一种用于生物样品灌注式培养的灌注盖的制作方法 [0002]现在通用的生物样品，例如是细胞和组织的培养方式包括两种:静态培养和灌注式培养。静态培养通常使用培养板、培养瓶或者培养皿。该方法需要人工定期更换培养液，其优点是适合小批量的培养，换液周期可随组织、细胞的不同而采取相应的策略，缺点是静态培养不能维持体系恒定，特别是生物样品的微系统培养，在整个过程中换液步骤增加了细胞污染的几率，并且会使培养液的PH值变化幅度较大，进而影响细胞的培养结果。 [0003]灌注式培养是指将生物样品接种于培养室内，培养体系为生物样品源源不断的提供培养液供其生长，相比于静态培养系统，灌注式系统由于培养液连续地流经生物样品的内部或周围，能够克服营养物质传递受限的缺点，并在一定程度上能够避免人工操作从而减少污染的几率，同时由于连续不断的为细胞提供新鲜的培养基，细胞生长的环境相对比较恒定。然而现有的灌注式生物反应器通常不能够满足同时进行高通量多样品的实验，而且现有的反应器不能完全避免人工操作所产生的污染和对生物样品的波动影响。 [0004]专利文献CN202688332U和专利文献CN103122348A均涉及一种细胞和组织培养生物反应器，其包括主体、培养室、进液管、出液管，由于进液管直接连接到培养室，保证液体可灌注到各个培养室里，而且每个培养室都设计有独立的排液管，以便于每个培养室的单独收样。 [0005]专利文献W02005/123950A1公开了一种用于细胞或组织培养的隔离的灌注生物反应器和储槽对的阵列，适用于高处理量化验，同时适合于制药开发中通常使用的机器人技术的类型，装置中包括允许再循环细胞培养基的流体通道连接。 [0006]专利文献CN103966095A公开了一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，通过输液管依次将反应室、储液罐和蠕动泵连接；反应室包括侧壁、底壁、截流装置、溢流插板、筛网架、静压槽、泄流槽、弓I流槽等构成的盒体和盖体。该文献中考虑反应器中液体进入和排除时流场的整体情况，通过溢流的方式来实现对细胞所施加的剪切力基本相同。 [0007]然而，上述文献中所涉及的装置构造复杂，无法与实验室内的标准设备如培养板配合使用，因而不能满足连续对不同种生物样品高通量培养要求，而且在人工操作过程中容易污染生物反应器，并对生物反应器内部环境带来的波动。
[0008]为克服现有技术中的缺陷，本实用新型提供了用于生物样品高通量灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置。



[0009]本实用新型的一个目的是解决了灌注培养装置在生物样品培养过程中培养条件波动较大，培养室内生物样品所接触营养物质不均一的问题。
[0010]本实用新型的还一个目的是实现了对高通量的生物样品培养及体外组织和/或器官功能重建，解决了灌注培养装置无法同时采用相同或不同培养环境对相同或不同种细胞或组织培养的问题。
[0011]本实用新型的另一个目的是提供了一种灌注培养装置减少灌注培养装置使用过程中人工步骤对培养液的污染和对生物样品的干扰。
[0012]因此，本实用新型的一方面提供了一种用于生物样品灌注式培养的灌注盖，包括盖板，盖板底面上设有凸起，至少一个所述盖板底面上的凸起设有进液通道和出液通道，且进液通道和出液通道之间设有伸向培养室的间隔挡板。
[0013]本实用新型的另一方面提供了用于生物样品灌注式培养的灌注培养装置，包括培养板和与培养板可分离的灌注盖，所述培养板上设置有至少一个用于容纳样品的培养室，所述灌注盖包括盖板，盖板的底面盖住培养板上的培养室，并设有伸向培养室的凸起，至少一个所述盖板底面上的凸起设置有进液通道和出液通道，且进液通道和出液通道之间设有伸向培养室的间隔挡板。
[0014]在本实用新型的一个实施方式中，所述的培养板上设置有2-96个培养室，优选为
6-96个培养室，更优选为6个、24个或96个培养室。在本实用新型的一个
