反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯及其衍生物抗乙型肝炎病毒的用途制作方法

吕秋军, 郭绍明, 温利青, 陈媛媛, 张敏, 任建平

2004年1月14日

2002年7月8日

2002年7月8日

中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 中国人民解放军军事医学科学院放射医

A61K31/045GK1466943SQ0212367

反式 苯乙烯 羟基

1.一种用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物组合物，包括有效量的下式的反式-3，4’，5-三羟基二苯乙烯衍生物及药用赋形剂或载体 R1-R5、和R’1-R’7可相同或不同，为H、OH和甲氧基(OMe)、苯基或杂环条件是R2、R4和R’3不能同时为OH2.权利要求1所述化合物，其特征在于所说的反式-3，4’，5-三羟基二苯乙烯衍生物为下式结构的反式-3，4’，5-三羟基二苯乙烯3.下式的反式-3，4’，5-三羟基二苯乙烯衍生物在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途4.下式的反式-3，4’，5-三羟基二苯乙烯在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途

本发明涉及反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯及其衍生物在治疗乙型肝炎病毒感染的新用途和含反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯及其衍生物的药物组合物本发明经过广泛深入的研究，在植物提取物中筛选抗HBV的药物过程中出人意料地发现了反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯具有明显的抗HBV作用本发明基于上述发现得以完成本发明的第一个目的涉及式I的反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯在治疗HBV感染中的应用 式I本发明的第二个目的涉及的式II反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯衍生物在治疗HBV感染中的应用 式IIR1-R5、和R’1-R’7可相同或不同，分别为H、OH、甲氧基(OMe)、苯基和杂环条件是R2、R4和R’3不能同时为OH本发明再一个目的是含式I或式II化合物的药物组合物，该药物组合物具有抗HBV感染作用根据本发明，该药物组合物中可加入有各种药用赋形剂、添加剂及载体根据本发明，本发明的药物组合物可按本领域已知方法配成肠道或非肠道给药的制剂，如片剂、胶囊、粒剂、注射液等根据本发明，本发明的式I或式II化合物，可来自植物，如虎杖，也可通过化学合成方法得到式II也可通过对式I化合物进行化学修饰得到根据本发明，反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯可从虎杖提取得到，方法简述如下虎杖先用50％甲醇水溶液提取，过滤后滤液真空干燥，所得醇提液再用乙酸乙脂萃取，有机相真空干燥后上硅胶柱梯度洗脱，洗脱液为氯仿∶甲醇收集的组份进一步用HPLC处理，得到单体反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯表1反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯(化合物A)对L2.2.15细胞的毒性作用药名剂量(mM)吸光度细胞毒(％)TC50化合物A 1.000 0.19±0.0484.090.500 0.45±0.0525.00 0.670.250 0.51±0.0411.360.125 0.63±0.06-15.900.060 0.58±0.09-4.550.030 0.42±0.07-43.640.016 0.60±0.08-9.09空白对照0.12±0.00细胞对照0.56±0.32注“-”表示细胞生长良好，抑制率为负值表2化合物A对L2.2.15细胞分泌两抗原抑制作用组别 浓度HBsAg HBeAgmM 吸光度抑制率吸光度 抑制率(％) (％)化合物A 1.000 0.58±0.1663.31 0.26±0.04 87.140.500 0.54±0.0661.15 0.26±0.06 87.140.250 0.67±0.1461.15 0.52±0.11 68.570.125 1.15±0.0810.71 0.87±0.11 43.570.060 0.85±0.1637.50 1.13±0.12 25.000.030 0.91±0.2032.14 1.06±0.13 30.000.016 0.84±0.3538.39 1.26±0.06 15.71空白对照 0.15±0.05 0.08±0.01细胞对照 1.27±0.15 1.48±0.08表3化合物A的治疗指数药名 HBsAg TI HBeAg TITC50ID50TC50 ID50化合物A 0.670.154.470.67 0.24 2.793试验结论化合物A半数毒性浓度为0.67mM在最大无毒浓度(0.25mM)下对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为61.15％、68.57％；对HBsAg、HBeAg治疗指数分别为4.47和2.79表明该药在体外对HBsAg、HBeAg分泌有良好的抑制作用实施例4化合物A体内抗鸭乙肝病毒的作用1材料和方法1.1受试药物化合物名称反式3，4’，5-三羟基二苯乙烯配制浓度为1.2mg/ml配制方法称取化合物A 109mg，加DMSO 3ml溶解，再加水67ml1.2阳性药物药物名称拉咪呋定(3TC)生产单位英国葛兰素公司药品批号HK-420751.3仪器和试剂NC膜，购自Amersham公司DHBV质粒由本室技术人员提取缺口翻译药盒，购自Promega公司α-32p-dCTP，购自北京亚辉公司SephadexG-50，购自Pharmacia公司96孔杂交点样器美国Bio-Rad公司产品盖革氏计数器美国S.E.International公司产品1.4实验动物雄性1日龄广州麻鸭(花边鸭)，购自广州南海大沥江夏村孵化场实验时鸭体重约125±12克/只1.5 DHBV病毒检测及给药方法1日龄广州麻鸭(花边鸭)购回后于第二天采血，血清用斑点杂交的方法检测，第15天出结果，保留先天感染DHBV阳性鸭子实验，阴性鸭子除去给药组分化合物A 50mg/kg、25mg/kg和12.5mg/kg三个剂量组，均采用灌服，1天2次另设病毒对照(DHBV)，阳性药用拉咪呋定(3TC)灌服，给药10mg/kg/d，1天1次，10天一疗程，在第15天即用药前(d0)、用药第5天(d5)、第10天(d10)及停药后第3天(+d3)，自鸭胫静脉取血，分离血清，-70℃冻存待检1.6 DHBV-DNA检测方法取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的变化，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32p标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪上测定OD值(滤光片波长为490nm)，以反映血清中DHBV-DNA水平2试验结果结果见下表表1化合物A在鸭体内对DHBV-DNA的抑制作用剂量 鸭数 OD490值(x±s)药物名称(mg/Kg) (只) d0d5 d10 +d312.5 9 0.96±0.750.24±0.11*##0.07±0.03**## 0.34±0.18*##化合物A25.0 9 1.37±0.560.25±0.09**## 0.05±0.03**## 0.38±0.21**##50.0 9 1.39±0.500.16±0.06**## 0.08±0.04*##0.22±0.17**##3TC10.0 8 1.56±1.001.08±0.75## 0.22±0.15**## 0.57±0.24*##病毒对照 9 1.79±0.832.38±0.58 1.23±0.66 1.27±0.58注与给药前(d0)比较*P＜0.05 **P＜0.01与相同时间的对照组比较#P＜0.05##P＜0.013实验结论化合物A三个剂量组连续10天疗程对鸭乙型肝炎病毒有明显的抑制作用，抑制病毒效果优于3TC，且停药3天后反跳不明显