋白。首先，本发明的研究显示ABC1在丹尼尔病中是缺陷性的，丹尼尔病是一种以HDL-胆固醇代谢异常为特征的遗传病。如前所述，以及本发明的实施例1，丹尼尔病的基因缺陷导致载脂蛋白介导的胆固醇排放出细胞的途径缺失，从而导致胆固醇排放活动显著减少及HDL-胆固醇水平降低(Oram等人，J.Lipid Res.，372743-2491(1996)；Francis等人，J.Clin.Invest.，9678-87(1995))。患有丹尼尔病的家族的遗传连锁分析将缺陷基因分配到染色体9q31的间隔部位(Rust等人，NatureGenetics，2096-98(1998))。公共数据库检索发现ABC1定位于染色体9q22-9q31，这比Rust等人中公开的间隔部位更宽，但是包括Rust等人中公开的间隔部位(Luciani等人，supra(1994))。以这些数据为基础，制作了人ABC1基因的辐射杂合图谱(radiation hybrid mapping)，该图谱将该基因置于两个marker之间，所述两marker成直角地位于Rust等人报道的人染色体9q31的7-cM区域内。此外，如实施例2所示，微排列分析显示，丹尼尔患者细胞内ABC1基因的表达量在正常细胞的2.5倍以下。这些研究将丹尼尔病中的该缺陷基因鉴定为ABC1。此外，本发明进一步研究将ABC1活性与胆固醇排放活动联系了起来。首先，研究表明ABC1运输活性的抑制剂，例如4，4-diisothiocyanostilbene acid(DIDS)和sulphobromophtaleine(BSP)，也抑制成纤维细胞的apoAI-介导胆固醇排放(见实施例6)。另外，用反义ABC1寡核苷酸抑制ABC1基因表达也显示能够抑制成纤维细胞的apoAI-介导胆固醇排放(见实施例7)。相反，将ABC1基因转染入鼠单核细胞的转染试验表明ABC1的过量表达导致apoAI-介导排放的增加(实施例8)。最后，用野生型和丹尼尔患者mRNA进行的RT-PCR表明正常的皮肤成纤维细胞中ABC1 mRNA的表达受与胆固醇排放相关的细胞条件的调控，但是在丹尼尔患者的成纤维细胞中这种调控不存在(实施例9)。这些发现确证了ABC1在胆固醇排放中发挥着主要的作用。
可以得出这样的结论ABC1在胞内胆固醇向胞膜的外周小叶易位的过程发挥作用。由于ABC1缺乏或缺陷性ABC1导致的胞内胆固醇运输缺陷会引发特定膜结构域内胆固醇的缺乏，该结构域与apoAI和其他载脂蛋白特异性相互作用(Stangl等人，J.Biol.Chem.，27331002-31008(1998)；Babitt等人，J.Biol.Chem.，27213242-13249(1997)))。胆固醇无法递送到apoAI导致生成胆固醇-缺陷的HDL颗粒，这样的颗粒被迅速清除出胞浆(Bojanovski等人，J.Clin.Invest.，801742-1747(1987))。
定义提供下列定义是为了有助于本说明书全文使用的某些术语的理解。
在本发明中，“分离”是指物质离开初始环境(例如，如果是天然生成即为自然环境)，从而“可操作”地改变了其天然状态。例如，分离的多核苷酸可以是载体或组合物的一部分，或者可以取自细胞，并且仍然是“分离”，因为载体、组合物或具体细胞都并非该多核苷酸的初始环境。
本发明中使用的“多核苷酸”包括合成和天然来源的DNA和RNA。所述多核苷酸可以以单链-、双链-DNA或RNA、或者RNA/DNA杂合体的形式存在。因此，本发明所述的多核苷酸可由任一聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者修饰后的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由下述成分组成单链及双链DNA，包括单链和双链区域、或单链、双链和三链区域的DNA混合体，单链及双链RNA，包括单链和双链区域的RNA混合体，包括DNA和RNA的杂合分子，该DNA和RNA可以是单链或更常见为双链或三链或者单链和双链区域的混合。此外，所述多核苷酸可以由包含RNA或DNA或这二者的三链区域组成。为了稳定或其他原因，多核苷酸可以包括一个或多个修饰后的碱基或者修饰后的DNA或RNA骨架。“修饰后的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基及次黄嘌呤核甙等非常见碱基。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因而，“多核苷酸”包括多核苷酸的化学、酶学或代谢性修饰形式。“多核苷酸”还可包括通常称为寡核苷酸的短的多核苷酸。