[0015]在本实用新型的一个实施方式中，所述灌注盖的盖板上还设置有透气膜，所述的透气膜厚度小于盖板的厚度。所述的透气膜与盖板其它部分的制备材料可以相同也可以不同，优选的所述的透气膜与盖板其它部分一体成型，采用相同的材料制备而成。在本实用新型的一个实施方式中，所述的透气膜厚度为0.2-lmm，优选的为0.3-0.8mm，特别优选的为0.5_。所述的透气膜使培养室内气体能够充分交换空气，当对细胞或组织培养时，由于透气膜的厚度较其它盖板部分薄，培养室内生物样品代谢所产生的气体可以通过透气膜扩散至外部，上述结构能够使培养室内生物样品的培养环境保持稳定。所述的透气膜设置在设有进液通道和出液通道的凸起上，或者所述的透气膜设置在设有进液通道和出液通道的凸起旁。具体为，所述的透气膜设置在当灌注盖盖板盖住培养室时培养室对应的盖板位置上的非凸起部分。所述的透气膜的形状可以根据用途进行调整，例如可以为圆形、椭圆形、半圆形等。每一个设置有进液通道和出液通道的凸起对应在盖板上设置有1-4个透气膜，优选为1-2个。例如，当透气膜设置在凸起上时，每个凸起上的透气膜数目可以为1-4个，优选为1-2个。当透气膜设置在当灌注盖盖板盖住培养室时培养室对应的盖板位置上的非凸起部分，每一个设置有进液通道和出液通道的凸起对应的透气膜数目可以为1-4个，优选为1-2个。
[0016]在本实用新型的一个实施方式中，所述的凸起可以为适合的形状，例如是圆柱形、方柱形、锥形等，优选为圆柱形。在本实用新型的一个实施方式中，所述的凸起的体积不大于培养室的容积，优选的，所述的凸起能够塞住培养室。在本实用新型的一个优选的实施方式中，所述的凸起设有导角边缘，所述的导角边缘保证了凸起更加容易放入培养室内。
[0017]在本实用新型的一个实施方式中，所述的进液通道与出液通道可以等长，或者，所述的进液通道长于出液通道，或者，所述的进液通道短于出液通道，优选的，所述的进液通道长于出液通道，即进液通道伸向培养室的深度要深于出液通道。当本实用新型采用所述的进液通道长于出液通道的结构时，能够确保新鲜培养液体进入，与废液体排出深度差距，提供良好细胞灌注换液系统。进液通道和出液通道的直径范围为0.3-3_，最适的直径范围为 0.6-1.5mm,优选为 0.8mm。
[0018]在本实用新型的一个实施方式中，所述的间隔挡板将凸起上的进液通道和出液通道分隔在凸起上的两边，由于间隔挡板的存在，使从进液通道进入培养板培养室的培养液强制的进行流动，特别是使处于边缘的培养液也能够快速进行循环，实现培养装置内流场的均一，在液体流速均一的情况下，液体对于培养室底部的生物样品所施加的剪切力的大小也相同，从而使全部生物样品能够得到营养。对于现有的生物反应器来说，由于没有本实用新型所述的间隔挡板，导致营养液传递不均，容易造成细胞生长不均匀，在流速不均的情况下液体对细胞所施加的剪切力大小不同，流速快时剪切力过大而使细胞易受到损伤，流速过低时又不利于细胞增生。在本实用新型的一个具体实施方案中，当所述的凸起为圆柱型时，所述间隔挡板长度小于或等于凸起的横截面的直径。
[0019]在本实用新型的一个实施方式中，所述的凸起数目为2-96个，优选为6-96个，更优选为6个、24个或96个。在本实用新型的【具体实施方式】中，凸起数目与所述的培养室数目可以是相同，即每一个培养室都对应有一个凸起伸入其中，也可以，所述的凸起数目小于所述的培养室数目。
[0020]在本实用新型的一个实施方式中，所述灌注盖的盖板上的每一个凸起都设置有进液通道、出液通道和间隔挡板。在本实用新型的另一实施方式中，所述灌注盖的盖板上有2-16个凸起没有设置进液通道、出液通道和间隔挡板。未设有进液通道、出液通道和间隔挡板的凸起用来隔离培养板中的培养室。
[0021]在本实用新型的另一个优选的实施方式中，所述的灌注盖盖板的表面设有凸起的顶柱。所述的顶柱一方面避免在使用时与盖板上的其它部件由于接触，污染盖板；另一方面，当在进行灌注培养前或培养后用其它培养板盖盖住反应板以保存生物样品时，所述的顶柱防止原培养板盖接触到灌注盖从而将灌注盖粘连。在本实用新型的一个【具体实施方式】中所述的盖板的表面上设有2-8个顶柱，优选为2-4个顶柱，特别优选为4个顶柱。
