定点突变的戊型肝炎病毒结构蛋白及其制备方法和应用的制作方法【技术领域】，具体涉及定点突变的戊型肝炎病毒结构蛋白及其制备方法和应用。[0002]戊型肝炎病毒(h印atitis E virus, HEV)是一种严重危害人类健康的肝炎病毒，它主要经粪-口途径传播(污染的水源)，引起的急性戊型肝炎(h印atitis E，HE)分布于世界许多国家，最常见于亚洲和非洲不发达国家。HEV在我国流行方式主要有暴发流行和散发两种。我国戊型肝炎大暴发规模最大的一次发生于1986-1988年的新疆，共发病119280例，死亡707人，其中414名为孕妇。散发病例主要在城市流行，我国人群HEV感染率约为17.2%，散发流行具有明显的春冬季高峰。HEV除了引起急性戊型肝炎外，最近报道若病人为器官移植术后或HIV携带者等免疫缺陷患者，亦可转为慢性戊型肝炎。在60岁以上的老人中戊型肝炎的发病率逐渐上升，表现出病情重，病程长，病死率高，并发症多，重度黄疸比例高的老年戊型肝炎特点。HEV感染在我国已经构成严重的公共卫生问题，研发高保护性的疫苗和高灵敏度特异性的诊断试剂尤为迫切。[0003]HEV是单股正链的RNA病毒，电镜下HEV是直径27~34nm球形颗粒，呈20面体立体对称，无包膜，病毒衣壳表面有突起。基因组全长大约7200个核苷酸，具有3个互相重叠的开放读码框架(open reading frame, 0RF)。其中0RF2编码660个氨基酸的衣壳蛋白，功能是完成病毒粒子的组装、与宿主细胞的吸附、刺激机体产生中和抗体，是目前疫苗研发的主要靶点。P0RF2有三个潜在的糖基化位点(Asn-137、Asn-310和Asn_562)，在真核细胞表达系统中表达时，Asn-137、Asn-310和Asn_562残基进行糖基化修饰。p0RF2可分为三个结构域，S domain (128 ~319aa)、M domain (320 ~455aa)和 P domain (456 ~606aa)。从p0RF2晶体衍射结构来看,P domain以二聚体的结构形式组成病毒衣壳表面的突起，Asn-562潜在的糖基化位点正好处于P domain突起顶部的中心位置，此位置是病毒粒子与细胞粘附和产生中和抗体的部位。如果Asn-562发生糖基化，那么形成的糖链对Pdomain 二聚体的形成、抗原性和免疫原性以及中和抗体的产生会带来什么样的影响，目前为止未见有报道。反之将Asn-562糖基化位点进行定点突变，Asn-562糖基化位点突变体的生物学功能还未见报道。[0004]由于HEV不能有效地进行细胞培养，故无法制备其减毒或灭活疫苗，目前国内外学者多采用基因工程技术在原核或真核表达系统中研发重组戊型肝炎疫苗。近年来，酵母表达系统以其高稳定、高表达、高分泌等特点得到广泛利用。酵母属于低等真核微生物。当前对酵母特性和遗传背景的研究较清楚:①基因重组易操作②易于在营养成份简单的培养基中高密度发酵培养，适于工业化生产③具有分泌型表达模式，正确的折叠和修饰④发酵液中杂蛋白少，产物易于纯化，无热原和其它病原体，且不含癌基因，表达产物的安全性高。目前全世界大规模生产和使用的乙型肝炎疫苗也是由酵母表达系统的产物制成。因此如何利用酵母表达系统生产高表达水平、低成本的基因工程疫苗对我国的戊型肝炎流行控制十分重要。[0005]HEV在体外不能大量细胞培养，组装成为有功能的病毒粒子衣壳蛋白的p0RF2是糖基化还是非糖基化形式，目前还不明确。如果Asn-562发生糖基化，那么形成的糖链对Pdomain 二聚体的形成、抗原性和免疫原性以及中和抗体的产生会带来什么样的影响，目前为止未见有报道。反之将Asn-562糖基化位点进行定点突变，Asn-562糖基化位点突变体的生物学功能还未见报道。
[0006]发明目的:为解决上述问题，本发明在酵母表达系统中表达含有Asn-562糖基化位点的0RF2pl79 (439-617aa)，并设计针对Asn-562糖基化位点的突变体，来研究糖基化P179与点突变的pl79在二聚体的形成、抗原性、免疫原性以及中和抗体的产生等方面的改变。以深入了解HEV结构蛋白中保护性中和表位的结构特征，因为只有深入了解HEV结构蛋白中保护性中和表位的结构特征，才能研发出高保护性的疫苗和高灵敏度特异性的诊断试剂。[0007]本发明的第一个目的是提供了一种戊型肝炎病毒结构蛋白0RF2的第439~617位氨基酸中第562位氨基酸的定点突变体。本发明第二个目的是提供一种重组质粒。本发明的第三个目的是提供了一种基因工程菌株。本发明的第四个目的是提供了一种戊型肝炎病毒结构蛋白的制备方法。[0008]技术方案:为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现:一种戊型肝炎病毒结构蛋白0RF2的第439~617位氨基酸中第562位氨基酸的定点突变体，分别为P179N562Q, pl79N562D, pl79N562P, pl79N562Y，所述氨基酸序列分别如 SEQ ID N0.2, SEQID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8 所述。
[0009]其中，上述pl79N562Q，pl79N562D, pl79N562P, pl79N562Y 的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7 所述。
[0010]一种重组质粒，包含上述的定点突变体的核苷酸序列。
[0011]其中，上述重组质粒分别为pPICZ aA/pl79N562Q，pPICZ a A/pl79N562D,pPICZaA/pl79N562P 和 pPICZ aA/pl79N562Y。
[0012]一种基因工程菌株，它包含有上述的重组质粒。
[0013]其中，上述基因工程菌株为巴斯德毕赤酵母菌株。
[0014]一种戊型肝炎病毒结构蛋白的制备方法，包括以下步骤:
[0015]I) PCR 扩增获得 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P、pl79N562Y 的目的
基因;
[0016]2)构建重组质粒 pPICZaA/pl79N562，pPICZa A/pl79N562Q，pPICZaA/P179N562D, pPICZaA/pl79N562P 和 pPICZaA/pl79N562Y ；
[0017]3)将重组质粒电转化至巴斯德毕赤酵母菌株获得重组工程菌；