“多肽”一词是指包括相互间通过肽键或修饰后肽键相连的两个或多个氨基酸。“多肽”是指通常称为肽的短氨基酸序列以及通常称为蛋白质的长氨基酸序列。多肽可以包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。另外，多肽的修饰可以通过天然过程、例如处理及其他翻译后修饰，或者通过本领域已知的化学修饰技术来实现。一种给定的多肽可以包括多种类型的修饰。另外，同种类型的修饰可以在多肽的一个或多个位点以同等或不同程度出现。修饰可以发生在多肽的任一部分，包括多肽骨架、氨基酸侧链、以及氨基或羧基端。修饰包括，但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、达夫反应甲酰化、γ-羧基化、糖基化、羟基化、碘化、甲基化、myristoylation、氧化、磷酸化、prenylation、硫酸化和selenoylation，以及核苷酸或核苷酸衍生物、脂类和脂类衍生物，或者phosphotidylinositol的共价连接。其他修饰包括交联、环化、生成pyroglutamate、生成GPI锚定、蛋白水解、外消旋作用、和t-RNA-介导的氨基酸添加，例如精氨酸化及泛素化。参见，例如，蛋白质-结构及分子特性，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freedman and Co.，New York(1993)；Wold，F.，翻译后蛋白修饰透视和展望，蛋白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter等人，Meth.Enzymol.，182626646(1990)；and Rattan等人，蛋白合成翻译后修饰及老化，Ann.N.Y.Acad.Sci.，66348-62(1992)).本发明所述多肽可以任一合适的方法制备。这类多肽可以包括分离后的天然生成多肽、重组制备的多肽、合成多肽、或者这些方法联用制备的多肽。制备这类多肽的方法已为本领域技术人员熟知。
本发明中的“多核苷酸”还可包括在严格条件下能够与SEQ ID NO3或SEQ ID NO3中第1-1532，1080-1643，1181-1643，1292-1643，1394-1643，或1394-1532位核苷酸杂交的多核苷酸或其互补链。本发明所述多肽还包括能够在严格条件下与SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6杂交的多核苷酸，或其互补链。
“严格条件”是指在下述溶液中42℃孵育过夜，该溶液中包括50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt′s溶液、10％dextran sulfate和20μg/ml变性剪切鲑鱼精DNA，然后在约65℃下用0.1×SSC洗涤滤膜。
本发明使用的“互补”是指核苷酸间的杂合或碱基配对，例如双链多核苷酸的两条链之间或者寡核苷酸引物与待扩增或待测序的单链多核苷酸之间。当通过适当核苷酸插入、缺失或取代使两个单链核苷酸分子实现最大限度对齐时，如果其中一条链上的核苷酸可与另一条链上的约80％的核苷酸配对，那么就可以认为这两个核苷酸分子是互补的。
“同源性”在本领域中是指两个或多个多肽序列之间或者两个或多个多核苷酸序列之间的相互关系，通过比较两序列测定而出。
“同源性”或“相似性“还有本领域技术人员认可含义，即指多肽或多核苷酸序列之间的相关程度，通过将所述序列的链配对测定出来。″同源性″和”“相似性″可以用大量众所周知的方法测算出来，其中包括下列文献中公开的方法计算分子生物学，Lesk，A.M.，ed.，Oxford UniversityPress，New York，(1988)；生物计算信息学及基因组计划，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，(1993)；序列数据的电脑分析，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，(1994)；分子生物学序列分析，von Heinje，G.，Academic Press，(1987)；和引物序列分析，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，(1991)；以及Carillo，H.，and Lipton，D.，SIAM J Applied Math481073(1988))。测定两序列间同源性或相似性的常用方法包括但不限于下述文献中公开的方法″巨型计算机导论，″Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego，(1994)，and Carillo，H.，and Lipton，D.，SIAM J Applied Math 481073(1988)。测定同源性的优选方法是为待测序列间最大匹配而设计的。用于多核苷酸或多肽对齐的方法被编制成电脑程序，其中包括GCG程序包(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research(1984)12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215403(1990)、Bestfit程序(Wisconsin序列分析包、Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711(using the local homology algorithmof Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981)).