[0022]在本实用新型的实施方式中，所述的灌注盖和反应板的材料可以相同也可以不同，例如是玻璃、金属、陶瓷、塑料或其它聚合物材料。优选的，所述的材料适宜为具有生物相容性、高弹性且通透性良好的聚合物材料，例如是有机硅聚合物。在本实用新型的优选方式中，聚合物材料可为聚二甲基硅氧烷，聚丙基甲基硅氧烷、聚三氟丙基甲基硅氧烷、聚苯基甲基硅氧烷中的一种或几种。
[0023]本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖和灌注培养装置可以用来进行生物样品的培养、及体外组织和/或器官功能重建、药物的筛选、药效测试、药物代谢检测、药物剂量测试和/或药物灵敏度测试。所述的生物样品可以为人、动物或植物的细胞、组织，例如是干细胞、胰岛细胞或组织、肝细胞或组织、脂肪细胞或组织等。所述的生物样品也可以为微生物，例如是细菌、真菌等。优选的，本实用新型所述的灌注盖和灌注培养装置可以用于胰岛组织的培养，进一步的可以用于糖尿病的药物进行筛选、药效测试、药物代谢检测、药物剂量测试、或药物灵敏度测试，其所使用的胰岛组织和实验方法可以参考专利 CN 103122348A。
[0024]本实用新型还提供了一种生物样品培养方法，包括:(I)将生物样品放置在培养板的培养室中，放置本实用新型所述的灌注盖，灌注盖的盖板盖住培养室，盖板上的凸起伸入相应培养室中，或者，将生物样品放置在本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注培养装置的培养室中，放置灌注盖，灌注盖盖板盖住培养室，盖板上的凸起伸入相应培养室中；(2)将进液管的一端连接至灌注板上的进液通道，另一端通过进液泵连接至储液瓶，将出液管的一端连接至灌注板上的出液通道，另一端连接至废液瓶；(3)开启进液泵，培养液通过进液管进入培养室，进行生物样品的培养，之后生物样品培养产生的代谢液通过出液管流出。
[0025]本实用新型所述的储液瓶和废液瓶可以为一个也可以为多个，即通过培养板的培养室中可以通过进液管泵送相同的营养液或培养液，也可以通过泵送不同的营养液或培养液，从而实现同一培养板上完成不同培养环境的培养。
[0026]本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置实现了对高通量的生物样品的培养及体外组织和/或器官功能重建，例如可以同时进行96组独立的生物实验，每一组实验可以为独立的实验环境，既可以进行相同实验也可以进行不同的实验，各组之间可以避免交叉污染。同时，本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置由于采用了本实用新型所述的结构还能够保证生物样品培养过程中培养条件保持不变，例如是与普通的生物反应器比较，其PH基本能够保持恒定，使培养室内生物样品所接触营养物质均一。




[0027]图1本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置(透气膜设置在凸起部分)结构示意图
[0028]图2本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置(透气膜设置在非凸起部分)结构示意图
[0029]图3本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖(透气膜设置在非凸起部分)局部结构俯视图
[0030]图4本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖(透气膜设置在凸起部分)局部结构俯视图
[0031]图5本实用新型所述的用于生物样品灌注式培养的灌注盖局部结构剖面图
[0032]其中:1-灌注盖，10-凸起，11-进液通道，12-出液通道，13-间隔挡板，14-透气膜，15-顶柱，16-盖板，2-培养板

【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本实用新型作进一步说明，实施例旨在对本实用新型进行举例描述，而非以任何形式构成对本实用新型的限制。
[0034]实施例1用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置