[0018]4)将重组工程菌利用甲醇诱导表达重组蛋白并通过硫酸铵盐析法纯化获得目的蛋白。
[0019]上述制备方法制备的戊型肝炎病毒结构蛋白。
[0020]上述戊型肝炎病毒结构蛋白在制备戊型肝炎疫苗方面的应用。[0021]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明为我国戊型肝炎流行控制提供了一种戊型肝炎病毒结构蛋白。本发明提供的特异性戊型肝炎病毒的重组结构蛋白制备简便，降低了疫苗生产的成本，经实验证明本发明提供的戊型肝炎病毒的特异性重组结构蛋白的免疫血清具有中和戊型肝炎病毒的能力。



[0022]图1为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0023]其中图1A为 PCR扩增pl79N562及重组PCR扩增pl79N562Q，pl79N562D，pl79N562P和 P179N562Y 基因；
[0024]图1B为酵母菌落PCR扩增2000 μ g / mLZeocin的YPDS平板上生长的pl79N562及 pl79N562Q, pl79N562D, pl79N562P 和 pl79N562Y 基因；[0025]图 2 为 SDS-PAGE分析pl79N562 及pl79N562Q，pl79N562D，pl79N562P和 pl79N562Y重组蛋白72h诱导表达上清,其中M表示蛋白分子量标准,N表示样品未经100°C加热5min,H表示样品经过100°C加热5min ；
[0026]图 3 为 SDS-PAGE 分析 Western-blot 分析 tunicamycin (衣霉素)对 pl79N562及P179N562Q，pl79N562D, pl79N562P和pl79N562Y的干预结果，其中M表示蛋白分子量标准，1、3、5、7、9 为 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P、pl79N562Y 加 Λtunicamycin (50 μ g/ml).2、4、6、8、10 为 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P、pl79N562Y 未加入 tunicamycin ；
[0027]图 4 为 Western-blot 分析 pl79N562、pl79N562Q、pl79N562D、pl79N562P 和P179N562Y重组蛋白抗原的免疫反应性比较；
[0028]其中图4A、4B 和 4C 分别为 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D, pl79N562P 和P179N562Y重组蛋白抗原与中和性单克隆抗体5G5、HEV IgG阳性病人血清和线性单克隆抗体6F9反应，其中M表示蛋白分子量标准，1、3、5、7、9、11分别为pl79N562及P179N562Q, pl79N562D, pl79N562P, pl79N562Y 和 pPICZaA/SMD1168 未经 10(TC加热 5min，2、4、6、8、10、12 分别为 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D，pl79N562P，pl79N562Y和 pPICZaA/SMD1168 经 100°C加热 5min ；
[0029]图 5 为间接 ELISA 检测 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D, pl79N562P 和P179N562Y重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠后血清中抗HEV特异性IgG抗体水平，各免疫血清的稀释度均为1:104 ;
[0030]图6A 和图 6B 为体外一步法 RT-PCR 检测 pl79N562 及 pl79N562Q，pl79N562D,P179N562P和pl79N562Y重组蛋白免疫血清的中和能力；
[0031]图6A 中 1-8，9-16，17-24 分别为 pl79N562, pl79N562Q, pl79N562D 免疫血清从1:10到1:1280稀释度；
[0032]图6B 中 1-8，9-16 为 pl79N562P, pl79N562Y 免疫血清从 1:10 到 1:1280 稀释度，17为已知具有中和能力的血清1:10稀释度，18为免疫前小鼠血清1:10稀释度。

[0033]本发明所使用的DEPC水购于南京凯基生物；EcoR 1、Xba I酶购于美国Fermentas公司；高保真酶、dNTP购于美国Roche公司；Sac 1、T4DNA Ligase购于大连宝生物工程有限公司；pET_28a(+)/pl79重组质粒、DH5 α由本实验室保存；pPICZaA质粒、SMD1168菌株、Zeocin、山梨醇购买于美国Invitrogen公司；甲醇购买于国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵购于上海凌峰化学试剂有限公司；衣霉素购买于法国MP公司；酵母抽提物、胰蛋白胨购于英国COXOID公司；硫酸铵购买于上海凌峰化学试剂有限公司；HRP—羊抗小鼠IgG、HRP—羊抗人IgG购于美国KPL公司；弗氏完全佐剂购于美国Sigma公司；试验用BALB/c小鼠购买于扬州大学比较医学中心。
[0034]实施例1HEV病毒株结构蛋白0RF2第562位氨基酸保守性分析
[0035]利用生物信息学软件Lasergene对Genbank201株包含HEV结构蛋白0RF2562aa的氛基酸序列进行同源性比对，只有6株(GenBank accession numbers:AB189070,AB425831, AB593690, AB698071, AB740232 和 JQ026407)在 562aa 由 562DTT 代替了 562NTT。说明HEV病毒株结构蛋白0RF2562aa的潜在的糖基化基序N-X-T具有高度的保守性。
[0036]实施例2第562位氨基酸人工定点突变的实施方法
[0037]1、突变体的选择
[0038]表1根据氨基酸的分子量、侧链结构和类型将562aa突变为以下四类氨基酸
[0039]