例如，当用任一序列对齐程序测定具体序列是否90％同源于参照序列，建立参数以便计算出参照多肽或多核苷酸全序列的相同百分比，允许参照多核苷酸中核苷酸总数10％同源性缺口。
用于测定查询序列(本发明所述序列)和主题序列之间最大程度匹配的优选方法，也称整体序列对齐，可以用以Brutlag等人(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))中算法为基础的FASTDB电脑程序测定。“序列”一词包括核苷酸和氨基酸序列。在序列对齐中，查询序列和主题序列要么都是核苷酸序列要么都是氨基酸序列。上述整体序列对齐的结果为同源性百分比。用FASTDB查究DNA序列计算同源性百分比使用的优选参数为Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization Group Length＝0，及Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，GapSize Penalty 0.05，以及Window Size＝500或核苷酸碱基中的查询序列长度，无论那个较短。氨基酸对齐中计算同源性及类似性百分比使用的参数为Matrix＝PAM 150，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，JoiningPenalty＝20.Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，GapPenalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05.及Window Size＝500or氨基酸残基中的查询序列长度，无论那个较短。
试举一例，核苷酸序列与SEQ ID NO1中所含序列至少90％“同源”的多核苷酸是指，除了在每总长100个核苷酸中至多可允许10个点突变外，该多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO1中包含的序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与SEQ ID NO1至少90％同源的多核苷酸，至多允许SEQ ID NO1所含序列核苷酸的10％被缺失、插入或被其他核苷酸取代。这些改变可以发生在该多核苷酸的任一部位，也可以单个散布在核苷酸中或者发生在SEQ ID NO1中一个或多个连续族中。
类似地，氨基酸序列与SEQ ID NO2中所含序列至少98％“同源”的多肽是指，除了可以在每总长100个氨基酸中至多可允许2个点突变外，该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO2中包含的序列相同。换句话说，为了获得氨基酸序列与SEQ ID NO2至少98％同源的多肽，至多允许SEQ IDNO2中所含氨基酸残基的2％被缺失、插入或被其他核苷酸取代。这些改变可以发生在所述多肽的任一部位，也可以单个散布在残基中或者发生在SEQ ID NO2中一个或多个连续族中。
“具有生物活性的多肽”是指该多肽活性与本发明所述多肽活性(例如胆固醇运输活性)类似，但不必相同，可用一特定生物学测定试验测算，具有或无剂量依赖性。当存在剂量依赖性时，与本发明所述多肽相比，就给定活性而言，多肽活性不必相同，而只需剂量依赖性地基本近似(即，侯选多肽与本发明所述多肽相比具有更强活性，或者减弱程度小于25-倍，优选地，活性减弱小于10倍，以及最优选活性减弱小于3倍)。
″多肽变体″是指虽有别于本发明所述的ABC多肽但是基本保留了其特性的多肽。通常，变体与含SEQ ID NO2的多肽整体上非常近似，甚至多个部位上相同。优选地，所述多肽变体保留了其生物活性，即胆固醇运输活性。变体包括，但不限于，拼接变体及等位突变体，以及添加、缺失及取代突变体。