[0035]如附图1和附图4所示的一种用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置，灌注培养装置包括培养板2和灌注盖1，培养板2上设置有24个用于容纳样品的培养室，灌注盖I包括盖板16，灌注盖I的盖板16的表面设有凸起的顶柱15，盖板16的底面盖住培养板上的培养室，并设有伸向培养室的凸起10，凸起10的边缘为导角边缘，盖板的凸起10上设有进液通道11和出液通道12，且进液通道11和出液通道12之间设有伸向培养室的间隔挡板13，每个凸起上设有2个呈椭圆状的透气膜14，透气膜的厚度为0.5mm，进液通道11长于出液通道12。
[0036]实施例2用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置
[0037]如附图2和附图3所示的一种用于生物样品灌注式培养的灌注盖及灌注培养装置，灌注培养装置包括培养板2和灌注盖1，培养板2上设置有24个用于容纳样品的培养室，灌注盖I包括盖板16，灌注盖I的盖板16的表面设有4个凸起的顶柱15，盖板16的底面盖住培养板上的培养室，并设有伸向培养室的凸起10，盖板16的凸起10上设有进液通道11和出液通道12，且进液通道11和出液通道12之间设有伸向培养室的间隔挡板13，在盖板16上与培养板上每个培养室相对应的非凸起的盖板部份设有I个呈椭圆状的透气膜14，透气膜的厚度为0.5_，进液通道11长于出液通道12。
[0038]实施例3使用灌注式培养的灌注培养装置培养胰岛组织
[0039]使用一个24通道的注射泵，一个台式培养箱和实施例1所述的用于生物样品灌注式培养的灌注培养装置对胰岛组织进行培养，所述的胰岛组织可以按照本领域常规技术进行，例如可以参照专利CN103122348A获得。具体地，分取24个胰岛组织放在实施例1所述的灌注培养装置的培养室内，完全培养基通过24通道的注射泵连接的10毫升注射器以每个通道25微升每小时的流速提供给放在灌注培养装置培养室内的胰岛组织，并从出液通道内连接的出液导管排出代谢废液，连续灌注培养7天，整个培养过程在台式培养箱内完成，控制温度37度，湿度100%，没有控制二氧化碳，7天内24个培养室内的胰岛组织均保持良好的活性。
[0040]实施例4使用灌注生物样品培养装置培养3T3细胞实验
[0041 ] 使用实施例1所述的灌注培养装置培养3T3细胞(市售获得)，培养液为DMEM培养基，pH = 7.20?7.40，培养方法为:
[0042]将细胞放置在实施例1所述的灌注培养装置的培养室中，放置灌注盖，灌注盖盖板盖住培养室，盖板上的凸起伸入相应培养室中；将进液管的一端连接至灌注板上的进液通道，另一端通过进液泵连接至储液瓶，储液瓶中装有培养液；将出液管的一端连接至灌注板上的出液通道，另一端连接至废液瓶；开启进液泵，培养液通过进液管进入培养室，进行培养，之后培养产生的代谢液通过出液管流出，实现对细胞进行灌注培养。连续灌注培养3天，整个培养过程在台式培养箱内完成，控制温度37度，湿度100%，没有控制二氧化碳。
[0043]实施例5使用静态培养方法培养3T3细胞对照实验
[0044]取24孔培养板，将3T3细胞(市售获得)放入培养板的培养室中，放入培养液，培养液为DMEM培养基，pH = 7.20?7.40，采用常规的静态培养方法，连续培养3天，整个培养过程在台式培养箱内完成，控制温度37度，没有控制二氧化碳。
[0045]实施例6测试结果
[0046]对实施例4和5中培养3天后培养室内的pH环境进行测试，使用pH计分别测定进液管进入培养室的培养液的pH值和出液管排出废液的pH值。测试结果表明，对于实施例4中使用本实用新型所述的灌注生物样品培养设备进行培养，pH = 7.20?7.40的培养液从进液管进入后，经过细胞培养环境，排出后的废液仍保持PH = 7.20?7.40的恒定范围内，说明细胞培养室具有很好地维持稳定微环境的功能。而采用实施例5中所述的装置进行的培养，PH = 7.20?7.40的培养液从进液管进入后，经过细胞培养环境，排出后的废液PH明显降低，不能够保持恒定的范围，说明细胞培养室内环境已经发生变化，不利于细胞的连续培养。