类似地，″多核苷酸变体″是指虽有别于本发明所述的多核苷酸但是基本保留了其基本特征的多核苷酸。所述变体可以包括编码区域、非编码区域或者二者均有的改变。因此，例如，ABC1多核苷酸变体的核苷酸序列虽然不同于SEQ ID NO1，但是其编码的多肽仍具有胆固醇运输活性。另外，例如，一多核苷酸变体的核苷酸序列不同于SEQ ID NO3，但仍保留了启动子活性。特别有的多核苷酸变体是其中的改变仅产生沉默取代、添加或缺失而不改变其编码的多肽的特性或活性。优选由于遗传密码子简并用沉默取代中制备的核苷酸变体。另外，其中10-20个、5-10个、1-5个或1-2个氨基酸被任一组合的取代、添加或缺失的突变体也是优选的。可以因多种原因而制备多核苷酸变体，例如为适应特定宿主而优化密码子表达(例如将任mRNA中的密码子改变为大肠杆菌等细菌宿主优选的密码子)。
“等位突变体”是指这样的天然突变体，即位于生物染色体一给定座位上的基因的多个不同形式的其中之一(Genes II，Lewin，B.，编著JohnWiley & Sons，New York(1985))这些等位突变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上变化。替代地，非天然生成的变体可以用诱变技术或直接合成来制备。
术语“保守的氨基酸取代”是指用标准的氨基酸残基取代天然的氨基酸残基，以保证对该位置上的氨基酸残基的极性或电荷几乎或根本没有影响。例如，用任一非极性残基代替多肽中的一非极性残基而发生的保守性取代。保守性取代的另一实例是用另一酸性残基代替一酸性残基。保守取代产生的ABC1多肽，其功能及化学特性类似于天然生成的ABC1多肽。
“直向同源”是指与从不同种中鉴定出的多肽所对应的多肽。例如，鼠和人的ABC1多肽就可认为是直向同源。
本发明使用的“载体”是指用来将编码信息传输给宿主细胞的任一分子(例如，核酸、质粒或病毒)。
“表达载体”是指适于转化宿主细胞的载体，其中包括能够指导和/或调控所插入的异源核酸序列的表达。表达包括，但不限于，转录、翻译以及有内含子存在时的RNA拼接。
本发明使用的“转录调控区域”或“表达调控部分”是指基因的任一区域，包括但不限于启动子、增强子及阻遏物。
本发明使用的“启动子”是指位于结构基因起始密码子上游(即5′端)的非转录序列(通常约100～1000bp)，该序列可调控结构基因的转录。
本发明使用的“增强子”是指DNA的顺式-作用单元，通常长约10-300bp，它可以作用于启动子增强转录。增强子的取向和位置相对独立。它们在转录单元的5′和3′端都已发现。
“宿主细胞”是指已被转化或转染的细胞，或者能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。该术语包括亲代细胞的子代，无论子代在形态或遗传构成上与原来的亲代是否相同，只要所选基因还在就可。
本发明使用的“可操作连接”是指侧翼序列的重排，其中所述侧翼序列被装配或组装后仍能行使其常规功能。因此，操作连接到编码序列上的侧翼序列能启动编码基因的复制、转录和/或翻译。例如，当将编码序列与启动子操作连接时，所述启动子能够指导该编码序列的转录。侧翼序列不必与编码序列邻接，只要其正确发挥功能即可。因此，例如，插入的转录但非翻译序列可以位于启动子和编码序列之间，这时所述启动子序列仍可认为是″可操作连接″到编码序列上。
本发明使用的“转染”是指外来或外源DNA被细胞摄入的过程，以及当外源DNA被导入细胞膜内时就可以说一个细胞已被“转染”。大量的转染技术已为本领域技术人员所熟知。参见，例如，Graham等人，1973，Virology 52456；Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(Cold SpringHarbor Laboratories，1989)；Davis等人，分子生物学基本方法(Elsevier，1986)；and Chu等人，1981，Gene 13197。这些技术可以将一个或多个外源DNA基因导入到合适的宿主细胞中。
ABC1多肽本发明涉及新的人ABC1多肽。一个实施方案中，所述ABC1多肽包含SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。与其他人报道的人ABC1蛋白不同，SEQ ID NO2所示的ABC1多肽在氨基末端添加了另外的60个氨基酸，从而使ABC1蛋白包括2261个氨基酸而非2201个氨基酸(参见，Langmann等人in Biochem.Biophys.Res.Comm.，257，29-33(1999))。另外，SEQ IDNO2所示的ABC1多肽与其他报道过的序列有几个氨基酸残基不同。具体地，本发明SEQ ID NO2所示的ABC1多肽发生了下述氨基酸残基的取代第159位残基K取代了R，765位I取代了V，823位M取代了I，1495位I取代了T，1588位L取代了P，1914位K取代了R，以及2018位L取代了P。为了与公开出版的记数法一致，上述氨基酸数字采用Lawn等人，J.Clin.Invest.，104R25-31(1999)，而非SEQ ID NO2所示的数字。如下面进一步讨论的那样，所述的序列差异可能起因于这样一个事实前一个ABC1cDNA用以PCR为基础的策略克隆自小鼠，而随后报道的人ABC1 cDNA序列是从小鼠蛋白质序列中推导出来的。经SDS-PAGE测定，所述ABC1蛋白的分子量约为240kD。
本发明还涉及这样的ABC1多肽，其中包含的氨基酸序列优选与SEQID NO2全长氨基酸序列至少98％同源，更优选与SEQ ID NO2全长氨基酸序列至少99％同源，最优选，所述多肽与SEQ ID NO2全长氨基酸序列100％同源。如前所述，“同源性”是指多肽序列之间的序列相关程度，下文将进一步描述。
此类相关的ABC1多肽包括取代、缺失及插入变体，以及等位突变体、拼接变体、片段、衍生物或直源同系物。优选的多肽或多肽片段包括那些具有ABC1生物活性的多肽及片段。具体而言，优选能介导反向胆固醇运输活性的多肽及片段。具有改良反向胆固醇运输活性的多肽及片段也是优选的。
取代、缺失及插入变体是指包含这样氨基酸序列的ABC1多肽，即与SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列相比，所述氨基酸序列中包含一处或多处氨基酸序列的取代、缺失和/或添加。优选实施方案中，所述变体有约1～5、或约1～10、或约1～20、或约1～40、或约1～65个氨基酸的取代、添加和/或缺失。例如，所述变体可以在多肽的任一部位以及羧基端和/或氨基端添加1个或多个氨基酸残基，只要所述变体仍保留生物功能即可。另外，例如，可以从包括羧基端或/或氨基端在内的多肽任一区域缺失1个或多个氨基酸，而生物功能基本保留(Ron等人，J.Biol.Chem.，2682984-29842988(1993)，Dobeli等人，J.Biotechnology，7199-216(1988))。氨基酸取代可以是保守性的，也可以是非保守性的，或者二者任一组合，只要ABC1保留其生物活性即可。此外，所述取代也可以用非保守性氨基酸残基，所取代残基可以是也可以不是遗传密码子编码的氨基酸，另外也可用带有取代基团的氨基酸残基。
ABC1多肽的合适变体可以用众所周知的技术来测定。例如，可以通过鉴定ABC1分子中的可改变但不破坏其生物活性的区域对合适的ABC1变体进行测定。另外，如本领域认可的那样，甚至对于生物活性或结构而言特别重要的区域也可进行保守性的氨基酸取代，而不会破坏其生物活性或者给多肽结构带来不良影响。通过鉴定ABC1多肽中的那些区域对于其活性而言是无关紧要的，就可以测定出可改变而不破坏生物活性的氨基酸残基。(Bowie等人，Science，2471306-1310(1990))。例如，通过比较来自不同物种的ABC1多肽，可以测定出ABC1分子的种间保守的氨基酸残基及区域。保守的氨基酸残基可能对于生物功能和/或结构而言是重要的。反过来讲，对于ABC1分子中种间非保守因而被自然选择容许的区域而言，其中的改变几乎不可能会影响生物活性和/或结构。因此，非保守区域内发生了添加、缺失或取代的ABC1多肽应该是合适的变体。甚至在相对保守的区域内，可用化学上近似的氨基酸取代天然生成残基而保留活性。
此外，可以通过下述方法鉴定出合适的ABC1变体用结构-功能试验测定出ATP-结合框家族其他成员，例如ABCR和ABC-C中对于活性或结构而言重要的残基。这类试验可以通过与其他ATP-结合框蛋白中对于活性或结构而言重要的氨基酸残基对应的方式，预测出ABC1变体中的重要氨基酸残基。例如，在其他ATP-结合框蛋白的结构-功能试验的基础上，能够在与核苷酸结合及胆固醇运输相关的区域内发现ABC1中的重要氨基酸残基。合适的变体包括，例如，其中用上述方法预测到的ABC1多肽中重要氨基酸残基被化学上类似氨基酸取代的多肽。
合适的ABC1变体也可以用下述方法测定为了鉴定出对于多肽功能至关紧要的区域，用基因工程技术在特定位置导入氨基酸改变。氨基酸改变可以用例如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变方法实现(Cunningham等人，Science，2441081-1085(1989))。然后用例如任一本发明上述胆固醇排放测定试验，对得到的ABC1变体的生物学活性进行测试。特定氨基酸残基取代破坏了胆固醇排放活性，这样的变体不是合适的ABC1变体。
其他鉴定合适变体的方法也为本领域已知。另外，本领域技术人员应当能识别出蛋白特定氨基酸位置上可容许的氨基酸改变(Bowie等人，supra(1990))。例如，通常已知大部分被包埋或内部(位于蛋白的三级结构内)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面或外部侧链通常极少有此特征。而且，已知容许的保守氨基酸取代包括下列取代脂肪族或疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的取代、羟基残基Ser和Thr的取代、酸性残基Asp和Glu的取代、酰胺残基Asn和Gln的取代、碱性残基Lys、Arg和His的取代、芳香族残基Phe、Tyr和Trp的取代以及小型氨基酸Ala、Ser、Thr、Met及Gly的取代。
ABC1变体可以天然生成或者人工构建。天然生成的变体的实例有等位突变体和拼接变体。等位突变体是指即位于生物体或生物群染色体一给定座位上的基因的多种不同形式的其中之一(Lewin，B.，ed.，Genes II，John Wiley & Sons，New York(1985))。等位突变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上变化。拼接变体是指一核酸分子，通常为RNA，通过对RNA转录本或相应多肽中内含子序列进行选择性处理而生成的。或者，可以人工构建ABC1变体。例如，可以用定点诱变技术构建ABC1变体。另外，例如，ABC1变体也可以从编码所述变体的相应核酸分子制备得到，该变体的DNA序列从SEQ ID NO1所示的野生型DNA序列变化而来的。
多肽片段是指其氨基酸序列短于SEQ ID NO2所示的氨基酸全序列。优选的多肽片段包括具有ABC1生物活性的片段。具体而言，是那些介导反向胆固醇运输或者具有改良反向胆固醇运输活性的片段也是优选的。ABC1片段可以是所述多肽任一区域缺失1个或多个氨基酸而得到的，包括羧基端和/或氨基端，只要生物功能保持不变。ABC1多肽片段可以天然生成，例如通过选择性拼接或体内蛋白酶活性，或者用已知方法人工构建。
本发明还涉及ABC1多肽衍生物，所述衍生物是指本发明所述的化学方法修饰得到的ABC1多肽、变体、或片段。所述衍生物是用不同于天然生成ABC1多肽的方式制备而成的，即与该多肽结合的分子的类型或部位不同。衍生物还可以包括通过天然连接到ABC1多肽上的1个或多个基团缺失形成的多肽。此外，可以将包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的ABC1多肽，以及上述的ABC1变体和片段，与同源多肽融合生成同源二聚体，或者与一异源多肽融合生成异源二聚体。
本发明的另一方面涉及突变的ABC1多肽及其片段，对应于分离自丹尼尔患者的多肽。在一个优选实施方案中，所述ABC1多肽包含SEQ IDNO8。从丹尼尔患者(TD1)分离出该蛋白质，并按照实施例1和5所述测序。SEQ ID NO8所示氨基酸序列与野生型序列相似，不同之处为第537位(残基序号同文献Lawn等人，J.Clin.Invest.，104r25-31(1999)，对应于SEQ ID NO8中的第597位)上的谷氨酰胺取代成为精氨酸。该残基位于氨基末端亲水结构域内，靠近第1个推测的跨膜结构域。所述取代改变了该蛋白所述区域的氨基酸的电荷，生成的ABC1蛋白其胆固醇排放活性明显减弱，如

图1所示。
另一个优选实施方案中，所述ABC1多肽包含SEQ ID NO10。从丹尼尔患者(TD2)分离出该蛋白质，并按照实施例1和5所述测序。SEQ ID NO10所示氨基酸序列与野生型序列相似，不同之处为第527位(残基序号同文献Lawn等人，sufi-a(1999)，对应于SEQ ID NO10中的第587位)上的色氨酸被精氨酸所取代。与TD1多肽类似，该取代改变了ABC1蛋白氨基末端亲水结构域中氨基酸残基的电荷。得到的突变ABC1蛋白的胆固醇排放活性也明显减弱，如图1所示。
ABC1多核苷酸本发明另一方面涉及到分离的编码新的ABC1多肽的多核苷酸和其变体。例如，本发明提供分离的编码全长的ABC1多肽的多核苷酸，包含野生型ABC1全长的cDNA的多核苷酸、包含全长的野生型ABC1的编码序列，和包含ABC1的非编码5′和3′序列的多核苷酸，以及有关ABC1变体的多核苷酸。本发明也提供分离的编码突变型ABC1多肽的多核苷酸，例如丹尼尔患者的那些。
在一项优选的实施方案中，分离的多核苷酸包括编码包含SEQ IDNO2的多肽的核苷酸序列。重要地，与Langmann等人已公开的序列(Langmann等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，257，29-33(1999)(GenBank登记号AJO12376)对照，该序列编码基于在外显子3发现的推测的起始甲硫氨酸的2201个氨基酸蛋白，目前要求保护的核苷酸序列包含50个外显子和2261个氨基酸蛋白的密码(参见图4)。本发明相应的核苷酸序列包含一种编码序列，它包括在对应于下列60个氨基末端的氨基酸的5′末端额外的180个核苷酸MACWPQLRLLLWKNLTFRRRQTCQLLLEVAWPLFIFLILISVRLSYPPYEQHECHFPNKA。
假设从此位置上游存在框内终止密码子6至9个核苷酸，最近预测起始位点是能产生连续开放阅读框架的第一甲硫氨酸密码子。这种具有相关的ABC转运蛋白序列ABCR和ABC-C(也称为ABC3)的新ABC1 cDNA的排列显示出高度的相似性，该排列亦包含额外的60个氨基酸的开放阅读框，这意味着同源的ABC转运蛋白开始于与为人ABC1建议的氨基末端延伸序列相关的序列。很可能早期公开的人ABC1起始位点是以已公开的小鼠ABC1 cDNA序列(Luciani等人，Genomics，21150-159(1994)；GenBank登记号X75926)来预测的，该序列在延伸区包含额外的核苷酸″n″，这样以致于最近公开的甲硫氨酸不在框内。然而，如果忽略小鼠序列中的″n″核苷酸，小鼠和人的延伸区序列是相同的。根据这些结果，全长人ABC1蛋白包含2261个氨基酸是很可能的，而不是如Langmann等人和其它人先前提出的2201个氨基酸。因此，Langmann等人未提出完全的人ABC1的开放阅读框架。
另一优选的实施方案中，分离的多核苷酸包括全长的ABC1 cDNA，它包含至少部分的或者非编码的5′和3′序列。优选地，这种多肽包含SEQID NO1所示的核苷酸序列。SEQ ID NO1显示的10.4kb人ABC1 cDNA序列包含6783个核苷酸加5′和3′未翻译区的开放阅读框架。起始密码子位于位置291，终止密码子位于位置7047。SEQ ID NO1表示的本发明的ABC1 cDNA在几个方面不同于已公开的ABC1 cDNA(GenBank登记号AJO12376)。首先，本发明ABC1 cDNA包括5′端额外的350核苷酸和3′端额外的3136核苷酸(不包括poly(A)尾)。本发明ABC1序列也不同于已公开的在编码区10个核苷酸取代的ABC1 cDNA。十个区别当中，7个核苷酸差异引起氨基酸变化。为了与已公开的符号保持一致，下列核苷酸和氨基酸号码是Lawn等人，J.Clin.Invest.，104R25-31(1999)和GenBank登记号AJO12376的那些，而不是SEQ ID NO1的那些。核苷酸和氨基酸变化如下(1)在核苷酸414，A替G；(2)在核苷酸596，A替G(在氨基酸159，K替R)；(3)在核苷酸705，T替C；(4)在核苷酸1980，A替C；(5)在2413，A替G(在氨基酸765，I替V)；(6)在25 89，G替A(在氨基酸823，M替I)；(7)在4604，T替C(在氨基酸1495，I替T)；(8)在4883，T替C(在氨基酸1588，L替P)；(9)在5861，A替G(在氨基酸1914，K替R)；和(10)在6443，T替C(在氨基酸2108，L替P)。这些氨基酸变化中的五种是保守的氨基酸变化并且可能表示多态性或序列错误。在两种情况下，本序列推测不同于GenBank序列的重要的氨基酸差异。差异导致在残基1588和残基2108是亮氨酸而不是脯氨酸。有趣地，在两个位置，在分析的三个TD样品中的每一个以及非常保守的小鼠ABC1蛋白序列，亦发现推测的亮氨酸。
本发明也涉及到包含核苷酸序列的ABC1多核苷酸，该核苷酸序列在它们整个长度内，优选具有与包含SEQ ID NO1的多核苷酸至少80％的同源性。更优选地，本核苷酸在其完全长度内具有与包含SEQ ID NO1的多核苷酸至少90％的同源性。甚至更优选地，多核苷酸在其整个长度内具有与包含SEQ ID NO1的多核苷酸至少95％的同源性。最优选地，多核苷酸在其整个长度内具有与包含SEQ ID NO1的多核苷酸100％的同源性。这种涉及的ABC1多核苷酸包括取代，缺失，和插入变体，以及等位变体，剪接变体，片段，衍生物，和直向同源体(orthologs)，其中已经取代、缺失、插入或衍生一个或多个核苷酸。优选的多核苷酸包括那些编码具有生物学活性的ABC1多肽和多核苷酸，例如胆固醇排放活性。
另一优选的实施方案中，分离的多核苷酸包括ABC1全部编码序列。在特别优选的实施方案中，多核苷酸包括如SEQ ID NO1的291-7074核苷酸所示的序列。这种分离的多核苷酸包含6783个核苷酸的ABC1开放阅读框架并且编码2261个氨基酸的多肽，如上所述。
又一项优选的实施方案中，分离的多核苷酸包括编码ABC1变体多肽的核苷酸序列。尤其是，分离的多核苷酸包括编码包含氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，该氨基酸序列至少98％同源于SEQ ID NO2的氨基酸序列。也优选含有编码多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸，该多肽含有与SEQ ID NO2氨基酸序列至少99％同源的氨基酸序列。因此，本发明包括那些编码上述ABC1多肽的多核苷酸，包括介绍过的取代、缺失和插入变体，以及ABC1等位变体，剪接变体，片段，衍生物，融合多肽，和直向同源体(orthologs)。优选的多核苷酸是编码具有ABC1生物活性的多肽的那些多核苷酸。尤其优选的是编码介导逆向胆固醇转运的那些多肽的多核苷酸。编码具有改善的逆向胆固醇转运活性的多肽的多核苷酸也是优选的。
本发明的又一方面涉及到分离的编码来自丹尼尔患者的突变型ABC1多肽的多核苷酸。一项优选的实施方案中，多核苷酸编码SEQ IDNO8多肽，该多肽自患者TD1分离并如上所述。另一项优选的实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO7提出的核苷酸序列。SEQ ID NO7提出的核苷酸序列包含全部开放阅读框架，以及5′和3′侧翼序列。可译框架编码2261个氨基酸的多肽，在其它取代之间，该肽包含导致位置537的A至G取代的核苷酸取代(采用Lawn等人的编号，supra(1999))。
涉及到编码突变型ABC1多肽的多核苷酸的另一项优选的实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO10多肽，该多肽自丹尼尔病人TD2分离并也在上文介绍过。又一项优选的实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO9提出的核苷酸序列。SEQ ID NO9提出的核苷酸序列包含全部开放阅读框架，以及5′和3′侧翼序列。开放阅读框架编码2261个氨基酸多肽，在其它的取代之间，包含导致残基527的Arg至Tryp取代的多核苷酸取代(采用Lawn等人的编号，supra(1999))。
本发明的另一方面涉及到分离的包括ABC1非编码5′侧翼区和3′侧翼区多核苷酸。一项实施方案中，分离的多核苷酸包括ABC1非编码5′侧翼区。优选地，5′侧翼区包含，但是并非限制，ABC1启动子区。从而，在一项优选的实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO3显示的序列。如通过异源报道基因证实，实施例15讨论的，SEQ ID NO3提出的多核苷酸包含AB1基因的转录调控区。如图13所示，SEQ